l'arricchimento del gDNA per il sequenziamento NGS è uno strumento facile e potente per lo studio delle mutazioni costituzionali. In questo articolo, presentiamo la procedura per analizzare semplicemente la sequenza completa di 11 geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA.
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Articolo metodologico
gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso diffuso di Next Generation Sequencing ha aperto nuove strade per la ricerca sul cancro e la diagnosi. NGS porterà enormi quantità di nuovi dati sul cancro, e soprattutto la genetica del cancro. Le conoscenze attuali e future scoperte renderà necessario studiare un gran numero di geni che potrebbero essere coinvolti in una predisposizione genetica al cancro. A questo proposito, abbiamo sviluppato un progetto Nextera per studiare 11 geni completi coinvolti nella riparazione del DNA danni. Questo protocollo è stato sviluppato per studiare in modo sicuro 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, e TP53) dal promotore a 3'-UTR in 24 pazienti contemporaneamente. Questo protocollo, basato sulla tecnologia trasposasi e gDNA arricchimento, dà un grande vantaggio in termini di tempo per la diagnosi genetica grazie a campione multiplexing. Questo protocollo può essere utilizzato in modo sicuro con gDNA sangue.
Introduzione
Nel 2010, quasi 1,5 milioni di persone (essenzialmente donne) hanno sviluppato il cancro al seno in tutto il mondo. Si stima che dal 5 al 10% di questi casi erano ereditarie. Quasi 20 anni fa, BRCA1 e BRCA2 sono stati identificati come coinvolti in seno ereditario e tumori ovarici 1. Da circa 15 anni fa, BRCA1 e BRCA2 regioni codificanti sono stati sequenziati per determinare la predisposizione genetica al cancro della mammella e dell'ovaio. Alterazioni in BRCA1 e BRCA2 sono rilevati in 10 al 20% delle famiglie selezionate 2 suggeriscono che l'analisi di queste regioni non è sufficien....
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Protocollo
1. Valutazione di gDNA (DNA genomico) Rendimento
- Quantificare appena estratto gDNA prima della preparazione della biblioteca. Utilizzare il metodo di valutazione di rendimento fluorimetrico quantificare gDNA intatto (evitare l'uso di uno spettrofotometro per la valutazione del rendimento gDNA). Misurare la (260/280 nm) Rapporto e assicurarsi che sia compresa tra 1,8 e 2 NOTA: 50 ng di gDNA sono necessari per l'esperimento.
2 gDNA Arricchimento: Giorno 1, Mattina
- Prima di iniziare
- Dal kit di arricchimento del DNA (vedi Tabella dei materiali / attrezzature), disgelo tampone di DNA (TD) e soluzion....
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Risultati
Risultati campione di QC
La capacità di questo metodo per determinare sequenze di geni bersaglio si basa sulla qualità del gDNA (Figura 2A) e la qualità del passo tagmentation. Se il tagmentation non è sufficiente (Figura 2B, pannello superiore), il sequenziamento non sarà soddisfacente. Come accennato in precedenza, dopo la purificazione tagmentation, il gDNA opportuno tagmented in frammenti da 150 bp a 1.000 bp con la maggior parte dei frammenti di circa 300 .......
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Discussione
L'uso diffuso di dispositivi e tecnologie NGS ha fornito nuove opportunità nello studio dei tumori e malattie genetiche. Oltre al sequenziamento dell'intero genoma o RNA sequenziamento, l'analisi di una grande quantità di sequenze di gDNA selezionati in numerosi pazienti contemporaneamente offre grandi prospettive nella diagnosi. Qui, abbiamo sviluppato uno specifico progetto (disponibile su richiesta), utilizzando la tecnologia Nextera per studiare 11 geni completi in 24 pazienti contemporaneamente con un d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Ligue contre le Cancer de Côte d'Or e il Centre Georges-François Leclerc per il loro sostegno finanziario. Ringraziamo Philip Bastable per l'editing del manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Dispositivo di sequenziamento/media produttività |
| Nextera Kit di arricchimento | Illumina | FC-123-1208 | Tecnologia basata sulla trasposasi |
| Cartuccia a 300 cicli | Illumina | 15033624 | |
| Perline di ampure | Beckman Coulter | A63881 | Perle di purificazione magnetiche |
| Supporto magnetico | Alpaqua | A32782 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Life Technologies | 4306737 | |
| Piastre MIDI a 96 pozzetti | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | Questa guarnizione è necessaria solo per l'amplificazione della PCR. Altri sigilli standard possono essere utilizzati durante l'esperimento |
| MiSeq | Illumina | Fornito con il dispositivo di sequenziamento software Experiment Manager Indirizzo Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Strumento del sito web del produttore |
Riferimenti
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
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Ristampe e permessi
