Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.
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Articolo metodologico
Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie degenerative della retina, ad esempio, retinite pigmentosa, con conseguente danno conto fotorecettore per la maggior parte della perdita della vista nel mondo industriale. I modelli animali sono di fondamentale importanza per lo studio di tali malattie. A questo proposito la tossina specifica-fotorecettore N -methyl- N -nitrosourea (MNU) è stato ampiamente utilizzato nei roditori per indurre farmacologicamente degenerazione retinica. In precedenza, abbiamo stabilito un modello di degenerazione retinica MNU indotta in zebrafish, un altro sistema modello popolare in ricerca visiva.
Una differenza affascinante per i mammiferi è la neurogenesi persistente nell'adulto retina zebrafish e la loro rigenerazione dopo un danno. Per quantificare questa osservazione abbiamo impiegato le misure di acuità visiva in zebrafish adulto. In tal modo, il riflesso optocinetica è stata utilizzata per seguire i cambiamenti funzionali nei pesci non anestetizzato. Questo è stato integrato con istologia e immunoistochimica staining per apoptosi (TUNEL) e la proliferazione (PCNA) di correlare i cambiamenti morfologici in via di sviluppo.
In sintesi, l'apoptosi dei fotorecettori avviene tre giorni dopo il trattamento MNU, che è seguita da una marcata riduzione delle cellule nello strato nucleare esterno (ONL). Successivamente, la proliferazione delle cellule nello strato nucleare interno (INL) e ONL si osserva. Qui, ci rivelano che non solo istologica completa, ma anche una rigenerazione funzionale si verifica nel corso di un corso di 30 giorni. Ora si illustrano i metodi per quantificare e seguire zebrafish de- retina e rigenerazione utilizzando MNU in un video formato.
Introduzione
Vision è il senso più essenziale per l'essere umano e la sua perdita di valore ha un elevato impatto socio-economico. Nel mondo sviluppato, le malattie degenerative della retina sono la principale causa di perdita della vista e cecità tra gli adulti più anziani 1. La causa della maggior parte delle malattie degenerative della retina è solo parzialmente compreso e soluzioni terapeutiche per recuperare la vista perduta sono molto limitate. La retinite pigmentosa è un tipico esempio di una malattia degenerativa della retina con perdita dei fotorecettori primaria 2-3. N -methyl- N -nitrosourea (MNU) induce degenerazione retinic....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti hanno aderito alla Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research dell'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO).
1. Gli animali
- Mantenere il wild-type zebrafish (Danio rerio) del ceppo AB (Oregon) di età compresa tra 6-12 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un 14/10 luce hr / ciclo scuro 15.
- Seguire le linee guida per la cura degli animali delle istituzioni coinvolte per gli esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte dell'Ufficio cantonale di veterinaria.
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Risultati
Acuità visiva:
Il set-up sperimentale [frequenza spaziale: 0.042 circoli / grado (c / d); contrasto: 100%; velocità di deriva: 20 gradi / secondo (d / src); indietro luminanza luce: 152 cd / m 2] di questo studio ha permesso la valutazione okr di zebrafish adulto. La durata media della misurazione VA era circa 5-10 minuti per ogni zebrafish, che tollerato bene la procedura. L'acuità visiva prima dell'esposizione MNU era 0,577 ± 0,014 cicli / grado (c / d). Figura 1
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Discussione
In precedenza, il nostro gruppo ha trasferito il modello MNU di degenerazione dei fotorecettori dai roditori nel sistema zebrafish 9. Gli eventi successivi sono stati descritti e seguiti fino a 30 giorni. In questo periodo di tempo completa degenerazione morfologica della retina e la rigenerazione avvenuti dopo il trattamento iniziale. In primo luogo, istologia rivela una conta di cellule asta ridotto da 3 giorni su con un minimo al giorno 8 Corrispondentemente, TUNEL colorazione identifica l'apoptosi dei.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Monika Kilchenmann, Federica Bisignani e Agathe Duda per la loro eccellente assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | A6283 | |
| Ammoniaca | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 294993 | 0,80% |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI supporto | di montaggio Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 45260 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | ED | |
| Etile 3-amminobenzoato sale metanosolfonato | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | E10521 | Tricaina |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 3989 | |
| Capra anti-coniglio Alexa 594 | Life Technologies, Zugo, Svizzera | A11012 | |
| Siero normale di capra | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Acido cloridrico | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 320331 | 0,20% |
| Kit di rilevamento della morte cellulare in situ | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Svizzera | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Soluzione di emalum di Mayer | Merck, Darmstadt, Germania | 109249 | |
| Metilnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | N4766 | OptoMotry Cerebrale |
| TossicoMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a.Paraformaldeide | ||
| (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P6148 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P5368 | |
| Proteinasi K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Coniglio anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Vetrini Superfrost Plus | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germania | 10149870 | |
| Tris soluzione salina tamponata (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) ceppo | Università di Friburgo, Dipartimento di Biologia | n.a.Impianto | ittico proprio |
Riferimenti
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, a....
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Ristampe e permessi
