Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.
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Articolo metodologico
Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina sono fondamentali per la maggior parte, se non tutti, i processi fisiologici, e la comprensione della natura di tali interazioni è un passo centrale nella ricerca biologica. La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è una tecnica di rilevamento sensibile per lo studio senza marcatura delle interazioni bio-molecolari in tempo reale. In un tipico esperimento SPR, un componente (di solito una proteina, chiamata "ligando") viene immobilizzato sulla superficie di un chip del sensore, mentre l'altro (l'"analita") è libero in soluzione e viene iniettato sulla superficie. L'associazione e la dissociazione dell'analita dal ligando sono misurate e tracciate in tempo reale su un grafico chiamato sensogramma, da cui derivano i dati di pre-equilibrio e di equilibrio. Essendo privo di marcature, consumando basse quantità di materiale e fornendo dati cinetici pre-equilibrio, spesso rende l'SPR il metodo preferito quando si studiano le dinamiche delle interazioni proteiche. Tuttavia, bisogna tenere presente che, a causa dell'elevata sensibilità del metodo, i dati ottenuti devono essere analizzati attentamente e supportati da altri metodi biochimici.
SPR è particolarmente adatto per lo studio delle proteine di membrana poiché consuma piccole quantità di materiale purificato ed è compatibile con lipidi e detergenti. Questo protocollo descrive un esperimento SPR che caratterizza le proprietà cinetiche dell'interazione tra una proteina di membrana (un trasportatore ABC) e una proteina solubile (la proteina legante il substrato affine del trasportatore).
Introduzione
Interazioni proteina-proteina (PPI); la formazione e la dissociazione di complessi proteici, sono eventi chiave in molti processi biologici (ad esempio, la replicazione, la trascrizione, traduzione, di segnalazione, di comunicazione cellula-cellula). Studi semi-quantitativa di PPI sono spesso eseguiti con pull-down o esperimenti di immuno-precipitazione. Tuttavia, queste tecniche (e simili) sono limitati nella gamma di affinità che può essere misurata (basso e maggiore affinità micromolare) per le fasi di lavaggio che sono inerenti a tali tecniche. Tali tecniche "end-point" non in grado di identificare le interazioni affinità transitori o bassi che sono spes....
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Protocollo
1. Protein Sample Buffer e preparazione
- Preparazione del campione: purificare le proteine di interesse e assicurarsi che tutti gli aggregati vengono rimossi, iniettando la proteina prima dell'esperimento su una colonna di gel-filtrazione o mediante ultracentrifugazione (di solito 10 min a 100.000 xg è sufficiente).
NOTA: Anche se auspicabile, preparati proteici altamente puri non sono un must. SPR è stato utilizzato con successo con purificazioni tutt'altro che perfetto e anche con l'estratto totale 8,9. - Buffer Preparazione:
- Preparare il buffer dell'esperimento (chiamato "tampone di corsa", o RB). Per ....
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Risultati
Nel sistema descritto, un chip NiNTA viene usato per immobilizzare il trasportatore di membrana His-tag 6,7. Essendo un homo-dimero, ogni trasportatore è doppiamente marcato, migliorando il suo legame al chip NiNTA. A seguito di nichel carico, ligando A (il trasportatore di interesse) è immobilizzato su Fc = 2, fino a ~ 3.500 RU (ciclo di protocollo 2, figura 2A etichetta nera). Quindi, utilizzando la stessa portata e durata dell'iniezione, ligando B (il ligando di controllo) viene iniettato .......
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Discussione
SPR è un metodo altamente sensibile per studiare le interazioni molecolari, ed è spesso l'unico approccio che fornisce il monitoraggio in tempo reale di transitori (ma importanti) interazioni. Un esempio è l'interazione transitoria qui presentata, che non poteva essere rilevata da un altro metodo (saggi di pull-down, saggi liposomi sedimentazione 6). Inoltre, mentre altri metodi sono limitati all'equilibrio misurazioni (sia quantitativa o qualitativa), SPR è uno dei pochi tecniche che misurano anc.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
La ricerca presso il laboratorio Lewinson è supportata da sovvenzioni dell'Accademia israeliana delle scienze, dell'Istituto Rappaport per la ricerca biomedica, della Fondazione di ricerca Meriuex e della borsa di reintegrazione professionale Marie Curie (OL). EV è sostenuto dalla borsa di studio Fine e dalla Facoltà di Medicina del Technion. NLL è supportato da sovvenzioni dell'Accademia israeliana delle scienze.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Chip sensore NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare Software GE Healthcare | ||
| Biacore T200 | GE Healthcare | ||
| Cloruro di nichel | Sigma | N6136 | |
| Tungstato di sodio diidrato | Sigma | T2629 | |
| Cloruro di sodio | Bio-Lab LTD. | ||
| base Trizma | Sigma | T1503 | |
| Acido etildiammino-tetraacetico sale disodico diidrato (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-dodecil-β-D-Maltopiranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Soluzione di sodio dodecil solfato | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Acido cloridrico | GADOT | 7647-01-0 | |
| Filtro a membrana in nylon (NY) | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC trasportatore | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| Proteina legante il substrato ModA | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. ....
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Ristampe e permessi
