Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

Summary

L'uso del campionamento con citospazzola per raccogliere linfociti e monociti dall'endocervice è una tecnica minimamente invasiva che fornisce campioni per l'analisi dell'immunità del tratto genitale femminile. In questo protocollo, descriviamo la raccolta di campioni di citospazzola e l'isolamento delle cellule immunitarie per i saggi di citometria a flusso.

Abstract

Nonostante l'importanza per la salute pubblica dei patogeni della mucosa (incluso l'HIV), si sa relativamente poco sull'immunità della mucosa, in particolare nel tratto genitale femminile (FGT). Poiché la trasmissione eterosessuale rappresenta ora il meccanismo dominante di trasmissione dell'HIV e data la continua diffusione di infezioni sessualmente trasmissibili (IST), è fondamentale comprendere l'interazione tra ospite e agente patogeno nella mucosa genitale. Le sostanziali lacune nelle conoscenze sull'immunità alla FGT sono in parte dovute alla difficoltà di raccogliere ed elaborare con successo i campioni di mucosa. Al fine di facilitare gli studi con campioni di dimensioni sufficienti, le tecniche di raccolta devono essere minimamente invasive ed efficienti. A tal fine, è stato ottimizzato un protocollo per la raccolta di campioni di citobrush cervicale e il successivo isolamento di cellule mononucleate cervicali (CMC). Utilizzando l'immunofenotipizzazione basata sulla citometria a flusso ex vivo, è possibile quantificare in modo accurato e affidabile le frequenze e i fenotipi della popolazione di linfociti/monociti CMC. Questa tecnica può essere abbinata alla raccolta del lavaggio cervico-vaginale (CVL), che contiene mediatori immunitari solubili tra cui citochine, chemochine e antiproteasi, che possono essere utilizzati per determinare l'ambiente anti- o pro-infiammatorio nella vagina.

Introduction

La maggior parte delle nuove infezioni da HIV in tutto il mondo nascono attraverso la trasmissione eterosessuale, con le donne rappresentano il 47% delle nuove infezioni nel 2011 (UNAIDS ^1). Comprendere il tratto genitale femminile (FGT), uno dei principali portali di ingresso per l'HIV e di altri agenti patogeni a trasmissione sessuale, è di grande importanza nel cammino per trovare strategie efficaci per prevenire l'infezione. Risposte immunitarie alla mucosa genitale sono chiaramente unico e differiscono da quelli misurati nel sangue periferico ^2. Tuttavia, l'attuale conoscenza delle dinamiche immunodeficienza al FGT è limitata al....

Protocol

Dichiarazione etica: la ricerca etica consigli di amministrazione di entrambe dell'Università di Manitoba e Kenyatta Nazionale Ospedale / Università di Nairobi ha approvato questo studio e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio.

1. Preparazione dei Media e CMC Collection Tubes

1. Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8.1 mM Na ₂ HPO _4, 1.47 mM KH ₂ PO _4). Autoclave per la sterilità. Questo può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi.
2. Pre-aliquota 5 ml di soluzione in 50 ml di tubo falcon (un....

Results

Flusso multiparametrica citometria è un potente strumento per analizzare i fenotipi e le funzioni dei sottoinsiemi di cellule in tessuti precedentemente non caratterizzati. Analisi dei campioni CMC può dare informazioni sia su linfociti e monociti popolazioni con le strategie di gating adeguate.

Un rappresentante CMC strategia gating, rispetto ad un profilo PBMC abbinato, è mostrato in Figura 2. L'FSC-A piuttosto FSC-H trama consente l'esclusione di doppietti cellulari, che .......

Discussion

Date le grandi lacune nella conoscenza per quanto riguarda l'immunità al tratto genitale femminile (FGT), analisi fenotipica di CMC in grado di fornire una vasta gamma di intuizioni più popolazioni linfocitarie alla cervice. Accoppiato con l'analisi proteomica e le misurazioni della carica virale di lavanda cervicale, l'immunità alle infezioni sessualmente trasmissibili (IST) s ed altri agenti patogeni può essere sezionato in varie popolazioni.

Considerazioni tecniche - C.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μ filtro cellulare m per provetta Falcon da 50 ml	BD	352360	elaborazione CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	lavorazione CMC
Siero fetale bovino	vita	16000044	lavorazione CMC
Fungizone	Life technology	15290-018	lavorazione CMC
Penicillina/streptomicina	Sigma	P4333-20ml	elaborazione CMC
Provetta Falcon da 50 ml	Fisher	14-959-49A	Pipetta
di trasferimento monouso per banca del sangue	Fisher	13-711-6M	Processazione CMC
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	Campionamento CMC
Raschietto cervicale monouso	medical	2183	Campionamento CMC Tubo
Falcon da 15 ml	Fisher	14-959-70c	Processamento CVL
Provetta da 1,5 ml Eppendorf	Fisher	05-402-18	Conservazione
CVL Kit di colorazione cellulare fissabile LIVE/DEAD	Invitrogen	Vari	reagenti per citometria a flusso
Tampone di fissazione (4% PFA)	BD	554655	Perimetria a flusso regeant
IgG di topo	Sigma	I8765	Regeant per citometria a flusso