Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Sommario

L'analisi dell'espressione proteica nelle giovani valvole embrionali di topo è stata ostacolata dal limitato tessuto disponibile. Questo manoscritto fornisce un protocollo per la preparazione di proteine da regioni valvolari embrionali di topo in via di sviluppo per l'analisi del western blot.

Abstract

L'analisi Western blot è una tecnica comunemente impiegata per rilevare e quantificare i livelli proteici. Tuttavia, per piccoli campioni di tessuto, questo metodo di analisi potrebbe non essere sufficientemente sensibile per rilevare una proteina di interesse. Per superare queste difficoltà, abbiamo esaminato i protocolli per ottenere proteine da valvole cardiache umane adulte e abbiamo modificato questi protocolli per le controparti di topo embrionali precoci in via di sviluppo. In breve, le regioni della valvola aortica embrionale di topo, compresa la valvola aortica e la parete aortica circostante, vengono raccolte nel volume minimo possibile di un tampone di lisi a base di Tris con inibitori della proteasi. Se necessario in base alla strategia di allevamento, gli embrioni vengono genotipizzati prima di raggruppare quattro regioni della valvola aortica embrionale per l'omogeneizzazione. Dopo l'omogeneizzazione, viene utilizzato un tampone campione basato su SDS per denaturare il campione per l'esecuzione su un gel SDS-PAGE e la successiva analisi western blot. Sebbene la concentrazione proteica rimanga troppo bassa per essere quantificata utilizzando saggi spettrofotometrici di quantificazione delle proteine e avere un campione rimanente per le analisi successive, questa tecnica può essere utilizzata per rilevare e semi-quantificare con successo le proteine fosforilate tramite Western blot da campioni raggruppati di quattro regioni embrionali della valvola aortica di topo al giorno 13,5, ciascuna delle quali produce circa 1 μg di proteine. Questa tecnica sarà utile per studiare l'attivazione della via di segnalazione cellulare e i livelli di espressione proteica durante lo sviluppo precoce della valvola embrionale di topo.

Introduzione

Essere in grado di identificare e quantificare i livelli di espressione della proteina è una tecnica standard per ragioni sanitarie e di esperimenti basati su celle. Tuttavia, nonostante una lunga interesse per lo sviluppo della valvola cardiaca embrionale precoce, valutando l'espressione della proteina in questo tessuto specifico durante lo sviluppo è attualmente limitato a immunoistochimica sia il pulcino e il mouse ^1,2. Parte della difficoltà di quantificare l'espressione della proteina nelle valvole di sviluppo della maggior parte degli organismi modello (ad esempio, ceci e topo) è la piccola dimensione delle valvole, che limita la quantità di proteine ​​che si possono ottenere. Così, per analisi quantitative, i ricercatori in genere si basano su l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione per la successiva PCR quantitativa o analisi microarray ^2-5. Tuttavia, i livelli di espressione di RNA e proteine ​​non sono del tutto correlativo ^6, in modo da concentrarsi su espressione di RNA non è in grado di fornire una rigorosa conto dei numerosi cambiamenti che si verificano in una determinata segnalazionepercorso in diversi momenti durante l'evoluzione. Sulla base di questo limite nella metodologia attualmente disponibili, l'obiettivo di questa procedura è stato quello di sviluppare un protocollo per ottenere in modo affidabile una quantità sufficiente di proteine ​​dalle embrionali di topo in via di sviluppo le regioni valvola cardiaca per l'analisi quantitativa dei cambiamenti che si verificano in diverse vie di segnalazione che sono importanti in la maturazione di questo tessuto.

Le valvole embrionali sono già comunemente dissezionati da topi per l'isolamento di RNA e la successiva analisi di espressione genica ^2-5. Tuttavia, questi studi si sono limitati a usare l'espressione genica come out lettura di segnalare l'attivazione della via, che non consente il rilevamento di rilevare modificazioni post-traduzionali di proteine ​​che possono influenzare la segnalazione a valle. Utilizzando le tecniche di isolamento dell'RNA come punto di partenza, abbiamo iniziato con dissezione delle regioni di interesse. Perché il nostro interesse è stato rilevando proteine ​​fosforilate che erano indicativi di pat segnalazioneattività HWAY durante un periodo specifico di sviluppo della valvola aortica (E13.5-14.5), abbiamo effettuato tutte le dissezioni in tampone Tris senza fosfati e raccolto le valvole in un tampone di lisi a base di Tris con inibitori della proteasi e fosfatasi. Nel nostro caso specifico, solo le regioni valvola aortica sono stati raccolti, ma la regione valvola polmonare possono essere facilmente ottenuti allo stesso tempo. Le regioni valvole erano poi omogeneizzato e combinato con un tampone che viene attualmente utilizzato per studiare l'espressione della proteina in valvole cardiache adulte ^7. Utilizzando piccoli volumi di campione (ad esempio, 2 microlitri) e la messa in comune delle regioni valvole da embrioni con lo stesso genotipo, siamo stati in grado di rilevare le proteine ​​fosforilate e nonphosphorylated al giorno embrionale 13.5 ^8. Poiché le regioni di valvole possono essere congelati e conservati in tampone di lisi, gli embrioni possono essere genotipizzati se necessario prima di pooling.

Questa tecnica amplia il set di strumenti che sono disponibili per la valutazione signalin cellulareg percorsi durante lo sviluppo e fornisce un complimento quantitativo di immunoistochimica, specificatamente per le valvole cardiache in via di sviluppo. Questa tecnica dovrebbe essere di beneficio non solo ai cardiologi di sviluppo, ma anche a tutti i biologi dello sviluppo che lavorano con gli embrioni in fase iniziale sono interessati nelle regioni che contengono tessuti limitata.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del North Carolina a Chapel Hill.

1 Excise della valvola aortica

1. Utilizzando una tecnica di eutanasia approvato per la fase embrionale di interesse, eutanasia di un mouse incinta con cuccioli al giorno embrionale desiderata (E) dello sviluppo.
2. Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare l'addome della femmina incinta. Sollevare la pelle ei muscoli del basso addome alto e lontano dagli organi interni, e sezionare cavità inferiore addominale open femminile per consentire l'accesso al corno uterino.
3. Per recuperare il corno uterino, tenere il collo dell'utero con una pinza e caudale con attenzione tagliare le pinze. Sollevare il corno uterino, tagliando qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno in luogo, e completare la rimozione tagliando la giunzione del corno uterino con l'ovidotto.
4. Posizionare il corno uterino sezionato in una capsula di Petri contenente cold 0.1 M tampone Tris (pH 7.6) e sciacquare come necessario. Quindi, tagliare il corno uterino longitudinalmente per esporre i sacchi embrionali aperto.
5. Per esporre l'embrione, tagliare aprire un sacco embrionale allo svincolo della placenta e l'embrione e tagliare i vasi ombelicali per liberare l'embrione. Posizionare l'embrione sezionato in un secondo piatto di Petri con freddo 0.1 M tampone Tris. Ritorna il primo piatto di Petri con i rimanenti embrioni undissected per ghiaccio fino pronto per la prossima embrione.
6. Per migliorare l'accesso della parete toracica all'interno dell'embrione, decapitare il embrione. Se genotipizzazione è necessario, rimuovere e salvare un pezzo di tessuto in più in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio.
7. Inserire l'embrione sul dorso, e tagliare la parete toracica verticalmente lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, e orizzontalmente sopra il diaframma di visualizzare il cuore. Quindi, aprire la parete toracica per esporre il cuore.
8. Utilizzando pinze per tenere alto lungo i grossi vasi, sollevare il cuore con pinze e tagliare i vasi di seguito. Iln, tagliare sopra la pinza per liberare il cuore. Se i vasi polmonari rimangono non tagliata, i polmoni possono essere rimossi con il cuore e devono essere rimosse prima di continuare.
9. Tagliare e rimuovere l'arteria polmonare di sopra del livello della valvola; nelle fasi embrionali qui descritte, l'arteria polmonare è leggermente opaca, che aiuta nella sua discriminazione dalla regione valvola. Tagliare appena sotto la valvola polmonare, evitando il miocardio ventricolare trabeculated e raccogliere come descritto al punto 1.10, se questa regione è anche di interesse. Qui e nella fase successiva, utilizzare un'azione capillare per disegnare tampone Tris eccesso di distanza dalla regione di interesse prima di raccogliere in tampone di lisi.
10. Rimuovere accuratamente il distale dell'aorta alla valvola aortica, appena sopra il livello della valvola; come l'arteria polmonare, l'aorta rimane leggermente opaca in queste fasi embrionali, aiutando nella sua rimozione. Tagliare appena sotto la valvola aortica, ancora una volta evitando il miocardio ventricolare trabeculated, e trasferire ilvalvola con pinze ad una provetta Eppendorf con tampone di lisi 2 microlitri (descritto nella tabella materiali) contenente inibitori di proteasi e fosfatasi sul ghiaccio.
11. Ripetere i passaggi 1,6-1,10 finché le valvole sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni valvola in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, tutte le valvole possono essere raccolte in un unico tubo Eppendorf.
12. Se genotipizzazione deve essere eseguito per determinare quali valvole di riunire insieme, immediatamente mettere i campioni in tampone di lisi a -80 ° C fino a nuovo uso. I campioni possono quindi essere raggruppati dopo genotipizzazione (punto 2.1.1).

Estrazione 2 Proteine

1. Scongelare tessuti raccolti su ghiaccio e centrifugare a 13.100 xg per 1 min per raccogliere i tessuti in un tampone di lisi sul fondo della provetta.
   1. Se sono stati genotipizzati embrioni, utilizzare una pipetta per raccogliere delicatamente e piscina di buffer di lisi contenente le regioni valvole da embrioni con genotipi simili. Per garantire un forte be, riunendo 3-4 regioni valvole da embrioni E13.5 per si raccomanda campione.
   2. Se tutti gli embrioni erano dello stesso genotipo e tutte le regioni valvole sono stati raccolti insieme nel passo 1.10, lisare l'intero campione, come descritto al punto 2.2.
2. Controllare il volume del campione composito risultante e aggiungere tampone di lisi per un volume totale di 40 microlitri; poi, interrompere e omogeneizzare campioni utilizzando perline in acciaio inox 5 mm provette Eppendorf. Azionare il Lyser per 2-4 min a 50 Hz, come da istruzioni del produttore. Tubi Spin brevemente, (~ 13.100 xg per 1 minuto), e il trasferimento dei campioni ai nuovi tubi, lasciando dietro di sé i detriti insolubile.
3. Preparare e campioni separati per SDS-PAGE e trasferimento per la successiva analisi Western Blot, a seguito di un protocollo come Eslami et al ^9. Blotting per una proteina di controllo di carico è essenziale per la quantificazione delle proteine.

Risultati

Utilizzando questa tecnica di preparazione, siamo stati in grado di rilevare fosforilata Smad ^1,5,8 (pSmad) nelle singole regioni della valvola aortica da E13.5 embrioni. Come mostrato nella Figura 1A, la proteina isolata da anche una sola regione valvola è sufficiente per rilevare una banda pSmad debole. Intensità del segnale aumenta in proporzione al numero di regioni valvole che vengono pool. È importante sottolineare che il / rapporto β-actina pSmad rimane pressoché costante tra le divers...

Discussione

La capacità di quantificare i livelli di proteine ​​nei primi mesi del topo embrionale e pulcino regioni della valvola cardiaca fornisce un ulteriore strumento per la comprensione degli eventi di segnalazione cellulari critici per lo sviluppo della valvola. Il nostro protocollo qui descritto non differisce molto da procedure di isolamento delle proteine ​​standard. Tuttavia, modificando alcuni passaggi chiave, abbiamo ottenuto con successo proteine ​​fosforilate da estremamente campioni di piccole dimensioni. Per ottene...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
		gravido a tempo	Da sezionare allo stadio embrionale di interesse
Microscopio stereoscopico	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Microforbici	Strumenti per la scienza fine	15003-08
Pinze fini, #5	Strumenti per la scienza fine	11251-30
Ago da dissezione titolari	Ted Pella Inc.	13560
Aghi da dissezione Ted	Pella Inc.	13561-10
Micropipetta, 20 &; l, con punte
Tampone			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Aggiungere 1 compressa a 10 ml di tampone di lisi
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Perline in acciaio inossidabile	Qiagen	69989
Microcentrifuga