RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

Sommario

Questo video mostra i passaggi di base per eseguire l'analisi dell'intero trascrittoma su campioni di midollo spinale embrionale di pollo sezionati dopo la trasfezione con elettroporazione in ovo.

Abstract

In ovo l'elettroporazione del tubo neurale del pulcino è un metodo veloce ed economico per l'identificazione della funzione genica durante lo sviluppo neurale. L'analisi dell'intero genoma di trascritti differenzialmente espressi dopo una tale manipolazione sperimentale ha il potenziale per scoprire un quadro quasi completo degli effetti a valle causati dal costrutto trasfettato. Questo lavoro descrive un metodo semplice per confrontare i trascrittomi da campioni di midollo spinale embrionale trasfettato che comprende tutti i passaggi tra l'elettroporazione e l'identificazione dei trascritti differenzialmente espressi. La prima fase consiste nelle linee guida per l'elettroporazione e nelle istruzioni per la dissezione delle metà del midollo spinale trasfettate da embrioni HH23 in ambiente privo di ribonucleasi e nell'estrazione di campioni di RNA di alta qualità adatti al sequenziamento del trascrittoma. La fase successiva è quella dell'analisi bioinformatica con linee guida generali per il filtraggio e il confronto dei set di dati RNA-Seq nel server pubblico Galaxy, che elimina la necessità di una struttura computazionale locale per esperimenti su piccola e media scala. I risultati rappresentativi mostrano che i metodi di dissezione generano campioni di RNA di alta qualità e che i trascrittomi ottenuti da due campioni di controllo sono essenzialmente gli stessi, un requisito importante per la rilevazione di geni di espressione differenziale in campioni sperimentali. Inoltre, viene fornito un esempio in cui la sovraespressione sperimentale di un costrutto di DNA può essere verificata visivamente dopo il confronto con campioni di controllo. L'applicazione di questo metodo può essere un potente strumento per facilitare nuove scoperte sulla funzione dei fattori neurali coinvolti nello sviluppo precoce del midollo spinale.

Introduzione

Gli studi genetici sugli organismi viventi utilizzano spesso l'embrione di pollo come modello perché in elettroporazione ovo rappresenta un modo veloce ed economico per transfettare parzialmente strutture embrionali in vivo con il DNA costruisce ^1-5. Vettori di espressione bicistronico che codificano una trascrizione contenente un reporter fluorescente insieme con il gene di interesse, quali pCIG ⁶ o pMES ^7, consentono un rapido controllo di qualità trasfezione regione specifica allo stereomicroscopio prima di elaborare embrioni per l'analisi a valle.

Con i recenti progre....

Protocollo

1. elettroporazione il costrutto di interesse nei tubi neurali della HH12-13 pollo embrioni in ovo

Utilizzare un reporter fluorescente, preferibilmente in una trascrizione bicistronico o fuso con la proteina di interesse con una intercalando 2a virale peptide ^11, per consentire una rapida identificazione di individui con livelli soddisfacenti di trasfezione. NOTA: il tempo di incubazione tipico per questa fase è di circa 48 ore a 37,8 ° C.

1. Aprire una piccola finestra nelle uova dopo la rimozione di 3 ml di albumina con una siringa accoppiato ad un 18 G x 1 1/2 ago. Per migliorare la visualizzazione dell'....

Risultati

Per convalidare il metodo descritto, due campioni di controllo sono stati generati da embrioni elettroporate con i pMES vuoto vettore ⁷ e un campione da embrioni trasfettate con lo stesso vettore contenente l'inserto costruire SCRT2-ZNF, che codifica i domini zinc-finger di pollo SCRT2 ^18. I campioni che producono 11-22 mg di RNA totale sono stati ottenuti da ciascun pool di 8 a 12 embrioni. Tutti e tre i campioni ottenuto un valore ottimale RIN 10 a un controllo di qualità eseguito con lo strument.......

Discussione

Qui forniamo linee guida per l'analisi degli effetti dopo l'elettroporazione del pollo midollo spinale. Anche se l'elettroporazione di vettori di DNA viene più spesso utilizzato per iperespressione di un gene di interesse, si può anche usare costrutti codificanti dominanti negativi, proteine ​​quimeric o precursori per siRNA per generare condizioni di funzione del gene knock-down ^19-21. In realtà, il confronto dei profili trascrittoma derivanti sia da GAIN- e analisi di perdita-di-funzione può not.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inchiostro di china	Qualsiasi fornitore
18G x 1 1/2 ago	BD	305196
siringa da 3 ml	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blu 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Colorante alimentare utilizzato per visualizzare l'iniezione
di DNA Soluzione di Ringer (1 L)
- 7,2 g di NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0,225 g di CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0,217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,4
- ddH2O a 1 L
- Filtro e autoclave
PBS (Soluzione tamponata con fosfato) (1 L)
- 8 g di NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1,15 g Na2HPO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,2
- ddH2O a 1 L e filtro
- 1 ml di DEPC (dietilpirocarbonato)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Agitare energicamente e lasciare riposare per una notte a temperatura
- Autoclave
Cucchiaio setacciato	Qualsiasi fornitore
Sterile 60 x 15 mm piastre di Petri in polistirene	Corning Life Sciences	351007
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi	Life Technologies	AM9780
Forbici chirurgiche a punta fine	Qualsiasi fornitore
Pinzette a punta fine dritte	Qualsiasi fornitore
Ago di vetro tirato realizzato con tubi capillari di vetro da 1,1 x 75 mm	Kimble Chase	40A502
9 '' pipetta di vetro Pasteur	Qualsiasi fornitore
Pompa per pipetta manuale	Qualsiasi fornitore
Trasparente 1,5 ml microcentrifuga provette in polipropilene	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuga	Qualsiasi fornitore
Soluzione RNAlater per la stabilizzazione dell'RNA	Life Technologies	Kit di isolamento dell'RNA totale acquoso AM7020
	Life Technologies	AM1912
Etanolo per biologia molecolare	Qualsiasi fornitore
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Elettroforesi Strumento bioanalizzatore	Agilent Technologies	G2939AA
Kit di preparazione del campione di RNA Truseq v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002

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