Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti

Sommario

Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l'orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.

Abstract

cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 ⁵ cavità / cm ^2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un'architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato 'portauova', SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l'adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l'identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell'anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l'allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.

Introduzione

Di corrente in saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti ^1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all'interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di que....

Protocollo

1. Microfabbricazione di 'Portauova'

1. Realizzazione del Master: microcavità Array
   1. Scaldare un wafer 3 '' di silicio fino a 200 ° C per evaporare l'eventuale presenza di umidità.
   2. Spin-coat un sottile strato di SU-8 fotosensibile. Regolare il volume di resina e filatura velocità a seconda del tipo e dello spessore photoresist desiderato. Questo spessore detterà la profondità dei 'portauova' (EC). Per uno strato spesso 30 micron e SU-8 2025, spin-coat a 2.800 giri al minuto.
   3. Pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a second....

Risultati

Le '' portauova (CE) sono un metodo di screening ad alto contenuto-romanzo che permette la visualizzazione di cellule orientate ed embrioni in un ambiente 3D. Inoltre, alcuni processi cellulari, che sono difficili da osservare nelle culture standard, 2D (flat), possono essere osservati da questo nuovo metodo. La figura 1a mostra una sintesi della procedura per la microfabbricazione CE (vedi anche la sezione 1 del protocollo sopra descritto ). Il metodo è semplice, veloce, efficiente e senza alcun requis.......

Discussione

stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i 'portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di 'portauova' alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del plasma pul.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ddH20 (ultrapuro)	Millipore-Utilizzare		sempre acqua fresca.
Parafilm (film plastico)	Bemis	PM-999	Far aderire il Parafilm al banco da laboratorio utilizzando alcune gocce d'acqua e garantire una perfetta planarità della superficie.
Foto-maschera	Selba	-	http://www.selba.ch
Wafer di silicio	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 fotoresist	MicroChem	serie 2000	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
è necessario lavorare in una cappa aspirante; per ulteriori informazioni, consultare la scheda tecnica del produttore.
Sviluppatore SU-8	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni
2-propanolo	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA
Disponibile da più aziende.
Sigmacote (reagente siliconizzante)	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR
>dannoso, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controlla la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.
Clorotrimetilsilano (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR
TMCS produce tossicità acuta per inalazione e per via cutanea, ed è altamente infiammabile (con ritorno di fiamma di accensione in grado di verificarsi a distanze considerevoli), di conseguenza dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione
Guanti in nitrile	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional. com/products/ppe/guanti-mani/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Disponibile da più aziende.
Vetrini coprioggetti #0	Vetro lavorato a maglia	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Molto fragile. Manipolare delicatamente.
Pinzetta dritta affilata	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
tubo da 50 ml	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Disponibile da diverse aziende.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN
La confezione contiene sia la base PDMS che l'agente indurente. Elastomeri simili sono disponibili da più aziende.
Vetrini per microscopio	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Disponibile da diverse aziende.
DMEM mezzo ad alto contenuto di glucosio	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Siero di vitello bovino	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA
0,25% Tripsina-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS è a 10x e dovrebbe essere diluito a 1x utilizzando ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Medium per atmosfere senza controllo
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=F1141-5MG& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Penicillina & Streptomicina	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM
Piastra di Petri P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Piastra di Petri P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Piastra di Petri P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldeide 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& regione=FR
Dannoso in particolare per gli occhi, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.
Triton 0,5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=93443-100ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=ricerca-a12379
sciogliere la polvere in 1,5 ml di metanolo
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	diluizione 1:200 in PBS 1x
coniglio policlonale anti-Giantin	Abcam	ab24586	diluizione 1:500 in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
coniglio anti-anillina	Per gentile concessione di M. Glotzer, pubblicato in Piekny, A. J. & Glotzer, M. L'anillina è una proteina dell'impalcatura che collega RhoA, actina e miosina durante la citochinesi. Biologia attuale 18, 30– 6 (2008).		Diluizione 1:500 in PBS 1x
Laboratorio di trasduzione	anti-fosfotirosina	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 capra anti-coniglio	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1.000 diluizione in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& regione=FR
1 mg/ml per 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=G2025& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Cellule HeLa	-	-	Le cellule di mammifero sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1
NIH3T3 Le cellule	ATCC-Mammalian		sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1
Lievito di fissione	-	-	Per dettagli sui ceppi, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1
C. elegans worms	-	-	Per i dettagli, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1
YES (Agar) + 5 Supplementi inclusi	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Cerca
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
SÌ (Media) + 5 Integratori inclusi	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Cerca
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Cerca
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
Filtro sterilizzato EMM (Media) - Solo per imaging	MP Biomedicals	4110-012	Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione. Filtro sterilizzare il terreno utilizzando un 0,22 µ filtro m invece della sterilizzazione in autoclave. Questo conferisce trasparenza al mezzo e riduce l'autofluorescenza.
Integratori (per EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Ricerca
( Aggiungere 225 mg/L nel terreno EMM prima della sterilizzazione in autoclave o del filtraggio)
Filtri sterili Stericup e Steritop Vaccum	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2