Embolic occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) per l'ictus ischemico con omologhi coaguli di sangue nei ratti

Sommario

In questo articolo, dimostriamo un metodo standard per produrre un'occlusione embolica dell'arteria cerebrale media con coaguli di sangue omologhi (ricchi di fibrina) in un ratto adulto. Questo modello imita da vicino l'ictus ischemico umano ed è adatto per lo studio preclinico della terapia trombolitica per l'ictus ischemico.

Abstract

Clinicamente, la terapia trombolitica con uso di ricombinante attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) rimane il trattamento più efficace per ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'uso di tPA è limitata dalla sua stretta finestra terapeutica e da un aumento del rischio di trasformazione emorragica. Vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli di ictus adatti per lo studio di nuovi agenti trombolitici e strategie per il trattamento di ictus ischemico. Allo stato attuale, due tipi principali di modelli di ictus ischemico sono stati sviluppati in ratti e topi: intraluminale sutura MCAO e embolico MCAO. Sebbene i modelli MCAO tramite la tecnica di sutura intraluminale sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca ictus meccanismo-driven, questi modelli di sutura non imitano la situazione clinica e non sono adatti per gli studi trombolitici. Tra questi modelli, il modello MCAO embolico imita strettamente ictus ischemico umano ed è adatto per l'indagine preclinica della terapia trombolitica. Questo modello embolico è stato sviluppato nei ratti da Overgaard et al. ¹ del 1992 e caratterizzata da Zhang et al. nel 1997 ^2. Nonostante embolico MCAO ha acquisito sempre maggiore attenzione, ci sono problemi tecnici affrontati da molti laboratori. Per soddisfare le crescenti esigenze di ricerca trombolitica, vi presentiamo un modello altamente riproducibile di embolica MCAO nel ratto, che può sviluppare un volume di infarto prevedibile all'interno del territorio MCA. In breve, una modifica PE-50 tubo è leggermente avanzata dalla carotide esterna (ECA) nel lume della carotide interna (ICA) finché la punta del catetere raggiunge l'origine del MCA. Tramite il catetere, un singolo omologa coagulo di sangue è posto all'origine della MCA. Per identificare il successo di MCA occlusione, flusso ematico cerebrale regionale è stata monitorata, deficit neurologici e volumi di infarto sono stati misurati. Le tecniche presentate in questo documento dovrebbero aiutare gli investigatori a superare i problemi tecnici per la creazione di questo modello per la ricerca ictus. </ P>

Introduzione

L'ictus è la terza causa di morte negli Stati Uniti, ma le opzioni di trattamento per l'ictus acuto rimane limitata. Allo stato attuale, l'infusione endovenosa di ricombinante attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) per dissolvere i coaguli di sangue è la terapia più efficace per ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'uso di tPA è limitata dalla sua stretta finestra terapeutica e da un aumento del rischio di emorragia intracerebrale. Pertanto, è urgente un modello di ictus adatto per la ricerca trombolitica.

L'arteria cerebrale media (MCA) è l'arteria più spesso occluso in ictus negli esseri umani. Incentrato su questa arteria, sono stati stabiliti numerosi modelli animali di ictus ischemico. Allo stato attuale, sono state sviluppate due principali tipi di roditori focale modelli di ischemia da occlusione MCA: sutura modello MCAO e embolico MCAO modello. Sebbene i modelli MCAO tramite la tecnica di sutura intraluminale sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca ictus meccanismo-driven, questi modelli di sutura non lo fannoictus umana imitare, come fino al 80% degli ictus umani sono causati da trombosi o embolia. Tuttavia, il modello ictus embolico con coaguli di sangue imita strettamente corsa umana ed è considerato adatto per lo studio trombolitica. Questo modello embolico è stato sviluppato nel ratto da Overgaard et al. ¹ del 1992 e caratterizzata da Zhang et al. Nel 1997 ² e Dinapoli et al. Nel 2006 ^3. Nonostante embolico MCAO ha acquisito sempre maggiore attenzione, ci sono problemi tecnici affrontati da molti laboratori.

In questo articolo, si dimostra un metodo standard per la produzione di embolico MCAO con omologhi coaguli di sangue nel ratto adulto, che possono sviluppare un infarto prevedibile all'interno del territorio MCA. Le tecniche presentate in questo articolo dovrebbero aiutare gli investigatori a superare i problemi tecnici per la creazione di questo modello per la ricerca ictus.

Protocollo

Dichiarazione Etica: Maschio adulto Sprague-Dawley (del peso di 330-380 g) sono stati utilizzati in questo protocollo. Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la LSU Health Science Center-Shreveport ed è in conformità con la 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(ottava edizione, Accademia Nazionale delle Scienze 2011 ).

1 Preparazione di Modified tubo PE-50

1. Tenere un 30 centimetri lungo tubo PE-50 sopra un fuoco di gas da mani, gradualmente ammorbidire il tubo. Allungare delicatamente il tubo.
2. Selezionare un punto sul tubo allungato con un calibro digitale (Figura 1), segnarlo, e tagliare il modificato PE-50 tubo in un segmento lungo 25 centimetri con una lunga punta di 1 cm (diametro esterno: ,30-,34 mm).

2 Preparazione di omologhi coaguli di sangue

1. Anestetizzare ratto con isoflurano (5% per l'induzione, 2-3% per la manutenzione), nel 70% N ₂ O e il 30% O _{2 da una maschera viso prima della raccolta del sangue. Confermare l'anestesia da un pizzico punta.}
2. Eseguire incannulamento arterioso femorale di un topo donatore con metodo pubblicato ⁴ e trasferire il sangue dell'arteria femorale direttamente in un 20 cm di lunghezza PE-50 tubo. Porre la provetta per 2 ore a temperatura ambiente per coagulo di sangue, e quindi mantenere la provetta per 22 ore a 4 ° C. Nota: Cannulazione viene eseguita utilizzando una tecnica asettica come descritto al punto 3.1. Il ratto donatore viene recuperato per ulteriori campionamenti.
3. Tagliare il tubo PE-50 in 50 segmenti mm e scovare il coagulo dal tubo in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fisiologica.
4. Trasferire 50 mm di lunghezza coagulo in una lunghezza di 60 mm Tubo PE-10 e collegare ciascuna estremità del tubo in PE-10 ad un 20 cm PE-50 tubo collegato alla siringa da 1 ml contenente soluzione fisiologica con 23 ago G (figura 2) .
5. Spostare il coagulo dal movimento alternato continuo da una siringa all'altra per 5 minuti, che può rimuovere le cellule del sangue dail coagulo e ridurre al minimo la fragile extravascolare coagulo coagulato, senza interrompere il nucleo fibrina.
6. Tagliare il coagulo in un segmento lungo 40 mm e trasferire il coagulo in un segmento modificato PE-50 catetere come descritto al punto 1.2 in condizioni asettiche. Nota: Tutti i tubi in PE è sterilizzato con ossido di etilene.

3. Embolic occlusione dell'arteria cerebrale media (Figura 3A, B)

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici da autoclave (minimo 121 ° C, 15 PSI, per 15 min). Sterilizzare il tavolo operatorio e attrezzature chirurgiche associate con il 70% di etanolo.
2. Anestetizzare il ratto con isoflurano come descritto al punto 2.1. Verificare la profondità dell'anestesia eseguendo un pizzico punta su entrambi i piedi posteriori, e qualsiasi movimento osservato (il ritiro della zampa) indica che l'animale non è sufficientemente anestetizzato a fare un intervento chirurgico. Applicare una piccola quantità di vet unguento su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Accorciare il pelo sul collo e la testa ventrale riregioni con tagliatori elettrici per esporre le zone della pelle.
3. Posizionare il ratto in posizione supina su una piastra elettrica. Inserire una sonda rettale, il controllo e mantenere la temperatura corporea tra i 36,5-37,5 ° C utilizzando una centralina coperta omeotermi.
4. Disinfettare la pelle e la pelliccia rasata circostante con il 10% povidone-iodio seguito da etanolo al 70%.
5. Fare un 2-cm-lunga incisione mediana sul collo sotto un microscopio da dissezione. Utilizzare divaricatori per esporre il campo operatorio e sezionare il diritto arteria carotide comune (CCA), carotide esterna (ECA), carotide interna (ICA), e pterigopalatino arteria (PPA) esente da nervi circostanti e fascia (Figura 3A). Nota: Prima di un intervento chirurgico, cambiare i guanti sterili se non assistente aiuta a preparare l'animale.
6. Sezionare il CCA libera dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale) e posizionare una sterile sutura 5-0 seta sotto l'arteria. Legare un nodo scorsoio (# 1) e afferrare la sutura con un piccolo hemostat e tirare insegnato verso il corpo.
7. Sezionare la Corte dei conti e dei suoi due rami, l'arteria occipitale (OA) e l'arteria tiroidea superiore (STA). Coagulare due rami con un elettrobisturi veterinario. Mettere due pezzi di sterili 6-0 punti di sutura in seta sotto l'ECA.
8. Separate le due sete posti sotto l'arteria, un pezzo verso la testa (estremità distale) e l'altro verso il corpo. Legare una legatura stretta (# 2) sul lato più vicino alla testa, afferrare la seta con piccole hemostats e tirare insegnato verso la testa. Preparare un nodo sciolto (# 3) con l'altra seta da utilizzare in seguito.
9. Sezionare l'ICA e PPA dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale). Legare il PPA con un 6-0 sutura (# 4). Fare un nodo scorsoio con 6-0 sutura intorno alla ICA (# 5). In alternativa, ritagliare la ICA utilizzando una clip microvascolare.
10. Tagliare un piccolo foro (mezzo attraverso) nella ECA tra la stretta (2 #) e sciolti (# 3) le legature con stile Vannas forbici a molla. Inserire il modificato 50 PE-vascae contenente coagulo di sangue nella incisione e passare alla biforcazione del CCA. Stringere la legatura allentata (# 3) intorno il lume appena sufficienti per garantire preservare la mobilità del tubo in-abitazione.
11. Tagliare la Corte dei conti presso il sito del piccolo foro per liberare il moncone e posizionare il moncone sotto la biforcazione della Corte dei conti e ICA; questo permetterà il tubo modificato facilmente scivolare nella ICA. Aprire la ICA e far avanzare delicatamente il tubo dal lume della Corte dei conti nella ICA fino a che la punta del catetere raggiunge l'origine del MCA (~ 17 millimetri dalla biforcazione). Nota: Prima di inserire la punta del tubo nel ECA, sterile la superficie esterna del tubo con il 70% di etanolo, e poi lavare con soluzione fisiologica sterile.
12. Iniettare il coagulo attraverso la modifica PE-50 catetere con 10 ml di soluzione salina oltre 10 secondi utilizzando una siringa Hamilton 100 microlitri (Figura 3B).
13. Ritirare il catetere dalla Corte dei conti 5 minuti più tardi. Legare la Corte dei conti e riaprire CCA. Suturare la incisione sul collo.

4 Monitoraggio Regionale Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Prima di MCA occlusione, fare un lungo 1,2 centimetri incisione mediana nel cuoio capelluto per esporre l'osso del cranio. Rimuovere i tessuti con l'osso del cranio con un raschietto dentale e swap di cotone sterili. Nota: Prima di un intervento chirurgico, la zona del cuoio capelluto esposto e pellicce circostante vengono disinfettati con il 10% povidone-iodio seguito da etanolo al 70%.
2. Eseguire un foro di diametro 1,5 millimetri bava situata a 2 mm posteriormente e 5 mm lateralmente al bregma utilizzando una bava sferica in acciaio inox 0,7 millimetri (Figura 4).
   NOTA: Mantenere la dura intatta.
3. Posizionare la sonda 0,5 millimetri sopra la superficie dura. Monitorare il rCBF a 0 (baseline), 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'embolizzazione e continuare in 5, 15, 30, 45, e 60 minuti dopo la somministrazione endovenosa di tPA. Dopo l'ultima misura di rCBF, l'incisione cuoio capelluto è chiusa da sutura. Nota: Prima di collo incisione misuriamo rCBF come linea di base prima MCA Occlusione. Messaggio MCA occlusione misuriamo rCBF dopo la chiusura di sutura al collo incisione. Così, l'incisione collo è mantenuta sterile.

Cura 5. post-operatorio

1. Iniettare 2,5 ml di soluzione salina per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e iniettare Buprenex (0,05 mg / kg, SC) subito dopo l'intervento chirurgico e ogni 6-12 ore, se necessario per alleviare il dolore.
2. Smettere di anestesia isoflurano. Posizionare il ratto in un 37 ° C camera di recupero veterinario (tenere caldo animale) e continuare l'osservazione. Di solito, occorrono 10 minuti per il ratto per recuperare da anestesia. Poi, mettere l'animale in una gabbia sterilizzato, mettere un po 'di cibo bagnato in una capsula di Petri nella gabbia, e restituire la gabbia per camera di sterilizzazione degli animali.
3. 24 ore dopo l'ictus, eutanasia il ratto con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo, IP).

6 Deficit neurologico Score

1. Eseguire il punteggio Bederson prima e durante 2 ore dopo l'embolizzazione. Utilizzare una classificazione scale di 0-3 come descritto in precedenza ^5: 0, alzando il topo dalla coda, l'animale che si estende entrambe le zampe anteriori a terra e non presentano alcun altri deficit (movimento normale); 1, alzando il topo da coda, flettere la zampa anteriore controlaterale; 2, diminuita resistenza alla spinta laterale (arti anteriori e flessione), senza circuitazione; 3, lo stesso comportamento di grado 2 con circuitazione.
   NOTA: I ratti che mostrano Bederson punteggio = 0 (nessun deficit) a 2 ore dopo l'embolizzazione sono esclusi da ulteriori studi.

Risultati

Laser Doppler (LDF) è stato utilizzato per monitorare rCBF durante l'induzione di ischemia cerebrale ^6,7. Molti laboratori tra cui il nostro laboratorio hanno utilizzato rCBF per identificare gli animali con successo occlusione MCA, ma le soglie di riferimento variavano tra i laboratori che sono collegati al sito di misurazione. La sonda della LDF è posizionato alle 2 mm posteriormente a 5 mm lateralmente al bregma, come descritto in precedenza ^6. rCBF stata monitorata a 0, 5, 15, 30, 60, 90 e 120 ...

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo standard per l'esecuzione di un modello di ictus embolico MCAO nel ratto, in cui l'origine del MCA è occlusa da un coagulo di fibrina ricco. Il principale vantaggio di questo modello è: l'occlusione del gambo di MCA con un ricco di fibrina coagulo di sangue è simile a tromboembolica ictus negli esseri umani, il modello di ictus embolico è adatto per l'esecuzione di indagini precliniche di terapia fibrinolitica, e che questo modello può sviluppare un volume d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
rh-tPA	Chimico	Genentech
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro	Chimico	Sigma	T8877
Anestesia vaporizzatore	Attrezzature	Soma Technology	Dräger Vapor 19.1
Attrezzatura ricaricabile ad alta velocità micro trapano		Strumenti per le scienze	18000-17
Forbici curve	Attrezzature	Strumenti per le scienze	14117-14
Pinze Dumont (Medico #7)	Attrezzature	Strumenti per le scienze	11270-20
Pinze Dumont (Medico #5)Attrezzature		Strumenti per le scienze fini	11251-35
Forbici	a molla in stile VannasAttrezzature	Fine Science Tools	15000-03
Camera di recupero veterinaria	Attrezzatura	Servizi Peco	V1200
Genie plus pompa a siringa	Attrezzatura	Kent Scientific Corporation
Matrice cerebrale di ratto	Attrezzatura	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Calibro digitale	Attrezzature	World Precision Instruments	501601
Microscopio da dissezione	Attrezzature	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Attrezzatura per siringhe Hamilton			modello 710
di controllo per coperte omeotermiche	Attrezzatura	Harvard Clipper
elettrico		Attrezzatura Braintree Scientific	CLP-9931
Elettrobisturi veterinari	Attrezzatura	MACAN Azienda produttrice	MV-9
Misuratore di portata sanguigna	Attrezzatura	Adinstruments
PowerLab 4/30	Attrezzatura	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
siringa da 1 ml	Materiale di consumo	Becton, Dickinson and Company	Ago da 309659
23 G	Consumabile	Becton, Dickinson and Company	305143
Ago da 30 G	Consumabile	Becton, Dickinson and Company	305106
Tubo in PE-50	Consumabile	Bevton, Dickinson and Company	427517
Tubo in PE-10	Consumabile	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Sutura in seta	Consumabile	Apparecchio Harvard	723287
sutura di seta 5-0	Consumabile	Apparecchio Harvard 517607

Unità