Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Sommario

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Abstract

I macrofagi, come i giocatori chiave della risposta immunitaria innata, sono al centro della ricerca che fare con l'omeostasi tissutale o varie patologie. Trasfezione con siRNA e il DNA plasmidico è uno strumento efficace per studiare la loro funzione, ma trasfezione di macrofagi non è cosa da poco. Anche se molti approcci diversi per la trasfezione di cellule eucariotiche sono disponibili, solo alcuni permettono trasfezione affidabile ed efficiente dei macrofagi, ma ridotto la vitalità delle cellule e il comportamento delle cellule gravemente alterato come capacità diminuita di differenziazione o polarizzazione sono frequentemente osservati. Pertanto un protocollo di trasfezione è necessario che sia in grado di trasferire siRNA e DNA plasmidico in macrofagi senza causare gravi effetti collaterali permettendo così l'indagine dell'effetto del siRNA o plasmide nel contesto del comportamento delle cellule normali. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per la trasfezione umani THP-1 macrofagi e monocytes con la vitalità delle cellule elevata, ad alta efficienza di trasfezione, e effetti minimi sul comportamento delle cellule. Questo approccio si basa sulla Nucleofection e il protocollo è stato ottimizzato per mantenere la massima capacità di attivazione delle cellule dopo la trasfezione. Il protocollo è adeguata per cellule aderenti dopo distacco così come le cellule in sospensione, e può essere utilizzato per piccole e medie numeri di esempio. Pertanto, il metodo presentato è utile per studiare gene effetti regolatori durante il differenziamento macrofagi e polarizzazione. Oltre a presentare i risultati che caratterizzano macrofagi trasfettate in base a questo protocollo rispetto ad un metodo chimico alternativo, l'impatto della coltura cellulare selezione medio dopo la trasfezione sul comportamento delle cellule è anche discusso. I dati presentati indicano l'importanza di convalidare la selezione di diverse impostazioni sperimentali.

Introduzione

Tra le componenti cellulari del sistema immunitario umano, i macrofagi sono di grande importanza per la risposta immunitaria innata. I loro compiti sono diversi; sono coinvolti nella fagocitosi dei patogeni e materiale necrotico, essi svolgono un ruolo importante nella omeostasi tissutale e producono e secernono un gran numero di citochine per regolare e orchestrare la risposta immunitaria ^1. Pertanto, i macrofagi sono integralmente coinvolti in molti processi fisiologici e condizioni fisiopatologiche. A causa della diversità dei loro compiti, i macrofagi sono un tipo di cellule molto eterogeneo e multiforme. Ciò si ottiene diverse polarizzazioni; seconda macrofagi stimoli esterni può svilupparsi in differenti fenotipi ^2. Variabilità macrofagi 'e impatto sulla risposta immunitaria loro un tema di ricerca molto interessante fanno. Al fine di chiarire la complessa metaboliche e funzioni di regolamentazione, del caso dei macrofagi in vitro sono required che riflettono correttamente macrofagi eterogeneità e variabilità.

Trasfezione di cellule con vettori plasmide di DNA o di piccoli RNA interferenti (siRNA), al fine di alterare l'espressione genica cellulare è diventato uno strumento ampiamente utilizzato e potente in biologia cellulare per lo studio sia per regolazione genica e la funzione del gene. Attualmente c'è una grande selezione di diversi strumenti disponibili per la trasfezione di cellule eucariotiche. Questi strumenti includono l'applicazione di vettori virali, metodi meccanici (come pistole geniche), approcci chimici (che si basano su polimeri o lipidi che possono formare complessi con gli acidi nucleici), ed elettroporazione di cellule ^3. Tutti questi approcci hanno i loro vantaggi e svantaggi e scegliendo il più adatto da questa vasta gamma per un tipo di cellula specifico e l'applicazione può essere un processo che richiede difficile e richiede tempo.

I macrofagi sono notoriamente difficili da transfettare transfe come quasi tutti ben consolidataapprocci ction riducono drasticamente la redditività macrofagi o interferire con il loro comportamento, cioè la differenziazione e in particolare polarizzazione. Pertanto, vi presentiamo qui un protocollo efficiente, non virale per trasfettare umani THP-1 macrofagi che utilizzano la tecnologia basata Nucleofector elettroporazione-, che rappresenta un approccio ottimizzato elettroporazione richiedono ridotte quantità di DNA. Nucleofection è particolarmente adatto per le cellule sensibili come monociti e macrofagi. Questo protocollo è un adattamento di versioni precedentemente pubblicati ^4,5.

In breve, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) è usato per differenziare umani THP-1 monociti per 48 ore in macrofagi prematuri prima della trasfezione con siRNA o DNA plasmidico. Per la trasfezione i macrofagi predifferentiated sono staccati enzimaticamente dal trattamento Accutase I. La trasfezione viene eseguita utilizzando un dispositivo 2b Nucleofector per elettroporazione delle cellule. Dopo la trasfezione, differireziazione è continuato per un altro 24 a 48 ore, come richiesto. Infine, macrofagi maturi trasfettate vengono incubate con differenti tipi di mescole per studi funzionali.

Questo approccio consente la trasfezione di linee cellulari come umani THP-1 monociti e macrofagi ed è stato applicato con successo in passato ^6-10. Contrariamente alla maggior parte degli approcci di trasfezione chimica, la nostra procedura Nucleofection modificata utilizzando macrofagi prematuri produce alte efficienze di trasfezione in combinazione con la vitalità cellulare intatta, senza la necessità di utilizzare vettori virali o aggiungere ulteriori composti vettore con effetti collaterali sconosciuti. Inoltre, i macrofagi mantengono la loro piena potenzialità di differenziazione e polarizzazione consentendo indagini funzionali senza ostacoli seguente trasfezione ^11.

Inoltre, il mezzo di coltura cellulare applicare dopo Nucleofection influenza fortemente studi funzionali seguente transfection; in particolare, la capacità dei macrofagi di polarizzazione può essere influenzato a seconda del mezzo di coltura applicato. Qui quattro diversi tipi di mezzi di coltura cellulare (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 e mouse T cellulare Nucleofector medio) sono stati testati in condizioni di disattivazione utilizzando interleuchina (IL) 10 Uso THP-1 macrofagi, abbiamo osservato che la risposta delle cellule a IL10 è forte quando il mouse T cellulare Nucleofector terreno è usato in confronto agli altri mezzi di coltura di cui sopra. Questi risultati dimostrano che appropriata ottimizzazione di tutte le condizioni di coltura cellulare è fondamentale per il successo di transfezione und successivi studi funzionali come questi possono migliorare significativamente i risultati sperimentali.

Come macrofagi sono coinvolti in varie malattie umane, gran parte della ricerca si concentra su chiarire comportamento macrofagi nonché meccanismi regolativi che influenzano macrofagi o, a sua volta controllata da parte dei macrofagi. Pertanto, questo protocollo è rilevante inmolte aree di ricerca diverse.

Protocollo

1 Differenziazione degli THP-1 Macrofagi

1. Coltivazione cellule THP-1 in terreno RPMI-1640 supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina / L-glutamina (PSG) in CO ₂ (5% ) incubatore a 37 ° C.
2. Prima di trasfezione, dividere le celle e trasferirli freschi di medie RPMI come prima. Coltivare le cellule per 24 ore.
3. Seme 1,0-1,5 x 10 ⁷ cellule in un pallone di coltura di tessuto 75 cm ² o 2,5 x 10 ⁷ cellule in un tessuto pallone di coltura di 150 cm ² in mezzo RPMI-1640 e di aggiungere il 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) piruvato di sodio, 1% (v / v) aminoacidi non essenziali, 10 ng / ml di PMA, e 50 mM β-mercaptoetanolo per 48 ore.

2 Preparazione di Nucleofection

1. Posizionare Accutase I e tutti i media in bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Aspirare il terreno di coltura da pallone e sostituire con 6 ml (boccetta 75 cm ²) o 12 ml (fiasco) di 150 cm ²Accutase I e incubare per 30 minuti a 37 ° C per il pieno distacco delle cellule. Osservare morfologia delle cellule dopo il trattamento Accutase ho per garantire che le cellule hanno un aspetto rotondo. Se alcune cellule ancora sembrano essere allegata, sciacquare accuratamente il pallone con una micropipetta o picchiettare delicatamente per completare il distacco. Non utilizzare raschietti di cellule, in quanto questo avrà un effetto negativo sulla vitalità delle cellule. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da 15 ml.
3. Durante il trattamento Accutase io, preparare i seguenti supporti:
   1. Preparare mezzo trasfezione: integratore terreno di coltura cellulare con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) di acidi non essenziali amino, 1% (v / v) di sodio piruvato, e 5% (v / v) di siero umano (per siRNA) o al 20% (v / v) di siero umano (per plasmide DNA); preparare un volume finale di una delle 3 ml / campione per una piastra da 6 pozzetti o 4 ml / campione per due piastre da 12 pozzetti.
   2. Preparare mezzo di coltura: integratore terreno di coltura con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) di aminoacidi non essenziali, 1% (v / v) di sodio piruvato, e il 5% (v / v) husiero uomo (per siRNA) o al 20% (v / v) di siero umano (per il plasmide), 2,5 ng / ml di PMA, e 50 mM β-mercaptoetanolo; preparare un volume finale di una delle 3 ml / campione per una piastra da 6 pozzetti o 4 ml / campione per due piastre da 12 pozzetti.
4. Sospensione cellulare Centrifugare per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente.
5. Cellule Aspirare Accutase I e risospendere in 1 ml di terreno RPMI pre-riscaldato a 37 ° C; contare le celle per determinare il numero di cellule.
   NOTA: Quando si utilizzano veloci procedure automatiche di conteggio delle cellule, passi 2.4 e 2.5 possono essere omessi e le cellule possono essere conteggiate immediatamente dopo il distacco a condizione che l'esposizione prolungata a Accutase mi viene evitato.
6. Per ogni campione trasfezione preparare aliquote in provette contenenti 2,0-2,5 x 10 ⁶ cellule.

3. Nucleofection di THP-1 Macrofagi

1. Centrifugare tutte le aliquote per 10 min a 250 xg a temperatura ambiente.
2. Diluire DNA plasmidico o siRNA in priva di nucleasiacqua o un tampone appropriato. Mantenere il volume di DNA plasmidico o siRNA richiesto più piccolo possibile.
3. Preparare una cuvetta Nucleofector sia con 1 mg di siRNA o 0,5 mg di DNA plasmidico per ogni trasfezione.
4. Eseguire una trasfezione alla volta. Aspirare il surnatante da un'aliquota delle cellule.
5. Risospendere le cellule pellet in soluzione Nucleofector per produrre un volume totale di 100 ml di DNA / siRNA e soluzione Nucleofector. Mantenere il tempo di esposizione a soluzione pura Nucleofector al minimo e assicurare che il tempo di esposizione non supera 15 min.
6. Mescolare cellule risospese e DNA / siRNA in Nucleofector cuvette picchiettando leggermente.
7. Cellule trasfezione eseguendo il programma Y-001 nel dispositivo 2b Nucleofector.
8. Trasferire cellule trasfettate in un flaconcino di reazione utilizzando pipette Pasteur di plastica usa e getta.
9. Aggiungere immediatamente 500 ml di mezzo di trasfezione preparato.
10. Ripetere i passaggi 3,4-3,9 per ogni campione trasfezione.

4. Post-Nucleofection Cura

1. Preparare o 6 pozzetti o 12 e piastre per cellule transfettate. Pipettare 2,5 ml di mezzo di transfezione in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti (1 pozzo / trasfezione) o 1,75 ml di mezzo di transfezione in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti (2 pozzetti / trasfezione).
2. Mescolare accuratamente sospensioni cellulari con una micropipetta.
3. Trasferire le cellule transfettate nei pozzetti preparati (sia un pozzetto in una piastra ben 6 o due in un piatto ben 12).
4. Incubare le piastre per 4 ore in un incubatore umidificato (5% di CO _2, 37 ° C).
5. Controllare riattacco delle cellule al microscopio.
   NOTA: La maggior parte delle cellule dovrebbe essere di nuovo aderente. Occasionalmente, estendendo il periodo di incubazione di 1 ora aumenta il numero di cellule aderenti in caso di riattacco insufficiente.
6. Aspirare accuratamente medio trasfezione con una micropipetta e sostituire con pari quantità di mezzo di coltura. Un solo Aspirare bene alla volta.
7. Incubare le cellule per il periodo di tempo necessario per il massimo effetto di plasmide o siRNA (24-72 ore). Se i periodi di incubazione superiore a 48 ore, sostituire media dopo 48 ore.
8. Per ulteriore trattamento con effettori (ad es., Citochine, agonisti, antagonisti e inibitori) utilizzano siero media liberi senza PMA e β-mercaptoetanolo. Ora la fine del periodo di incubazione della effettore con il tempo di effetto massimo del plasmide o siRNA e pianificare il cambiamento di medie e aggiunta del effettore conseguenza. Non mantenere le cellule in condizioni di libero siero per più di 24 ore.

Risultati

Usando questo protocollo per la trasfezione di THP-1 macrofagi con siRNA di solito raggiungere tassi di trasfezione di sopra del 90%, senza una significativa riduzione della vitalità cellulare. Figura 1 mostra i dati rappresentativi che caratterizzano lo stato delle celle 24 ore dopo la trasfezione con fluorescente siRNA contro un untransfected controllo, che non sono stati trattati con reagenti nucleofection e impulsi o siRNA ma ha ricevuto tutti i cambiamenti della cultura dei media come campioni trasfettati. Nella Figura 1A la morfologia cellulare è mostrato secondo la misura citometria a flusso. Immagini microscopiche sono illustrati nella Figura 1B figure 1C e 1D rappresentano i tassi bassi per apoptosi (controllo: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). E necrosi (controllo: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) che indicano la vitalità delle cellule inalterati. Necrosi e apoptosi sono leggermente superiori per il campione transfettate come trasfettate THP-1 macrofagi sono piùdifficile da staccare di cellule untransfected, quindi la probabilità di danno cellulare durante il distacco aumenta. Infine efficienza di trasfezione è presentato in Figura 1E. Come l'intera popolazione transfettate è spostata contro il controllo, significa che tutte le cellule sono transfettate che è confermato da immagini microscopiche di fluorescenza (Figura 2b). Sia il flusso dei dati di citometria così come le immagini microscopiche di fluorescenza indicano che tutte le cellule sono costantemente trasfettate con distribuzione omogenea dei siRNA tra cellule così come all'interno delle cellule. Questo è in contrasto con molti reagenti di trasfezione chimici, per le figure di confronto 2A e 2B mostrano i rispettivi dati di citometria a flusso e fluorescenza immagini microscopiche per un agente chimico trasfezione utilizzando un approccio basato lipidica. Queste cifre dimostrano che due popolazioni distinte di cellule transfettate possono essere rilevati. La prima frazione è simile alle cellule trasfettate folloala Nucleofection. Sono caratterizzati da bassa fluorescenza complessiva e distribuzione omogenea dei siRNA all'interno delle cellule. La seconda popolazione è caratterizzata da una fluorescenza più intensa che proviene da molto luminose agglomerati intracellulari di siRNA. La morfologia cellulare rimane invariato per entrambi i metodi di trasfezione come dimostrato dal contrasto di interferenza differenziale nella Figura 2C. Transfezioni resa in DNA plasmidico efficacemente risultati analoghi, per gli esempi si rimanda al Robenek et al. (2009) ⁹ o Xie et al. (2006) ^7.

La scelta del mezzo di coltura cellulare dopo trasfezione è di grande rilevanza; quindi diversi terreni di coltura di cellule sono stati testati in confronto. I media selezionati sono tutti adatti per la coltivazione di cellule THP-1 e sono stati scelti in base alle raccomandazioni della Lonza i media applicabile per la post-Nucleofection coltivazione. Figura 3 rappresenta il mediat siRNAEd knockdown efficienza utilizzando un siRNA diretto contro IL10RB (interleuchina 10 recettore catena β) mRNA. Per tutti i supporti esaminati l'espressione di IL10RB era significativamente ridotto a circa il 10 al 20% del livello di controllo (Figura 3). Tuttavia le cellule trasfettate variano a seconda del terreno di coltura nel loro potenziale di polarizzazione. THP-1 macrofagi trasfettate sia con siRNA di controllo non specifica o IL10RB-specifici siRNA sono state coltivate in diversi media dopo la transfezione e trattati con IL10. Successivamente i livelli di espressione del gene IL10 SOCS3-indotta (soppressore di segnalazione citochine 3) a livello di mRNA sono stati misurati mediante RT-qPCR. Differenze tra coltura verificano per quanto riguarda l'entità della induzione dell'espressione dell'mRNA SOCS3 (figura 4), ​​le induzioni per ciascuno dei mezzi testati mouse T cellulare Nucleofector Piano, LGM3, X-VIVO 20 e IMDM erano 19,5 [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] e 7,2 [5,6-9,5] volte, rispettivamente. Ilapplicazione refore del mouse T cellulare Nucleofector medio è di vitale importanza. Inoltre, le differenze di effetto del knockdown di IL10RB sull'espressione SOCS3 dopo il trattamento IL10 erano osservabili, i livelli di espressione di mRNA SOCS3 sono stati ridotti a 9,5 [8,8-10,3] piegare in topo T cellule Nucleofector media, 2,1 [1,1-4,1] piegano in LGM3, 4,8 [3,2-7,2] piega in X-VIVO 20 e 3,3 [2,7-3,9] piegare in IMDM. Questi valori corrispondono a riduzioni di espressione SOCS3 nei diversi media al 49%, 18%, 60% e 45%, rispettivamente. Riduzione di espressione SOCS3-IL-10 indotta dopo la trasfezione di siRNA IL10RB conferma la downregulation successo IL10RB dalla trasfezione.

Figura 1 Caratterizzazione di trasfettate THP-1 macrofagi. Lo stato caratteristico delle cellule non è influenzato, come rivelato da microscopio ottico e citometria a flusso analisi di co untransfectedcellule ntrol contro THP-1 trasfettate macrofagi secondo il protocollo presentato. THP-1 macrofagi sono stati differenziati con 10 ng / ml PMA per 48 ore e trasfettate con fluorescente (Alexa 488) di controllo non specifico siRNA. 24 ore dopo la trasfezione o sono state scattate le immagini di cellule vive (B), o le cellule sono state staccate dal Accutase trattamento I e analizzate mediante citometria di flusso (A). L'apoptosi e necrosi colorazione è stata eseguita utilizzando annessina V-ficoeritrina (PE) (C) e 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). Efficienza di trasfezione (E) è stata determinata mediante citometria di flusso utilizzando la fluorescenza etichetta attaccata al siRNA. Il segnale di fluorescenza delle cellule trasfettate (nero) viene mostrata contro il segnale di controllo (grigio). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2 Confronto della distribuzione intracellulare di siRNA dopo Nucleofection contro lipofezione. THP-1 le cellule sono state differenziate per 48 ore in base a questo protocollo e quindi trasfettate mediante Nucleofection o da lipofezione. I risultati lipofezione presentati sono stati ottenuti utilizzando il kit Xtremegene siRNA secondo le raccomandazioni del costruttore con un rapporto carica di reagente siRNA di 4: 1. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state sia staccato con Accutase I per l'analisi di citometria di flusso o valutata microscopicamente con cellule vive. (A) efficienza di trasfezione e distribuzione di siRNA per cella all'interno della popolazione è stata determinata mediante citometria a flusso utilizzando la fluorescenza etichetta attaccata al siRNA, controlli trasfettate senza siRNA sono mostrati in grigio, campioni trasfettate con siRNA sono mostrati in nero. (B) microscopia a fluorescenzaimmagini che mostrano la distribuzione intracellulare di fluorescente siRNA (Alexa Fluor 488); la barra di scala rappresenta 40 micron. (C) immagine differenziale contrasto interferenziale corrispondente all'immagine di fluorescenza; la barra di scala rappresenta 40 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Atterramento di IL10RB Figura 3 siRNA-mediata in trasfettate THP-1 macrofagi. Macrofagi THP-1 sono state trasfettate secondo il protocollo descritto. Dopo trasfezione le cellule sono state coltivate in quattro differenti mezzi di coltura, cioè Topo T cellulare Nucleofector media (A), IMDM (B), LGM3 (C), e X-VIVO 20 (D), completati come descritto nella sezione Protocollo. Cells erano o trasfettate con siRNA di controllo aspecifico (Ctrl) o IL10RB-specifici siRNA (IL10RB). Come ulteriori controlli seguenti campioni sono stati inclusi: Comando ad impulsi, vale a dire. cellule che hanno subito trasfezione in assenza di siRNA (Pulse), e un controllo del mezzo, cioè. cellule che hanno ricevuto solo le modifiche di terreni di coltura, ma rimasero altrimenti non trattati. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state incubate in terreno privo di siero con o senza 50 ng / ml IL10 per ulteriori 24 ore. Espressione IL10RB è stata misurata mediante RT-qPCR; diagrammi mostrano la media di tre esperimenti indipendenti, barre di errore rappresentano l'errore standard della media; * P <0,05; ** P <0.01; *** P <0.001 vs Ctrl. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4 regolazione IL10-dipendente di SOCS3 dopo atterramento di IL10RB in trasfettate THP-1 macrofagi. Macrofagi THP-1 sono state trasfettate secondo il protocollo descritto. Dopo trasfezione le cellule sono state coltivate in quattro diversi terreni di coltura delle cellule T mouse Nucleofector media (A), IMDM (B), LGM3 (C) e X-VIVO 20 (D) supplementato come descritto nella sezione Protocollo. Le cellule sono state trasfettate sia con il controllo non specifico siRNA (Ctrl) o IL10RB-specifici siRNA (IL10RB). Come ulteriori controlli seguenti campioni sono stati inclusi: Comando ad impulsi, cioè le cellule che hanno subito trasfezione in assenza di siNRA (Pulse), e un controllo del mezzo, vale a dire. cellule che hanno ricevuto solo le modifiche di terreni di coltura, ma rimasero altrimenti non trattati. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state incubate in terreno privo di siero con o senza 50 ng / ml IL10 per ulteriori 24 ore. SOCS3 espresfissione è stata misurata mediante RT-qPCR; diagrammi mostrano la media di tre esperimenti indipendenti, barre di errore rappresentano l'errore standard della media; *, # P <0,05; **, ## P <0.01; ***, ### P <0.001 vs Ctrl e contro Ctrl + IL-10, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo descritto qui presenta un modo affidabile ed efficiente per trasfettare THP-1 macrofagi che di solito sono piuttosto difficili da trasfezione. La trasfezione può essere realizzato con efficienze di trasfezione di sopra del 90% per siRNA senza significativa riduzione della vitalità cellulare. Incrementi di efficienza per plasmidi possono essere meno a causa delle loro dimensioni, ma di trasfezione efficienze di circa il 70% può essere di solito raggiunti. L'efficienza del knockdown siRNA-mediata può raggiungere 80 e il 90% a seconda del siRNA applicata. Un importante vantaggio di questo protocollo è che non interferisce con la differenziazione cellulare. Dopo la trasfezione le cellule ancora rispondono normalmente all'agente differenziazione PMA (Figura 1A 1B e Figura 4) ^12. Oltre polarizzazione cellulare da stimoli di citochine quali IL10 o LPS / IFNγ è influenzato ^12, anche se questo dipende anche fortemente sul supporto selezionato per la coltivazione dopo trasfezione uns mostrato in Figura 4.

Ci sono diverse opzioni all'interno della procedura che può essere modificata al fine di adattare il protocollo delle specifiche esigenze. Come mostrato in figura 4 le cellule reagiscono diversamente allo stesso stimolo IL10 seconda del mezzo di coltura selezionata dopo la trasfezione. Ciò indica che la composizione media ha una forte influenza sul comportamento cellulare. Dato che l'effetto imposto dal mezzo potrebbe differire per vari stimoli sperimentali, è possibile che il mezzo ottimale potrebbe cambiare e quindi vi è la necessità di verificare l'idoneità del mezzo di differenti esperimenti indipendente. Tuttavia il mezzo RPMI-1640, che è il mezzo predefinito utilizzato per la coltivazione di cellule THP-1, ha dimostrato di essere poco adatto per la coltivazione dopo trasfezione come è stata osservata una significativa perdita di vitalità cellulare. Inoltre, il protocollo può essere applicato anche ad THP-1 monociti senza previa differenziazione PMA-indotta questa,ovviamente, elimina la necessità di distacco delle cellule durante la procedura, ma tutti i passaggi rimanenti non devono essere regolati. I monociti THP-1 possono essere differenziati in seguito, se necessario.

Gli elementi più critici del protocollo sono in primo luogo il distacco e in secondo luogo il tempo richiesto per la trasfezione. Il distacco deve essere eseguito il più delicatamente possibile, al fine di mantenere alta la vitalità cellulare. Vi consigliamo quindi il distacco enzimatico relativamente mite da Accutase I over metodi molto aggressivi come tripsinizzazione. Altri metodi di distacco come il trattamento con Lidocaina o raschiatura sono risultati piuttosto dannosa e non devono essere utilizzati. Nel caso in cui 30 minuti di trattamento Accutase non dovrebbe essere sufficiente a staccare tutte le cellule correttamente questo è di solito un'indicazione di soluzione Accutase ho erroneamente conservati o scaduti o di un numero eccessivo di cicli di congelamento-scongelamento. Abbiamo ottenuto buoni risultati per la memorizzazione di piccole aliquote di Accutase io a -20 °C per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Tuttavia, quando vi è il distacco sufficiente sostituire Accutase I con Accutase freschi o aumentare il tempo di incubazione fino a 1 ora. Inoltre picchiettando leggermente o risciacquo del pallone o piastra può aiutare il distacco. Per quanto riguarda il tempo necessario per la trasfezione il tempo di esposizione delle cellule alla soluzione pura Nucleofector ha elevato impatto sulla sopravvivenza cellulare e quindi dovrebbe essere il più breve possibile. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è quello di eseguire ogni trasfezione alla volta (passi 2,10-2,15) e non più transfezioni in parallelo.

Se l'efficienza knockdown è bassa, questo di solito non è causato dalla bassa efficienza di trasfezione, ma questo può essere facilmente verificata mediante citometria a flusso o microscopia a fluorescenza e fluorescente siRNA o un plasmide codifica GFP. Per lo più la causa è un siRNA o il DNA plasmide inefficiente. In queste circostanze dovrebbe essere considerata per aumentare la quantità di siRNA (fino a 2-3 mg) oDNA plasmidico (fino a 1-2 mg) o per utilizzare un diverso siRNA o vettore di espressione, se disponibile. In alternativa, risultati soddisfacenti possono essere ottenuti anche mediante un pool di diversi siRNA differenti diretti contro lo stesso bersaglio. Inoltre, gli esperimenti del corso di tempo potrebbe essere richiesto di determinare con precisione il periodo di massimo effetto, che di solito raggiunge dopo 24-72 ore dopo la trasfezione.

Oltre trasfezione mediante elettroporazione ci sono ulteriori tecniche ben consolidate per la trasfezione di cellule di mammifero. Frequentemente sistemi applicati sono agenti di transfezione chimici che possono formare complessi con l'acido nucleico di carico e quindi facilitare il trasporto nelle cellule. I reagenti più comunemente utilizzati si basano sia su diverse specie di lipidi o possono essere scelti da un certo numero di polimeri cationici ^3. Per entrambi gli approcci una diversa selezione è disponibile in commercio. Questi reagenti di trasfezione offrono il vantaggio di essere generalmentefacile da usare, non richiedono molto tempo, e lavorare con cellule aderenti pure, eliminando così la necessità di distacco. Purtroppo, i macrofagi sono piuttosto difficili da trasfettare da questi metodi in quanto non proliferano in modo significativo in vitro e possiedono meccanismi di difesa contro il DNA estraneo citosolico ^13-15. Così, gli approcci di transfezione chimici spesso si traducono in una grave riduzione della vitalità cellulare. Tuttavia come mostrato in Figura 2 vi sono agenti di transfezione chimici in grado di trasferire con successo siRNA in macrofagi, ma come citofluorimetrica (Figura 2A) e microscopica fluorescente (Figura 2B) analisi indicano che non riescono a raggiungere la stessa distribuzione omogenea dei siRNA all'interno delle cellule come ottenuto da Nucleofection. Infatti, i dati di citometria a flusso indicano che due differenti popolazioni di cellule trasfettate verificano, innanzitutto una popolazione con fluorescenza simile come le cellule dopo Nucleofectisul rilevamento e in secondo luogo vi è una popolazione con più intensa fluorescenza. Conferma definitiva è ancora necessaria, ma supponiamo che la prima popolazione è in microscopia a fluorescenza identici a quelle cellule che mostrano una distribuzione omogenea dei siRNA fluorescente all'interno del citoplasma, mentre la seconda popolazione che rischia corrisponde alle cellule con agglomerati molto luminosi. I dati di citometria a flusso illustrati nella Figura 2A suggeriscono che i risultati nucleofection a meno di siRNA per cella rispetto all'approccio lipofezione alternativo. Tuttavia i dati della figura 3 mostra che anche la relativamente piccola quantità di siRNA incorporate per Nucleofection è già sufficiente per dall'80 al 90% knockdown del gene bersaglio. Pertanto, l'importo aggiuntivo di siRNA inserito dalla seconda popolazione dopo la trasfezione chimica è surplus molto probabile ed è quindi più probabilità di causare effetti collaterali indesiderati che di aumentare ulteriormente l'efficienza knockdown. A parte questoformazione di agglomerati intracellulari è già di per sé auspicabile dal momento che tali molecole di siRNA non sono suscettibili funzionali o comunque meno efficiente di molecole di siRNA liberi e possono causare effetti fuori bersaglio. Inoltre, la vera natura di questi agglomerati non è ancora chiaro. E 'possibile che questi punti luminosi rappresentano endosomi che indicano che il siRNA è stato interiorizzato dalle cellule, ma successivamente rilasciare dai endosomi fallito e il siRNA resta intrappolato e quindi inefficace. In alternativa, le macchie potrebbero essere agglomerati che si formano all'interno delle cellule. Valutazioni funzionali del trasfezione chimica sono in sospeso, quindi non affermazioni definitive in materia di efficienza atterramento possono essere ancora fatte, ancora l'esistenza di due distinte popolazioni è già sfavorevole in quanto ciò significa che tutti i risultati descrivono la media di entrambe le popolazioni, ciò non pertanto, corrisponde a una delle popolazioni. Per questo motivo Nucleofection è l'approccio superiore.

Tuttavia ci sono anche limitazioni alla procedura di trasfezione qui delineato. Poiché le cellule devono essere in sospensione per cellule aderenti Nucleofection devono essere staccato, che presenti un ulteriore fattore di stress per le cellule. Inoltre, l'intero protocollo è piuttosto in termini di tempo. Poiché trasfezioni non possono essere eseguite contemporaneamente, ma deve essere eseguita rapidamente per evitare danni cellulari, il numero di campioni è limitato a circa 8 - 10 per esperimento. Così, questo protocollo non è adatto per i progetti di screening ad alto rendimento. Per le applicazioni ad alta velocità effettiva diversi sistemi Nucleofector sono disponibili. In primo luogo, vi è il sistema 4D-Nucleofector che offre un formato nastro 16 bene. Per un throughput ancora più grande, ci sono il sistema Shuttle 96 bene e il 384 ben sistema HT Nucleofector. Tuttavia, come questi nuovi sistemi funzionano con elettrodi conduttivi polimero al posto di alluminio e quindi condizioni elettriche, cioè programmi e composition di soluzione Nucleofector, sono cambiate di conseguenza, esso deve essere determinato se il nostro protocollo può essere trasferito a tali sistemi.

Tuttavia, nonostante queste limitazioni il protocollo qui presentato non produrre una trasfezione affidabile ed efficace di cellule THP-1, che è superiore a tutti gli altri metodi non-virali. Questo protocollo consente l'indagine degli effetti di espressione genica alterata in cellule THP-1 che in tutti gli altri aspetti differenziare e polarizzano normalmente e quindi mostrano come piccoli effetti collaterali di trasfezione possibile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Aminoacidi, PAA non essenziale		M11-003
Provette da centrifuga (15 ml)	TPP	TPP91015
Siero fetale di vitello (FCS oro)	PAA	A15-151
Kit di nucleolettore di monociti umani	Lonza	VPA-1007	Contiene soluzione di nucleolettore, cuvette e Pasteur pipette
Siero umano fuori dal coagulo	Lonza	C11-020
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) con 25 mM HEPES e 25 mM L-glutammina	Lonza	12-722F
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Nucleo di cellule T di topo Nucleofector Medium	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicillina / streptomicina / L-glutammina (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plasmide
Piruvato di sodio (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 leucemia umana monociti	CLS	300356
Fiasche per coltura tissutale (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Piastre per colture tissutali (6 pozzetti; 12 pozzetti)	TPP	TPP92406/TPP92012
Provette (1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Acqua (senza nucleasi) o siRNA/tampone
X-Vivo 20 con gentamicina	Lonza	BE04-448Q
β-Mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148