Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Sommario

Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.

Abstract

Le interazioni proteina-proteina sono fondamentali per la maggior parte, se non tutti, i processi fisiologici, e la comprensione della natura di tali interazioni è un passo centrale nella ricerca biologica. La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è una tecnica di rilevamento sensibile per lo studio senza marcatura delle interazioni bio-molecolari in tempo reale. In un tipico esperimento SPR, un componente (di solito una proteina, chiamata "ligando") viene immobilizzato sulla superficie di un chip del sensore, mentre l'altro (l'"analita") è libero in soluzione e viene iniettato sulla superficie. L'associazione e la dissociazione dell'analita dal ligando sono misurate e tracciate in tempo reale su un grafico chiamato sensogramma, da cui derivano i dati di pre-equilibrio e di equilibrio. Essendo privo di marcature, consumando basse quantità di materiale e fornendo dati cinetici pre-equilibrio, spesso rende l'SPR il metodo preferito quando si studiano le dinamiche delle interazioni proteiche. Tuttavia, bisogna tenere presente che, a causa dell'elevata sensibilità del metodo, i dati ottenuti devono essere analizzati attentamente e supportati da altri metodi biochimici.

SPR è particolarmente adatto per lo studio delle proteine di membrana poiché consuma piccole quantità di materiale purificato ed è compatibile con lipidi e detergenti. Questo protocollo descrive un esperimento SPR che caratterizza le proprietà cinetiche dell'interazione tra una proteina di membrana (un trasportatore ABC) e una proteina solubile (la proteina legante il substrato affine del trasportatore).

Introduzione

Interazioni proteina-proteina (PPI); la formazione e la dissociazione di complessi proteici, sono eventi chiave in molti processi biologici (ad esempio, la replicazione, la trascrizione, traduzione, di segnalazione, di comunicazione cellula-cellula). Studi semi-quantitativa di PPI sono spesso eseguiti con pull-down o esperimenti di immuno-precipitazione. Tuttavia, queste tecniche (e simili) sono limitati nella gamma di affinità che può essere misurata (basso e maggiore affinità micromolare) per le fasi di lavaggio che sono inerenti a tali tecniche. Tali tecniche "end-point" non in grado di identificare le interazioni affinità transitori o bassi che sono spesso di grandi conseguenze biologiche. Inoltre, la risoluzione temporale di tali approcci è estremamente limitato, solitamente ordini di grandezza più lento rispetto ai tassi di reazione. SPR supera queste carenze per la sua sensibilità e risoluzione temporale superiore ^{a 1,2.} SPR è un metodo privo di etichette, e come taleinterazione molecolare può essere misurata (purché le variazioni di massa possono essere rilevati). Oltre a PPI, è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare la proteina-ligando, proteina-farmaco (o piccola molecola), proteina-DNA, e le interazioni proteina-RNA ^3-5. I risultati sono registrati e tracciati in tempo reale, che consente una rapida modifica delle condizioni sperimentali e il disegno sperimentale flessibile.

Il principio fisico dietro strumenti basati SPR è l'utilizzo di un sistema ottico che misura un cambiamento dell'indice di rifrazione sulla superficie del sensore sulla massa cambia ^2. Uno dei partner interagenti (ligando di seguito) è immobilizzato su un chip matrice polimerica e la seconda molecola (in seguito analita) è fluita sulla superficie. Analita legame al ligando altera la massa sulla superficie del chip. Questo cambiamento massa è direttamente proporzionale alla variazioni dell'indice di rifrazione della superficie. I risultati sono riportati in tempo reale epresentate come unità di risposta (RU) in funzione del tempo. Tale trama è definita una Sensogramma (es, Figura 1). Poiché SPR segue il decorso completa dell'interazione, pre-equilibrio costanti di velocità cinetica derivano, oltre all'equilibrio affinità. Come descritto di seguito, il comportamento pre-equilibrio di un dato sistema contiene molte informazioni, e fornisce una prospettiva molto diverso equilibrio da solo. Una volta che il sistema è calibrato, esperimenti sono molto veloci e richiedono solo piccole quantità di materiale proteico (microgrammi di nanogrammi importi). Raccolta delle informazioni complete cinetica di un dato sistema può essere realizzato in giorni. L'elevata sensibilità della SPR offre misurazioni che non sono possibili con qualsiasi altra tecnica ^6. Tuttavia, questa elevata sensibilità è una 'spada a doppio taglio' dal momento che può essere una fonte importante per i dati falsi positivi. Qualsiasi fattore che influenza l'indice di riflessione viene registrata e tracciata sul Sensogramma. Come tale, apcontrolli propriate devono essere utilizzati per eliminare i falsi positivi, e il sostegno di strategie complementari è altamente consigliato.

La figura 1 illustra la progressione di un esperimento SPR tramite un chip sensore NTA-rivestito. Il Sensogramma nel riquadro A mostra l'iniezione degli ioni nichel sulla matrice NTA (dati unsubtracted), e visualizza i dati BD pannelli dopo aver sottratto il segnale derivato dalla cella controllo negativo. Frecce rosse e blu mostrano inizio dell'iniezione e la fine, rispettivamente. Immobilizzazione del ligando sul chip altera gradualmente la massa fino iniezione è terminata. Il plateau stabile osservata dopo la cessazione di iniezione del ligando riflette l'associazione stabile del ligando alla superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una volta che una linea di base stabile si ottiene un buffer viene iniettato il ligando e la cella di riferimento (Figura 1B, ciclo 3) .Questo iniezione serve come 'controllo in bianco ", e saràsottratto durante l'analisi. Dopo l'iniezione, cambiamenti minori sono registrati, riflettendo un flusso di massa attraverso il chip. Quindi in un ciclo separato (Figura 1B, ciclo 4), l'analita viene iniettato; il graduale aumento RU rappresenta l'associazione della analita al ligando. I siti di legame diventano via via occupati fino al raggiungimento dell'equilibrio. Appena finisce l'iniezione, un calo della RU riflette dissociazione del complesso. Da tali sensograms pre-equilibrio e di equilibrio costanti di velocità possono essere derivati ​​(vedi più avanti). La figura 1 illustra l'interazione transitorio tra il legante e analita. Quando l'interazione è più stabile, la diminuzione del livello di IF è più lento, riflettendo una minore k _d.

Qui, descriviamo un esperimento SPR per caratterizzare l'interazione tra un trasportatore di membrana (detergente solubilizzato) e il suo partner funzionale suo substrato affine proteina di legame ^6,7. Il mod sceltael sistema è un ATP cassette binding (ABC) trasportatore, ModBC-A di Archeaglobus fulgidus. Questo sistema è stato scelto per i suoi risultati altamente riproducibili, elevato rapporto segnale-rumore, e classica 'on / off' i tassi. Inoltre, trasportatori omologhi ABC sono a disposizione per servire come importanti controlli negativi. Il trasportatore, ModBC (ligando A) viene estratto dalla membrana con detersivo, purificata e immobilizzato sul chip. Il suo partner di interagire solubile, ModA, è l'analita. Come ligando controllo negativo, una diversa RbsBC ABC trasportatore viene utilizzato ("ligando B").

Protocollo

1. Protein Sample Buffer e preparazione

1. Preparazione del campione: purificare le proteine ​​di interesse e assicurarsi che tutti gli aggregati vengono rimossi, iniettando la proteina prima dell'esperimento su una colonna di gel-filtrazione o mediante ultracentrifugazione (di solito 10 min a 100.000 xg è sufficiente).
   NOTA: Anche se auspicabile, preparati proteici altamente puri non sono un must. SPR è stato utilizzato con successo con purificazioni tutt'altro che perfetto e anche con l'estratto totale ^8,9.
2. Buffer Preparazione:
   1. Preparare il buffer dell'esperimento (chiamato "tampone di corsa", o RB). Per il protocollo qui descritto, utilizzare 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltoside). Tenere presente che la scelta della composizione buffer può essere facilmente modificato secondo il sistema studiato.
   2. Filtrare tutti i tamponi e campioni di proteine ​​con 0.22 micron filtri. Assicurarsi in anticipo che i filtri siano proteicacompatibili. In generale, le piattaforme SPR recentemente commercializzati contengono una in-line de-Gasser; Se questo non è il caso, de-gas buffer prima dell'uso.
   3. Dializzare durante la notte o diluire i campioni contro il RB per evitare discordanze tampone. Dialisi (o qualsiasi altro metodo di scambio buffer) è particolarmente consigliabile quando si utilizzano sostanze chimiche ad alta viscosità (per esempio, saccarosio, glicerolo, DMSO). Prima di collegare la bottiglia RB alla pompa tenere da parte 10 ml di RB in un tubo separato.
3. Diluire il ligando magazzino concentrato in RB ad una concentrazione finale di ~ 20 ug / ml. Come regola generale, per stabile ligando di immobilizzazione, utilizzare basse concentrazioni di ligando con iniezioni più a basso flusso, in contrapposizione ad alte concentrazioni, ad alto flusso e iniezioni più brevi.
4. Diluire l'analita nel RB alla concentrazione desiderata. Tipicamente, testare la gamma di concentrazioni per un sistema di sconosciuta affinità da 10 pM a 10 nM in diluizioni di dieci volte. Iniziare semprecon le concentrazioni inferiori prime.

2. Sensor Chip

1. Selezione Chip: utilizzare un acido nitrilotriacetico (NTA) del circuito integrato accoppiato adatto per catturare le proteine ​​con un tag oligo-istidina.
2. Utilizzo Chip:
   1. Quando si utilizza un nuovo chip, prendere il chip fuori dal fodero, lavare delicatamente con doppia acqua distillata (DDW), asciugare accuratamente rimanenti liquidi con tergicristalli delicati, e fare attenzione a non toccare la superficie strato di oro. Posizionare il chip nel fodero con l'orientamento corretto (l'inserimento è liscia quando il chip è posizionato correttamente).
   2. Quando riutilizzare un chip, togliere il chip memorizzato dal buffer, sciacquare abbondantemente con DDW e asciugare delicatamente come detto in precedenza, e mettere nel fodero originale.
      NOTA: L'accumulo di materiale spazzatura non specifici sul chip può influenzare il suo 'redditività'. Questo può essere monitorato confrontando UR prima ligando immobilizzazione e post stripping. Anche se molte misure possono esserefatto utilizzando lo stesso chip NiNTA, la questione della sua longevità non è una 'netta' e varia notevolmente tra i diversi chip.
3. Chip attracco: Aprire la porta chip del sensore e posizionare il chip nel fodero. Quando si utilizza un nuovo chip, il numero di serie di input del chip di mantenere record di utilizzo. Chiudere la porta e premere 'di chip dock'.

3. Impostazioni di temperatura

1. Impostare la temperatura della cella di chip a 25 ° C (o la temperatura preferita esperimento).
2. Opzionale: impostare il vano campioni a 7 ° C per mantenere le proteine ​​stabile per tutto l'esperimento.

4. Soluzioni per Caricamento e Spogliarello

Preparare le seguenti soluzioni di carico e stripping: 0.5 mM NiCl ₂ in RB, 350 mM EDTA a RB (aggiungere detersivo per soluzione di EDTA ad una concentrazione finale in RB), 0,25% SDS in H ₂ O, e HCl 100 mM in H ₂ O. Quando si utilizza micro-centrifuga vascaES e non SPR tubi designati, non dimenticate di tagliare i tappi dei tubi.

5. Prime strumento SPR con RB

6. Avviare una nuova corsa

1. Impostare la portata che verrà utilizzato durante l'esperimento. Per ottenere i risultati descritti qui impostare il flusso di 50 microlitri / min.
   NOTA: Questo parametro può essere modificato durante l'esperimento.
2. Definire i percorsi di flusso e riferimento sottrazione. Per ottenere i risultati descritti qui definiti i percorsi Fc = 1 e Fc = 2, sottrazione Fc = 2-1.
   NOTA: Il programma visualizza in tempo reale la sottrazione di due celle di misura. Tenete a mente che questo parametro non può essere modificato durante l'esperimento.
3. Selezionare il rack idoneo campione (che può influenzare il consumo di volume del campione).
4. Salvare il file dei risultati.

7. Cicli Experiment

Ogni esperimento è composto da cicli, mantenere una chiara annotazione delle iniezioni fatte in EAciclo ch, e separare il carico dei ligandi ', iniezione vuoto del buffer e l'iniezione analita in diversi cicli.

1. Ciclo 1: preparazione Chip e nichel carico
   1. Assicurarsi che il flusso e percorsi sono impostati secondo al punto 6.1 e 6.2.
   2. Iniettare 350 mM EDTA per 1 min a lavare via gli avanzi.
   3. Impostare il flusso a 10 ml / min.
   4. Iniettare 0,5 NiCl mM ₂ per 2 minuti.
      NOTA: Ora la resina chip è ricoperta da ioni nichel.
2. Ciclo 2: ligandi immobilizzazione
   1. Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 2.
   2. Iniettare ligando A fino a raggiungere valori RU che sono 10-20 volte del suo peso molecolare. Ad esempio, caricare un ligando di 50 kDa a 500-1000 IF. Tenere un registro del valore RU raggiunto.
   3. Set flusso di 15 ml / min, percorso di flusso Fc = 1.
   4. Iniettare ligando B (controllo) fino allo stesso valore di quella di RU ligando A. Monitorare il Sensogramma sottrazione (Fc = 2-1) on-line per aiutare a controllare ilLunghezza iniezione.
   5. Impostare il flusso a 50 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, lavare il sistema per 5-20 minuti fino a quando la linea di base (Fc = 2-1) stabilizza.
3. Ciclo 3: iniezione Blank. Questa iniezione servirà per vuoto sottrazione, pertanto includere tutti i componenti che verranno iniettati con l'analita, tranne dell'analita stesso.
   NOTA: lunghezza iniezione può variare a seconda del tempo necessario per raggiungere l'equilibrio (segnale plateau).
   1. Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, Fc = 2-1 sottrazione.
   2. Inserire il comando 'attendere' (denominato qui di seguito come 'aspettare') per 30 secondi (per avere una linea di base stabile).
   3. Iniettare 15 sec RB.
      NOTA: La durata dell'iniezione può variare tra sistemi diversi, a seconda delle loro costanti cinetiche pre-equilibrio (principalmente k _a).
   4. Attendere 120-600 sec per registrare la fase di dissociazione.
      NOTA: La lunghezza di questa fase varia secondo la k _d: Più lenta la dissociazione del lungo questo passaggio deve essere. Per complessi dissociare molto lente (k _d <10 ^-4 sec ^-1), attendere 10-15 minuti e poi procedere alla superficie rigenerazione (vedi più avanti).
4. Ciclo 4: iniezione Analita
   1. Copia / incolla le condizioni esatte utilizzate nella iniezione di riferimento (ciclo 3) così queste due iniezioni possono essere successivamente sottratti. Cambiare la posizione dello slot nel rack da quella contenente la soluzione di controllo a uno che contiene la soluzione di analita. Scegli una concentrazione che è leggermente superiore al previsto K _D. Se alcuna conoscenza preliminare è disponibile, scegliere 1 micron come un buon punto di partenza.
5. Ciclo 5: iniezione Buffer
   1. Ripetere il ciclo 3.
6. Ciclo 6: iniezione Analita
   1. Ciclo Repeat 4.
7. Ciclo 7: Chip spogliarsi
   1. Impostare il flusso a 50 ml / min.
   2. Iniettare 350 mM EDTA per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip.
   3. Iniettare 0,25% SDS per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip.
   4. Se il livello di base non viene raggiunto, iniettare HCl 100 mm per 1 min, come ulteriore passo di stripping.
   5. Inserire il comando 'fine corsa' che passa alla modalità standby.
8. Stoccaggio Chip
   1. Disancorare chip del sensore e portarlo dallo strumento.
   2. Prendete il sensore fuori dal fodero, evitare di toccare la superficie, risciacquare con DDW, e posto in un tubo da 50 ml contenente RB. Conservare a 4 ° C.

8. analisi dei dati utilizzando Designated Evaluation Software

1. Effettuare le seguenti operazioni per elaborare i dati grezzi ottenuti da SPR prima derivazione dei parametri cinetici.
   1. Utilizzando il software di valutazione, apertoil file dei risultati, selezionare cicli 3-6 Fc = 2-1 (riferimento dati sottratto).
   2. Axis turno:
      1. Cicli di visualizzazione 3-6.
      2. Zero il valore Y della linea di base (30 sec tempo di attesa iniziale in ogni ciclo) al di tutte e quattro curve.
   3. Allineare l'asse x delle quattro curve. Scegli caratteristiche marcate (ad esempio, i picchi di inizio iniezione o arrivo) per allineare perfettamente le quattro curve lungo l'asse X. Impostare l'ora di inizio di analita (o buffer di controllo) a zero.
2. Riferimento sottrazione
   1. Sottrarre la risposta di fondo sottraendo curva del ciclo 3 dalla curva del ciclo di 4 e la curva del ciclo di 5 dalla curva del ciclo 6. Utilizzare il menu l'operazione di sottrazione delle curve che si possono trovare nella Y sposta.
      NOTA: E 'importante eseguire questo passaggio in cui annulla tutti i componenti non specifici (non collegati all'analita) che possono aver influenzato l'indice di rifrazione della superficie.
      1. Salvare le curve sottratti in tegli scheda di progetto con un nome diverso.
   2. Vedere queste curve come "curve doppiamente sottratta": la prima è la sottrazione 2-1 sottrazione eseguita su entrambi iniezioni, e il secondo è la sottrazione di una curva da un altro.
      NOTA: Tale doppio riferimento è il gold standard negli esperimenti SPR.
   3. Sovrapponete le curve sottratti eseguendo spostamento dell'asse come spiegato prima.
3. Determinazione delle cinetiche costanti e montaggio di modello
   1. Condurre un esperimento cinetica
      1. Iniettare una serie di 6-7 concentrazioni di analita avere un affidabile di dati per determinare le costanti cinetiche. Scegliere concentrazioni di analiti da 10 volte sopra a 10 volte inferiore alla stima K _D, in diluizioni 2-3-fold. Includere la concentrazione "zero", poi utilizzato per la doppia sottrazione di riferimento (vedi sopra). Condurre iniezioni in triplice copia e in ordine casuale.
      2. Allinearee sottrarre tutte le curve rispetto asse Y e l'asse X prima di montaggio di modello.
   2. Montaggio Modello
      1. Selezionare un programma di analisi adatto.
         NOTA: La maggior parte dei programmi di montaggio disponibili offrono diversi modelli che possono essere applicati per il montaggio e la determinazione delle costanti cinetiche.
      2. Applicare il modello più semplice (Langmuir) assumendo una reversibili 1: 1 interazione tra l'analita ed il legante per il montaggio. A meno convincente dati sono disponibili da altri metodi sperimentali per l'esistenza di una interazione più complessa, utilizzare sempre il semplice modello Langmuir.

Risultati

Nel sistema descritto, un chip NiNTA viene usato per immobilizzare il trasportatore di membrana His-tag ^6,7. Essendo un homo-dimero, ogni trasportatore è doppiamente marcato, migliorando il suo legame al chip NiNTA. A seguito di nichel carico, ligando A (il trasportatore di interesse) è immobilizzato su Fc = 2, fino a ~ 3.500 RU (ciclo di protocollo 2, figura 2A etichetta nera). Quindi, utilizzando la stessa portata e durata dell'iniezione, ligando B (il ligando di controllo) viene iniettato ...

Discussione

SPR è un metodo altamente sensibile per studiare le interazioni molecolari, ed è spesso l'unico approccio che fornisce il monitoraggio in tempo reale di transitori (ma importanti) interazioni. Un esempio è l'interazione transitoria qui presentata, che non poteva essere rilevata da un altro metodo (saggi di pull-down, saggi liposomi sedimentazione ^6). Inoltre, mentre altri metodi sono limitati all'equilibrio misurazioni (sia quantitativa o qualitativa), SPR è uno dei pochi tecniche che misurano anc...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Chip sensore NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare Software GE Healthcare
Biacore T200	GE Healthcare
Cloruro di nichel	Sigma	N6136
Tungstato di sodio diidrato	Sigma	T2629
Cloruro di sodio	Bio-Lab LTD.
base Trizma	Sigma	T1503
Acido etildiammino-tetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)	Sigma	E5134
n-dodecil-β-D-Maltopiranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Soluzione di sodio dodecil solfato	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Acido cloridrico	GADOT	7647-01-0
Filtro a membrana in nylon (NY)	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC trasportatore	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
Proteina legante il substrato ModA	Lewinson lab