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Articolo metodologico

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti

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DOI:

10.3791/51880

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18 settembre 2016

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1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

In questo articolo

Sommario

Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l'orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.

Abstract

cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 5 cavità / cm 2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un'architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato 'portauova', SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l'adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l'identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell'anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l'allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.

Introduzione

Di corrente in saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti 1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all'interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di questi farmaci se non riescono quando applicata a modelli animali a causa della condizione coltura 2D artificiale nelle prime fasi di screening di farmaci. Inoltre, utilizzando questo approccio, organelli cellulari specifici non possono essere correttamente visualizzati, ad esempio l'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare, e in generale strutture che si stanno evolvendo nel piano perpendicolare al piano di osservazione. Alcuninuovi test 2D sono stati proposti al fine di superare gli inconvenienti suddetti e importanti informazioni sull'organizzazione citoscheletro sono stati osservati 2,3. Tuttavia, questi test ancora presenti una seria limitazione: celle mostrano un fenotipo molto diffuse a differenza di quanto si osserva in vivo, in cui le cellule presentano un'architettura 3D. Tali artefatti associati al metodo di coltura possono innescare caratteristiche non fisiologici, come fibre di stress potenziate 1,4,5.

Tridimensionali saggi di colture cellulari forniscono molteplici vantaggi rispetto ai 2D ambienti 6,7. Essi sono fisiologicamente più rilevanti, ed i risultati sono quindi significativi. Come esempio, cellule incorporati in idrogel mostrano strutture 3D-like ma le loro morfologie differiscono da una cella all'altra 8,9. Tuttavia, le loro morfologie differiscono da una cella all'altra, il che complica applicazioni di screening. Una strategia alternativa è quella di incorporare singolocellule in cavità microfabbricate 10,11. la posizione delle cellule, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule possono quindi diventare normalizzata. Oltre a fornire l'architettura 3D-come le cellule, microcavità permette anche per gli studi di screening ad alto contenuto 10,12-14; singole cellule possono essere ordinati in microarray e organelli cellulari e le loro evoluzioni possono essere osservati in parallelo. Questa regolarità fornisce buone statistiche con un basso numero di cellule e migliori risoluzioni temporali / spaziale. Composti utili sono facili da identificare in maniera affidabile.

In questo studio, dimostriamo la fabbricazione e l'applicazione di un nuovo sistema di celle singola cultura 3D come ad alto contenuto di screening applicazioni 10,12,13. Il dispositivo è costituito da una matrice di microcavità elastomerici (10 5 cavità / cm 2), coniati 'eggcups' (EC). Dimensioni e volume totale di CE in questo lavoro sono ottimizzati per il volume tipico delle singole cellule NIH3T3 e HeLadurante la divisione cellulare. Morfologia delle cavità cilindriche - - è selezionato per la forma delle cellule correttamente orientare per la visualizzazione dei processi attivi. Stampaggio replica viene utilizzato per una vasta gamma di modello CE su un (PDMS) strato sottile polidimetilsilossano aderito su un bicchiere coprivetrino 15,16. Le cellule vengono introdotti nella CE per centrifugazione. Riportiamo qui di osservazione e la normalizzazione degli organelli cellulari (stress fibers di actina, apparato del Golgi e nucleo) in 3D (CE) in confronto con le stesse celle 2D (piatta) superfici. Riportiamo anche l'osservazione dei processi dinamici attivi quali la chiusura dell'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare 17. Infine, mostriamo risultati di questa metodologia su altri sistemi con pareti rigide, come il lievito in erba, lievito di fissione e C. embrioni elegans che conferma l'applicabilità della nostra metodologia per una vasta gamma di sistemi modello.

Abbiamo poi presentiamo una p dettagliato ed esaustivoROTOCOLLO al fine di fabbricare e applicare le "Portauova" per microfabbricazione 3D. Il nostro approccio è semplice e non richiede una camera pulita. Prevediamo che questa nuova metodologia sarà particolarmente interessante per test di screening di farmaci e medicina personalizzata, in sostituzione di piastre di Petri. Infine, il dispositivo sarà utile per studiare le distribuzioni di cellule risposte a stimoli esterni, ad esempio nel cancro 18 o nella ricerca di base 19.

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Protocollo

1. Microfabbricazione di 'Portauova'

  1. Realizzazione del Master: microcavità Array
    1. Scaldare un wafer 3 '' di silicio fino a 200 ° C per evaporare l'eventuale presenza di umidità.
    2. Spin-coat un sottile strato di SU-8 fotosensibile. Regolare il volume di resina e filatura velocità a seconda del tipo e dello spessore photoresist desiderato. Questo spessore detterà la profondità dei 'portauova' (EC). Per uno strato spesso 30 micron e SU-8 2025, spin-coat a 2.800 giri al minuto.
    3. Pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli.
    4. Pre-cuocere il wafer a 95 ° C per 3 minuti (passaggio 2 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli.
    5. caricare ilwafer sul allineatore maschera per esposizione ai raggi UV. Posizionare la maschera fotolitografica su di esso. La maschera mostra un modello di caratteristiche circolari (dischi) di 20 micron di diametro. Garantire un perfetto contatto tra loro.
      NOTA: Diversi produttori offrono maschere di fotolitografia. La risoluzione spaziale determinerà il costo finale. maschere Acetato offrono una risoluzione accettabile (≈10 micron) a basso costo. maschere di cromo fornire una migliore risoluzione, ma sono più costosi. Adattare i diametri dei dischi (dalla maschera fotolitografica) al volume delle cellule. Dimensioni di dischi sulla maschera determinerà il diametro della cavità del dispositivo. I piccoli diametri porteranno ad un riempimento basso; troppo grande diametro non limiterà le cellule. Per le cellule HeLa e NIH3T3, diametro di 20 micron a 25 micron sono suggeriti.
    6. Controllare l'alimentazione della lampada UV prima esposizione e ottimizzare il tempo di esposizione. Irradiare (lunghezza d'onda = 365 nm) per 41,5 secondi (o il tempo di esposizione ottimale) a250 mJ / cm 2.
      NOTA: SU-8 2025 è un fotoresist negativo, il che significa che le regioni esposte a raggi UV saranno curate. In questo caso, le caratteristiche circolari erano nere e trasparente resto. lavoro fotosensibile positiva nel modo opposto: le regioni non esposte sono guariti. Selezionare fotoresist conseguenza, a seconda del design e foto-maschera.
      NOTA: proteggere gli occhi dai raggi UV con occhiali di sicurezza adeguate.
    7. Rimuovere delicatamente la maschera dallo strato fotosensibile.
    8. Post-bake il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Post-bake il wafer a 95 ° C per 3 minuti (passaggio 2 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a seconda del tipo di photoresist e spessore desiderato. Controllare la scheda tecnica produttore per i dettagli. Dopo post-cottura, raffreddare la cialda a temperatura ambiente in panchina per circa 1 min.
    9. Posizionare il wafer nello spin-verniciatore e rilasciare qualche mm di SU-8 sviluppatore per coprirel'intera area wafer. Sviluppare per 2 minuti e poi spin-coat a 1.000 rpm per 30 sec. Ripetere la procedura per tre volte.
    10. Risciacquare con 2-propanolo per assicurare la completa rimozione non sviluppata SU-8. Aspetto delle regioni bianche è un'indicazione di sviluppo incompleto. Se è così, ripetere la fase di sviluppo di un tempo supplementare.
    11. Hard-bake il wafer a 200 ° C per assicurare robustezza delle microstrutture fabbricati. Questo passaggio è facoltativo.
    12. Conservare il 3 'wafer' con microstrutture all'interno di un 94 millimetri x 15 mm di polistirene Petri.
      NOTA: Non vi è alcuna necessità di un trattamento di superficie, in particolare silanizzazione, per i passi successivi.
  2. Realizzazione della Polidimetilsilossano (PDMS) Replica: Colonne Array
    1. Mescolare in un rapporto 1:10 (w / w) il cross-linker e la pre-polimero per un totale di 30 g in un tubo da 50 ml.
      NOTA: Utilizzando un rapporto 1:10 (v / v) sta lavorando.
    2. Centrifugare la provetta a 1.800 xg per 5 min arimuovere le bolle d'aria.
    3. Eliminare delicatamente le PDMS sulla parte superiore delle microstrutture.
      NOTA: Se le bolle d'aria appaiono durante questa fase, degassare il campione utilizzando una pompa a vuoto per 15-20 min.
    4. Porre il campione in un forno a 65 ° C per 4 ore.
      NOTA: Il tempo di indurimento varia tra utenti e, insieme con il cross-linker: percentuale pre-polimero. Questa volta detterà la rigidità dei PDMS. Si raccomanda di curare più di 2 ore e di attenersi a un tempo di polimerizzazione fisso.
    5. Utilizzare un bisturi per tagliare delicatamente l'area di interesse (timbro) di circa 1 cm 2, che comprende circa 10 5 microcavità o 'portauova.
      NOTA: Tagliare prima i PDMS e poi, buccia via delicatamente. Controllare la qualità della replica PDMS con un microscopio ottico.
  3. Fabbricazione di '' portauova per stampaggio replica. Nel seguito, sono descritti due strategie alternative per la realizzazione di "portauova. Entrambi i protocolli sono similar e fornire risultati identici:
    1. strategia 1
      1. Attivare il timbro PDMS fabbricato da trattamento al plasma di ossigeno per 30 sec. Memorizzare temporaneamente i francobolli attivati ​​in un piatto chiuso Petri per impedire il deposito di polvere.
        NOTA: Regolare il tempo di esposizione in caso di utilizzo di altri gas per il plasma.
      2. Posizionare i PDMS attivate timbro a testa in su (il lato con le strutture) in una capsula di Petri accanto a un tappo di tubo da 15 ml. Riempire il tappo con 200 ml di Trimetilclorosilano (PTM). Chiudere la piastra di Petri e lasciare che il silanizzata francobollo per 7 min.
        NOTA: Alcune deformazione temporanea sul timbro e / o cambiamenti di colore (bianco) si può osservare. Il francobollo sarà recuperare la sua forma originale in breve tempo e le strutture non saranno interessati.
        NOTA: TMCS produce la tossicità per inalazione e per via cutanea acuta, ed è altamente infiammabile (con flashback di accensione in grado di verificarsi in tutta distanze considerevoli). Di conseguenza, dovrebbe essere usato in una cappa di distanza dalla sorgentes di accensione.
      3. Posizionare il timbro PDMS sulla spin-coater con le strutture a testa in su. Mettere una piccola goccia di pochi microlitri (circa 20 ml) di PDMS liquidi (1:10 w / w cross-linker: pre-polimero) sopra le strutture. Spin-coat a 1.500 rpm per 30 sec per depositare un sottile strato di PDMS sopra le strutture.
        NOTA: Se il timbro non si adatta il posto mandrino spin-coater il timbro sulla cima di un coperchio capsula di Petri con un piccolo foro al centro.
      4. Posizionare il timbro in forno a 65 ° C per 4 ore per curare il livello PDMS spin-rivestito depositato.
      5. Attiva il livello PDMS sottile posizionando il timbro PDMS a testa, insieme con un vetro coprioggetti # 0 di 25 mm, utilizzando pulitore plasma di ossigeno per 30 sec. Procedere rapidamente alla fase successiva.
        NOTA: coprioggetto con altri spessori, forme e dimensioni, può essere utilizzato come bene. Tuttavia, alcune strutture cellulari potrebbe essere difficile visualizzare a seconda dello spessore coprioggetto selezionato e obiettivoingrandimento e / o NA e / o la distanza di lavoro. Controllare il foglio di dati oggettivi.
      6. Mettere in contatto il timbro (il lato con il sottile strato di spin-patinata) con il coprioggetto di vetro. Premete delicatamente tutto intorno alla superficie del timbro con una pinzetta per rendere il 'legame'. Infine, mantenere una pressione costante sulla parte superiore del timbro per circa 10 sec.
      7. Dopo 30 minuti delicatamente 'buccia' il timbro fuori dal vetrino, al fine di 'liberare' 'portauova' (vedi Figura 1). Sciacquare abbondantemente con etanolo e asciugare. Se PDMS 'portauova' non sono ben rispettati sul vetrino di vetro (ad esempio spiccano durante la fase di 'staccandosi'), prendere in considerazione la regolazione delle impostazioni del pulitore plasma e riavviare al punto 1.3.1.5.
        NOTA: Questo passaggio è delicato. Prestare attenzione al fine di evitare la rottura del vetrino e / o distacco dello strato PDMS sottile.
      8. Incollare un piccolo pezzo (maniglia) di PDMS curato di 1 mm x 1mm x 3 mm di volume al bordo del vetrino con una piccola goccia di PDMS liquidi e curare le PDMS come prima. Ciò faciliterà la manipolazione del campione in seguito (vedi Figura 1). Questo passaggio è facoltativo.
    2. strategia 2
      1. Hydrophilize il PDMS fabbricati francobolli di trattamento al plasma di ossigeno per 30 sec. Memorizzare temporaneamente i francobolli attivati ​​in un piatto Petri chiusa per evitare la deposizione di polvere.
        NOTA: Regolare il tempo di esposizione in caso di utilizzo di altri gas per il plasma.
      2. Hydrophilize il coprioggetto di vetro del diametro # 0 ossigeno trattamento al plasma di 25 mm a 15 W per 30 sec. Procedere rapidamente alla fase successiva.
        NOTA: coprioggetto con altri spessori, forme e dimensioni, può essere utilizzato come bene. Tuttavia, le strutture cellulari sarà difficile visualizzare a seconda dello spessore coprioggetto selezionato e caratteristiche oggettive (vedi nota sopra).
      3. Spin-coat una piccola goccia di PDMS (1:10 w / w cross-linker: pre-polYmer) di pochi microlitri sul vetrino. Spin-coat a 1.500 rpm per 30 sec per uno spessore finale di circa 50 micron.
      4. Colla un piccolo pezzo (maniglia) di PDMS induriti 1 mm x 1 mm x 3 mm volume al bordo del vetrino con una piccola goccia di PDMS liquidi e curare le PDMS come prima. Ciò faciliterà la manipolazione del campione in seguito (vedi Figura 1). Questo passaggio è facoltativo.
      5. Memorizzare temporaneamente i coprioggetti PDMS-rivestiti su un panno pulito all'interno di una capsula di Petri per proteggere dal deposito di polvere.
      6. Mettere una goccia di reagente silanizzazione in cima ad ogni timbro e farlo evaporare per 1-2 min. Poi, asciugarle sotto flusso di N 2.
        NOTA: In questa fase, una deformazione temporanea del timbro può essere osservato durante l'evaporazione. Il francobollo sarà recuperare la sua forma originale dopo l'asciugatura con N 2 senza alcuna deformazione permanente delle microstrutture.
      7. Eliminare molto delicatamente il timbro silanizzata in cima allaPDMS-spin rivestite coprioggetto di vetro memorizzati nella scatola di Petri. Assicurarsi che entrambe le parti sono completamente parallelo durante il contatto. Evitare di premere o spostare il timbro dopo immissione sul vetrino PDMS rivestite.
      8. Porre la capsula di Petri con i campioni nel vuoto per 1-2 ore per rimuovere le bolle d'aria.
        Nota: Assicurarsi che i campioni siano completamente orizzontale per evitare lo spostamento timbro. Anche evitare vibrazioni potenzialmente causata dalla pompa a vuoto.
      9. Porre i campioni in forno a 65 ° C per 4 ore.
      10. Delicatamente, staccare il francobollo per rivelare 'portauova. Sciacquare abbondantemente con etanolo e asciugare.
        La pratica è necessaria a questo punto: NOTA. Prestare attenzione per evitare la rottura del vetrino e / o distacco dello strato PDMS sottile.

2. L'introduzione di cellule nel 'Eggcups'

Al fine di introdurre all'interno di cellule di mammifero "portauova ', PDMS superficie needs essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione della matrice extracellulare. Questo esempio utilizza fibronectina ma altre proteine ​​di interesse, come il collagene, potrebbe essere utilizzato.

  1. Hydrophilize il 'portauova' nel pulitore plasma di ossigeno per 30 sec.
    NOTA: Ottimizzare i parametri, se necessario.
  2. Preparare una soluzione in PBS 1x di 20 mg ml -1 fibronectina da fonti bovina.
  3. Sterilizzare il 'portauova' con UV per 5 min. Depositare una piccola goccia (circa 20-50 ml) di soluzione fibronectina per coprire l'intera area 'portauova' e incubare per 1 ora a RT. Proteggere il campione dalla essiccazione.
  4. Lavare delicatamente le 'portauova' con PBS 1x. Ripetere 3 volte.
    NOTA: Il campione è pronto per l'uso immediatamente o conservato a 4 ° C al buio per diverse settimane.
  5. Introdurre un pezzo di plastica su misura cilindrico di 63 mm di altezza, 26 mm di raggio esterno e 7 mm di dimensioni raggio interno in un tubo da 50 ml (vediFigura 2) 20
    ATTENZIONE: gli elementi Usa UV-sterilizzato o sterilizzare loro utilizzo precedente.
    NOTA: Questo pezzo può essere facilmente fabbricato in laboratorio. o da qualsiasi officina disponibili.
  6. Mettere 13 ml di mezzo di coltura cellulare all'interno del tubo (vedi Tabella 1). Il mezzo deve riempire almeno 2 cm sopra il pezzo cilindrico per assicurare immersione completa del campione.
    NOTA: Per i dettagli di specifici tipi cellulari e altri sistemi modello come il lievito o C. elegans embrioni, e il relativo supporto utilizzato, fare riferimento alla sezione 5 e Tabella 1. Il protocollo descritto è stato ottimizzato per HeLa, cellule NIH3T3, e altre linee cellulari (vedi tabella 1).
  7. Introdurre delicatamente i "portauova 'all'interno del tubo e parallela al lato superiore della parte in plastica. Utilizzare le pinzette taglienti per tenere il campione utilizzando la maniglia PDMS. Premere delicatamente il coprioggetto fino giace sopra il lato superiore della parte in plastica, until è completamente immerso (vedi figura 2).
    NOTA: Si consiglia di utilizzare le pinzette taglienti e dritto. Con pinzette curvi, la manipolazione del campione è difficile e può causare la rottura.
  8. cellule di coltura fino a 80-100% confluenza in un P60 capsula di Petri e alla loro raccolta da tripsinizzazione.
    NOTA: Le celle possono essere wild-type, trasfettate o trattati con qualsiasi farmaco di interesse.
    NOTA: Evitare la formazione di aggregati di cellule che eviterà singole cellule per entrare nel 'portauova. Per ottimizzare questo passaggio, pipetta su e giù con cura dopo tripsinizzazione.
  9. Risospendere le cellule in terreno di coltura 5 ml. Pipettare 200 microlitri di cellule sulla parte superiore dei 'portauova.
    NOTA: goccia cellule più centrato possibile sopra dei 'portauova' ma evitando il contatto fisico. Questo impedirà la rottura e / o danneggiamento del campione.
  10. Centrifugare a 1800 xg per 2 min.
    NOTA: Dopo la prima centrifugazione, il check-in un microfonoROSCOPE la percentuale di riempimento dei 'portauova.
  11. Dispensare ancora 200 ml di cellule sulla parte superiore dei 'Portauova' e centrifugare a 1.800 xg per 2 minuti. Ripetere per un totale di tre volte per ottimizzare la percentuale di riempimento.
    NOTA: Dopo l'ultima centrifugazione, verificare con un microscopio la percentuale di riempimento del 'portauova. Se necessario, ripetere le operazioni di riempimento + centrifugazione fino a raggiungere la percentuale di riempimento desiderato.
  12. Rimuovere il campione dalla provetta utilizzando le pinzette taglienti che fissano il manico PDMS. Assicurarsi di fare attenzione a non le cellule 'inquietanti' che si svolgono negli Portauova "(vedi figura 2).
  13. Trasferire il campione in una capsula di Petri con il mezzo. Risciacquare per rimuovere l'eccesso di cellule che non sono negli portauova 'pipettando su e giù tre volte dolcemente accanto a ciascun lato (totale 4 lati) della matrice microstruttura.
    NOTA: Pipetting troppo forte può rilasciarealcune cellule dalla 'portauova'.
  14. Sostituire il mezzo con terreno fresco per rimuovere le cellule nonattached.
    NOTA: In questa fase un farmaco di interesse può essere aggiunto.
  15. Fissare le cellule o prepararli per time-lapse imaging.See passo 4.1.

3. L'osservazione di dinamiche cellulari attivi in ​​'Eggcups': Cytokinetic Anello di chiusura

NOTA: Questo esempio utilizza cellule HeLa che sono trasfettate con MYH10-GFP e Lifeact-mCherry per miosina e actina, rispettivamente chiave molecole attive coinvolte nella chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Il dispositivo è preparato con microcavità di 25 micron di diametro. Per loro osservazione, un microscopio invertito epifluorescenza è stato usato, equipaggiato con un obiettivo 60X olio (1,40 NA, DIC, Plan Apo) e GFP (miosina) e TxRed (actina) filtri. In alternativa un microscopio confocale eretta stato usato, dotato di 25X o obiettivo acqua L 63X HCX IR APO (0,95 NA). Per questo example, si consiglia vivamente di sincronizzare celle utilizzando il blocco doppio timidina, blocco mitotico o un metodo shake-off mitotico 21-24.
NOTA: Lo spessore dei PDMS utilizzati per il 'portauova' permette l'uso di una varietà di obiettivi sia in microscopi invertiti e retto posizionate.

  1. Place 'Portauova' in un supporto del microscopio e riempirlo con 1 ml di FCS L-15 medio di osservazione di 10%. Per evitare l'evaporazione, posizionare un coperchio di vetro sulla parte superiore del contenitore o applicare un sottile strato di olio minerale in cima alla medium.Select dell'obiettivo olio 60X.
    NOTA: L-15 è sufficiente per non CO 2 atmosfere. Si noti inoltre che alcuni composti di DMEM sono auto-fluorescente. Quando si utilizza questo mezzo, si raccomanda di photobleach i composti fluorescenti illuminandolo con una lampada ad alta intensità per 1-2 ore.
    NOTA: Evitare l'uso di coperchi di plastica quando si lavora con l'imaging DIC.
  2. Posizionare il supporto con 'Portauova' e ossermedia vazione al microscopio. Primo accuratamente con luce brightfield fino agli portauova ', e le cellule sono nello stesso piano di osservazione.
  3. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare i filtri TxRed e GFP per actina e miosina; regolare il tempo di esposizione per ciascun canale. Un tasso di acquisizione tipico è 5 secondi per entrambi i canali.
    NOTA: Il tempo di esposizione può essere regolata a seconda della configurazione utilizzata, tintura o di altri organelli cellulari di interesse.
  4. Selezionare la regione di interesse e cercare un anello cytokinetic utilizzando la GFP o il canale TxRed. Mettere a fuoco con precisione.
    NOTA: L'anello è più nitida in miosina e più facile da riconoscere.
  5. Eseguire l'acquisizione automatica in entrambi i canali fino a quando l'anello è completamente chiuso.
    NOTA: si può osservare Alcuni photobleaching. Regolare i parametri del microscopio per ridurlo.

4. L'osservazione di cellulari fissi Organelli nelle 'Eggcups'

Questa fase può essere eseguita prima o dopo il punto # 3. Le cellule possono essere fissate direttamente dopo la fase di centrifugazione e colorate per l'organello di interesse o dopo l'osservazione al microscopio. Questo esempio mostra la colorazione delle fibre apparato di Golgi, nucleo e actina su fibroblasti NIH3T3 in 'portauova.

  1. Fissazione delle cellule negli Eggcups '
    1. Preparare 3% paraformaldeide (PFA) e calda a 37 ° C. Rimuovere il campione '' portauova dal tubo da 50 ml (o il titolare del microscopio) e posizionarlo all'interno di una capsula di Petri P35. Risciacquare una volta con PBS 1x.
      NOTA: Protocolli per la preparazione di 3% paraformaldeide sono ampiamente disponibili altrove.
      ATTENZIONE: Utilizzare guanti di nitrile e occhiali protettivi durante la preparazione del PFA.
    2. Rimuovere completamente il PBS e rilasciare 1 ml di 3% PFA e incubare per 17 min. Rimuovere la PFA e lavare due volte con 1 ml di PBS 1X. cellule permeabilize usando 1 ml di 0,5% Triton per 3 min e lavare due volte con PBS 1x per 5 min.
  2. La colorazione delle cellule in '' Portauova
    1. Incubare le cellule per Golgi apparecchi colorazione con l'anticorpo primario policlonale di coniglio anti-Giantin in una diluizione 1: 500 in PBS. Mettere una goccia di 100 ml di soluzione di anticorpi su un foglio di pellicola di plastica e incubare le cellule all'interno dei 'portauova' a testa in giù per 45 min.
      NOTA: Proteggere il campione con un coperchio per evitare l'essiccazione.
    2. Rilasciare attentamente le 'Eggcups' e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
    3. Preparare un cocktail in PBS con l'anticorpo secondario Cy3 capra anti-coniglio (1: 1.000) e con falloidina Alexa Fluor 488 (1: 200) per la colorazione stress fibers di actina.
    4. Incubare le cellule con una goccia di 100 ml di soluzione di anticorpi su un foglio di pellicola di plastica e incubare cellule all'interno dell 'portauova' a testa in giù per 45 min.
    5. Uscita con attenzione il 'eggcup 'e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
    6. Incubare le cellule per la colorazione nucleo mettendo una goccia di 100 ml di 1 mg ml -1 DAPI in PBS su un foglio pellicola di plastica e incubare cellule all'interno dell 'portauova' a testa in giù per 45 min. Questa fase può essere eseguita con il punto 4.2.3.
    7. Rilasciare attentamente le 'portauova' e metterli in un P35 Petri. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno, con PBS 1x.
    8. cellule Mount utilizzando una Glicerina 15 ml: PBS (1: 1 v / v) su un vetrino da microscopio di serie e sigillare il campione con smalto per evitare l'essiccamento.
      NOTA: A seconda dello spessore '' portauova, il montaggio può essere difficile. Si consiglia di conservare il campione in un P35 Petri in PBS, protetto da essiccazione.
  3. Microscopio osservazione
    NOTA: In questo esempio viene utilizzato un microscopio confocale verticale, dotata di rilevatori PMT e ibridi. Un 25X o 63 Obiettivo acqua L X HCX IR APO (0,95 NA) è stata selezionata per fornire un ampio campo del campione e mostra applicabilità del dispositivo per applicazioni ad alta contenuto screening.
    1. Selezionare l'obiettivo 25X o 63X acqua.
      NOTA: diversi obiettivi possono essere utilizzati a seconda dell'applicazione e del segnale. Ma si raccomanda l'utilizzo di elevati obiettivi apertura numerica.
    2. Mettere il campione fissato con i "portauova 'e mettere a fuoco con cura usando la luce campo chiaro (contrasto di fase o DIC) fino agli Portauova' e le cellule sono nel piano di osservazione.
    3. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare i filtri GFP, Cy3 e DAPI per actina, Golgi e di osservazione nucleo, rispettivamente; regolare il tempo di esposizione per tutti i canali.
      NOTA: Il tempo di esposizione può essere regolata a seconda della configurazione.
    4. Selezionare e mettere a fuoco la regione di interesse; avviare l'acquisizione delle immagini (vedi figura 3).
tle "> 5. Adattamento per l'osservazione di cellule di lievito e C. elegans Embryo

  1. Le cellule di lievito di fissione e in erba
    NOTA: Questo esempio utilizza cellule di lievito di fissione, che sono contrassegnati con RLC1-mCherry e CHD-GFP rispettivamente miosina e actina,. Le cellule di lievito in erba non sono fluorescente qui. Per l'osservazione fissione lievito è stato utilizzato un disco rotante confocale microscopio invertito. Un obiettivo olio 100X HCX PL APO CS (1,4 NA) è stato utilizzato per tutte le acquisizioni. In alternativa, le cellule sono state anche osservate con un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di aria contrasto di fase 20X LCPlanFl (0,4 NA). In questo esempio, il protocollo è identica per entrambi i tipi di cellule.
    1. Preparare la superficie 'portauova' come descritto sopra. Per la fissione e cellule di lievito in erba, preparare cavità di 5 micron di diametro (vedi tabella 1). In questo caso, la superficie non deve essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione.
      NOTA: Il CA di riempimenton essere ottimizzato utilizzando 'portauova' coniche. Questa forma cattura e conserva le cellule evitando rilasciando durante la fase di risciacquo dopo centrifugazione. Riempimento percentuale ottimale a circa 80%. Questi '' portauova coniche possono essere fabbricati mediante profonda Reactive Ion Etching 13.
    2. Cellule di lievito cultura in terreni di coltura corretto (vedere Tabella 1) fino a raggiungere una densità ottica (OD) nell'intervallo di 0,2 e 0,8. Sonicare la cultura di cellule di lievito per rimuovere aggregati.
    3. Inserire cellule di lievito in 'portauova' per centrifugazione. Per centrifugazione, 4 ml di cellule in coltura in OD venga aggiunta sul tubo con 'portauova. Dopo la prima centrifugazione, scuotere delicatamente il tubo per risospendere le cellule che non sono negli portauova ', mentre le cellule nel' portauova 'non sono disturbati. Senza aprire di nuovo il tubo, centrifuga e ripetere questo passaggio per due volte. Questo assicura la deposizionedi cellule della cultura nelle microcavità vuoti e aumenterà la percentuale di riempimento.
      NOTA: Quando si lavora con il lievito, si raccomanda di preriscaldare la centrifuga alla temperatura di lavoro durante gli esperimenti
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e ha continuato fino a 12 ore più tardi. In questo caso, conservare il campione alla temperatura di lavoro e coprire per evitare l'evaporazione.
    4. Place 'portauova' in un supporto del microscopio e riempire il supporto con filtro sterilizzato media per l'imaging. Ora lavare le cellule con lo stesso supporto finché le cellule di lievito galleggianti sono rimossi efficientemente. Fare attenzione a non disturbare le cellule in 'portauova' durante il processo di risciacquo.
    5. Selezionare l'obiettivo di olio 100X e mettere a fuoco con attenzione. Aprire il software e regolare i parametri. Per lievito di fissione, selezionare la GFP filtri e TxRed per actina e miosina e regolare il tempo di esposizione per entrambi i canali. Un tasso di acquisizione tipico è 3 sec.
      NOTA: a secondail fluoroforo, il tipo di tagging e il set-up, il tempo di esposizione varia per altri sistemi.
  2. C. elegans Embrione
    NOTA: Questo esempio utilizza C. elegans embrioni 25-30 micron di larghezza e 50-55 micron lungo. Embrioni sono state coltivate come indicato in 25. Un semplice protocollo visiva di come manipolare C. elegans può essere trovato in 26. L'osservazione è stata effettuata utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di aria 40X 0,55 NA.
    1. Preparare la superficie 'portauova' come sopra descritta e 25 micron di diametro (vedi Tabella 1). In questo caso, la superficie non deve essere funzionalizzati con proteine ​​di adesione.
    2. Culture del C. embrioni elegans in terreni di coltura corretto (vedi tabella 1).
    3. Inserire embrioni in "Portauova" per centrifugazione come descritto in precedenza (vedi sezione 2,6-2,12) utilizzando acqua ultrapura come mezzo di coltura.
      NOTA: Gli embrioni sono stati 'comportando' normalmente in acqua ultrapura per tutta la durata dell'esperimento. In alternativa, utilizzare un buffer fisiologico M9 per esperimenti a lungo termine.
    4. Lavare il campione come sopra descritto (vedi paragrafo 2.14). Posizionare i 'portauova' in un supporto microscopio. Selezionare l'obiettivo di aria 40X e mettere a fuoco con attenzione. Aprire il software e regolare i parametri. Selezionare un tasso di acquisizione di 3 sec.

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Risultati

Le '' portauova (CE) sono un metodo di screening ad alto contenuto-romanzo che permette la visualizzazione di cellule orientate ed embrioni in un ambiente 3D. Inoltre, alcuni processi cellulari, che sono difficili da osservare nelle culture standard, 2D (flat), possono essere osservati da questo nuovo metodo. La figura 1a mostra una sintesi della procedura per la microfabbricazione CE (vedi anche la sezione 1 del protocollo sopra descritto ). Il metodo è semplice, veloce, efficiente e senza alcun requis...

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Discussione

stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i 'portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di 'portauova' alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del plasma pul...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo L. Brino (impianto di screening Content IGBMC alta, Illkirch, Francia) per averci fornito l'anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. per C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. per il lievito (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman per le cellule HeLa fluorescenti (MPI-CBG, Dresda), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) per le cellule di lievito di fissione; A. Hoël e ​​F. Evenou aiuto sperimentale, C. Rick (IBMC, Strasburgo, Francia) per assistenza tecnica, e JC Jeannot (Femto-st, Francia) per un aiuto nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del CNRS, l'Università di Strasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale e la ci-FRC di Strasburgo.

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Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ddH20 (ultrapuro)Millipore-Utilizzaresempre acqua fresca.
Parafilm (film plastico)BemisPM-999Far aderire il Parafilm al banco da laboratorio utilizzando alcune gocce d'acqua e garantire una perfetta planarità della superficie.
Foto-mascheraSelba-http://www.selba.ch
Wafer di silicioSiltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 fotoresistMicroChemserie 2000http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
è necessario lavorare in una cappa aspirante; per ulteriori informazioni, consultare la scheda tecnica del produttore.
Sviluppatore SU-8MicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni
2-propanoloSigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA
Disponibile da più aziende.
Sigmacote (reagente siliconizzante)Sigma-AldrichSL2-25MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR 
>dannoso, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controlla la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.
Clorotrimetilsilano (TMCS)Sigma-Aldrich386529-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR  
TMCS produce tossicità acuta per inalazione e per via cutanea, ed è altamente infiammabile (con ritorno di fiamma di accensione in grado di verificarsi a distanze considerevoli), di conseguenza dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione
Guanti in nitrileKleenguard57372http://www.kcprofessional. com/products/ppe/guanti-mani/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Disponibile da più aziende.
Vetrini coprioggetti #0Vetro lavorato a magliaKN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Molto fragile. Manipolare delicatamente.
Pinzetta dritta affilataSPI0WSSS-XDhttp://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
tubo da 50 mlBD Falcon352070http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Disponibile da diverse aziende.
PDMSDow CorningSylgard 184 kithttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN 
La confezione contiene sia la base PDMS che l'agente indurente. Elastomeri simili sono disponibili da più aziende.
Vetrini per microscopioDutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Disponibile da diverse aziende.
DMEM mezzo ad alto contenuto di glucosioFisher Scientific41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Siero di vitello bovinoSigma-AldrichC8056-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA
0,25% Tripsina-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS 1xFisher Scientific14200-067http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS è a 10x e dovrebbe essere diluito a 1x utilizzando ddH2O
L-15 mediumFisher Scientific21083-027http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Medium per atmosfere senza controllo
Fibronectina Sigma-AldrichF1141-5MGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=F1141-5MG& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Penicillina & StreptomicinaFisher Scientific15140-122http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM
Piastra di Petri P35Greiner627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Piastra di Petri P60Greiner628163http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Piastra di Petri P94Greiner633179http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldeide 3 %Sigma-AldrichP6148-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& regione=FR 
Dannoso in particolare per gli occhi, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.
Triton 0,5 %Sigma-Aldrich93443-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=93443-100ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488InVitrogenA12379http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=ricerca-a12379 
sciogliere la polvere in 1,5 ml di metanolo
Alexa Fluor 647InVitrogenA21245diluizione 1:200 in PBS 1x
coniglio policlonale anti-GiantinAbcamab24586diluizione 1:500 in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
coniglio anti-anillinaPer gentile concessione di M. Glotzer, pubblicato in Piekny, A. J. & Glotzer, M. L'anillina è una proteina dell'impalcatura che collega RhoA, actina e miosina durante la citochinesi. Biologia attuale 18, 30– 6 (2008).Diluizione 1:500 in PBS 1x
Laboratorio di trasduzioneanti-fosfotirosina610000http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 capra anti-coniglio Jackson Immunoresearch111-166-047http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1.000 diluizione in PBS 1x
DAPISigma-AldrichD8417 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& regione=FR 
1 mg/ml per 1 min
GlycerolSigma-AldrichG2025http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=G2025& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Olio mineraleSigma-AldrichM8410-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Cellule HeLa--Le cellule di mammifero sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1
NIH3T3 Le celluleATCC-Mammaliansono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1
Lievito di fissione --Per dettagli sui ceppi, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1
C. elegans worms--Per i dettagli, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1
YES (Agar) + 5 Supplementi inclusiMP Biomedicals4101-732http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Cerca 
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
SÌ (Media) + 5 Integratori inclusiMP Biomedicals4101-522http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Cerca 
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
EMM (Media)MP Biomedicals4110-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Cerca 
Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione
Filtro sterilizzato EMM (Media) - Solo per imagingMP Biomedicals4110-012Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione. Filtro sterilizzare il terreno utilizzando un 0,22 µ filtro m invece della sterilizzazione in autoclave. Questo conferisce trasparenza al mezzo e riduce l'autofluorescenza.
Integratori (per EMM)MP Biomedicals4104-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Ricerca
 ( Aggiungere 225 mg/L nel terreno EMM prima della sterilizzazione in autoclave o del filtraggio)
Filtri sterili Stericup e Steritop VaccumMillipore-http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2
<<CO<

Riferimenti

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548(2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019(2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

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