L'intero test di citotossicità sangue (WCA) è un test di citotossicità sviluppato incorporando high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule con un microscopio a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini. Qui, descriviamo come cellule di linfoma trattati con un anticorpo anti-CD20 possono essere analizzati in tempo reale nel sangue intero umano per fornire un'analisi quantitativa citotossicità cellulare.
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Articolo metodologico
In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un live a base di cellule del sangue intero test di citotossicità (WCA) che consente l'accesso alle informazioni temporali della citotossicità delle cellule complessivo è sviluppato con high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule. Le popolazioni di cellule tumorali mirate in primo luogo sono preprogrammati per l'immobilizzazione in un formato matrice, ed etichettati con verdi coloranti fluorescenti citosoliche. Dopo la formazione matrice di celle, farmaci anticorpali sono aggiunti in combinazione con sangue umano intero. Ioduro di propidio (PI) viene poi aggiunto per valutare la morte cellulare. La matrice di celle viene analizzato con un sistema di imaging automatico. Mentre tintura citosolico etichette le popolazioni di cellule tumorali mirate, PI etichette le popolazioni di cellule tumorali morte. Pertanto, la percentuale di cancro bersaglio uccisione delle cellule può essere quantificata calcolando il numero di cellule sopravvissute mirati al numero di cellule bersaglio morte. Con questo metodo, i ricercatori possono accedere dipendente dal tempo e informazioni citotossicità cellulare dipendente dalla dose. Sorprendentemente, nessuna radio pericolosivengono utilizzati prodotti chimici. Il WCA qui presentato è stato testato con linfoma, leucemia, e le linee cellulari di tumori solidi. Pertanto, WCA permette ai ricercatori di valutare l'efficacia dei farmaci in una grande rilevanza ex vivo condizione.
Introduzione
I recenti progressi nel settore farmaceutico hanno portato ad un crescente interesse per la realizzazione delle identificazioni di anticorpi specifici di cellule tumorali e trattamenti contro il cancro personalizzati; Tuttavia, molti di ostacoli nel processo. Solo il 5% degli agenti che hanno attività antitumorale in fase di sviluppo preclinico sono concessi in licenza dopo aver mostrato sufficiente efficacia di fase II-III test 1,2. Le strategie preclinici (in vitro e in vivo) sono ottimali altrettanti esempi hanno dimostrato che i farmaci antitumorali si comportano diversamente nell'uomo e in animali da laboratorio principalmente a ....
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Protocollo
1. Obiettivo delle cellule Preparazione
- Mantenere (cellule di linfoma ad es. Raji) cellule bersaglio in terreni di coltura (RPMI 1640 medium di coltura, con il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS), 4Nm L-glutammina, e 500 UI / ml di penicillina / streptomicina) a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 5%.
- Centrifugare il campione per agglomerare le cellule bersaglio in un tubo da 15 ml. Tempo di centrifugazione varia con diversi tipi di cellule; centrifugare per 3 minuti a 468 xg per le cellule Raji.
- Prima aspirare eventuali bolle formate sulla superficie del surnatante, e rimuovere l'intero ....
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Risultati
Anti-CD20 anticorpi e cellule di linfoma (cellule Raji e MC / CAR) sono stati scelti come sistema modello per dimostrare tutto il test di citotossicità sangue (WCA) 7,8. Cellule Raji aveva elevato numero di copie di CD20 sulla superficie cellulare, mentre le cellule MC / auto era basso numero di copie di CD20 sulla loro membrana. Cellule bersaglio sono stati colorati con coloranti di fluorescenza verde citosoliche verde e disposte sulla piastra a 96 pozzetti. 10.000 - 50.000 cellule di linfoma bersaglio sono .......
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Discussione
WCA è un fondamentale strumento di screening in vitro anti-cancro con risoluzione di singola cellula 12-16, idealmente utilizzato dopo tradizionali proiezioni di destinazione, come CDC e test ADCC 9-11, e prima che i test sugli animali preclinici. Attualmente, obiettivo primario test di screening come il CDC o test ADCC sono tutte eseguite in un supporto semplificato o un sistema tampone. Tuttavia, farmaci candidati che mostrano efficacia in questi sistema tampone semplificata non sono sem.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo programma IMAT National Cancer Institute dal NIH per il finanziamento di questo lavoro [R33 CA174616-01A1].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di piastre da 96 pozzetti per l'attacco delle celle | Adheren | AP9601 | |
| Sospensione Array di cellule singole Vetrino a 8 pozzetti | Adheren | SS0801 | |
| Vetrino a 8 pozzetti | Adheren | SS0802 | |
| Linea cellulare di linfoma CD20+ | ATCC | CCL-86 | Cellule di Raji |
| Linea cellulare di linfoma CD20-ATCC | CRL-8083 | MC/CAR | |
| RPMI 1640 con L-glutammina | Life Technologies | 11875-119 | |
| Siero fetale bovino | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Colorante citosolico | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker |
| Rituxan verde (biosimilare) | Eureka Therapeutics | ||
| Sangue intero umano | Allcells | WB001 | |
| Ioduro di propidio | Sigma | P4170-10MG | |
| Sistema di imaging automatico | Dispositivi molecolari | Contatta | il fornitore Cell Reporter |
| Programma di conteggio delle cellule | Dispositivi molecolari | Contatta il fornitore | Cell Reporter |
Riferimenti
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. <....
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Ristampe e permessi
