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Articolo metodologico

Strategie per l'inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

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DOI:

10.3791/51964

⸱

16 febbraio 2015

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Abstract

Anastasis (greco per "l'aumento per la vita") si riferisce al recupero delle cellule morenti. Prima di queste cellule recuperare, hanno attraversato importanti posti di blocco di apoptosi, tra cui la frammentazione mitocondriale, il rilascio di mitocondriale citocromo c nel citosol, attivazione delle caspasi, condensazione della cromatina, il danno al DNA, la frammentazione nucleare, membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, l'esposizione della superficie cellulare di fosfatidilserina, e la formazione di corpi apoptotici. Anastasis può verificarsi quando stimoli apoptotici vengono rimossi prima della morte, consentendo in tal modo le cellule che muoiono per invertire l'apoptosi e potenzialmente di altri meccanismi di morte. Pertanto, Anastasis sembra coinvolgere i processi di guarigione fisiologici che potrebbe anche sostenere le cellule danneggiate in modo inappropriato. Le funzioni ei meccanismi di Anastasis non sono ancora chiare, ostacolato in parte dagli strumenti limitati per rilevare eventi passati dopo il recupero di cellule apparentemente sani. Strategie per l'individuazione Anastasis consentirà studi dei meccanismi fisiologici, i rischi di cellule non-morti in patologia della malattia, e potenziali terapie per modulare Anastasis. Qui, descriviamo strategie efficaci utilizzando la microscopia cellulare dal vivo e un biosensore caspasi mammiferi per l'identificazione e il monitoraggio Anastasis in cellule di mammifero.

Introduzione

Apoptosis (greco per "cadere a morte") è generalmente accettato di essere un processo a senso unico che termina nella cella suicidio 1-7. L'alterazione del gene pro-morte geni risultati nella sopravvivenza delle cellule in più che altrimenti morirebbero in animali interi, comprese le cellule che hanno già avviato il 8,9 apoptosi percorso. Allo stesso modo, le manipolazioni genetiche consentono alle cellule di mammifero sane che artificialmente DISPLAY "eat me" segnali o che perdono adesività per la loro matrice extracellulare per sfuggire alla morte per fagocitosi delle cellule tutto o entosis, rispettivamente, 10,11. Tuttavia, noi ed altri hanno dimostrato che senza manipolazione genetica normali cellule di mammifero sane e linee cellulari possono anche recuperare dalle prime fasi di apoptosi 12-15. Utilizzo di strumenti per monitorare le singole cellule, abbiamo ulteriormente dimostrato il recupero da stadio avanzato di apoptosi 12,13, dopo che le cellule sono passati importanti posti di blocco che tipicoly segnare il "punto di non ritorno" 2-6. Questi punti di controllo di fase apoptosi tardiva includono rilascio mitocondriale di citocromo c, attivazione delle caspasi, frammentazione nucleare, e la formazione di corpi apoptotici. Abbiamo adottato una parola composta greco "Anastasis", che significa "in aumento per la vita", per descrivere questa inversione di apoptosi sull'orlo della morte cellulare 2-6.

A meno che l'intero processo di morte-recupero è osservato da imaging cellulare dal vivo, che è difficile da distinguere le cellule che hanno subito anastasis da cellule che non hanno riportato eventi apoptotici. Decenni di lavoro hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche del suicidio cellulare per apoptosi sono guidati da eventi biochimici e molecolari evolutivamente conservati 16-19. Questi eventi promuovono autodistruzione delle cellule di regolare i processi di sviluppo e omeostatici di organismi unicellulari e pluricellulari eliminando danneggiato o dcellule angerous 16-19. Mentre le cellule apoptosi possono essere facilmente distinguono per manifestazioni morfologiche, biochimiche e molecolari standardizzate di apoptosi 1,5,6,16,20, attualmente non esiste un marcatore nota specifica per Anastasis 12,13. È importante sottolineare che, le cellule che hanno subito anastasis sembrano essere normali cellule sane e cellule che appena iniziano invertendo apoptosi apparire cellule morenti come apoptotici 12,13. Pertanto, sono necessari nuovi strumenti per concludere con certezza che una data cellula superstite aveva precedentemente sperimentato processi apoptotici attivi.

L'apoptosi è generalmente assunto come una cascata irreversibile perché è un processo di distruzione rapida e massiccia. Mentre potrebbe richiedere alcuni minuti a giorni per alcune cellule di avviare apoptosi, una volta che i mitocondri hanno rilasciato fattori citotossici, come il citocromo c nel citosol 21,22, caspasi possono essere attivate entro 5 minuti 23,24, seguito da citoplasmatica econdensazione nucleare entro 10 minuti 25-27, e la morte cellulare poco dopo 25-27. Caspasi attivate orchestrano apoptosi con l'adesione e inattivando componenti strutturali e funzionali chiave al fine di demolizione cellulari 2,28, come l'inibitore endonucleasi DFF45 / ICAD 29,30. Caspases attivano anche i fattori pro-apoptotici, come BID membro BCL-2 famiglia, che trasloca mitocondri per promuovere il rilascio mitocondriale di citocromo c 31,32. Attività di caspasi traduce anche nella cella di esposizione della superficie della fosfatidilserina come un segnale "eat me" per promuovere fagocitazione di morire cellule da parte dei macrofagi o cellule vicine attraverso fagocitosi 33. Inoltre, gli eventi apoptotici rendono mitocondri disfunzionali, che perturbano bioenergetica cellulari e metabolismo 34,35,36. Così, il recupero da tale distruzione sembra intuitivamente improbabile.

Contrariamente all'originale aspettarsizioni, le cellule possono invertire il processo di morte cellulare per apoptosi anche in una fase avanzata. Monitorando costantemente il destino di morire le cellule in coltura, abbiamo osservato la reversibilità della fase apoptosi in ritardo in un intervallo di celle primarie e linee cellulari 12,13. La rimozione dello stimolo morte ha permesso il recupero dalle caratteristiche evidenti di apoptosi, come la frammentazione mitocondriale, la condensazione della cromatina, il danno al DNA, membrana plasmatica blebbing, l'esposizione della superficie delle cellule della fosfatidilserina, rilascio di mitocondriale citocromo c, attivazione delle caspasi, la frammentazione nucleare, restringimento delle cellule, e la formazione di corpi apoptotici. Queste osservazioni sollevano domande senza risposta per quanto riguarda le funzioni, conseguenze, e meccanismi di Anastasis. Per rispondere a queste domande, un prerequisito è quello di identificare in modo affidabile le cellule che hanno subito Anastasis. Qui, descriviamo i metodi di microscopia dal vivo e un biosensore caspasi per rilevare le cellule che hanno già invertito apoptosi fase tardiva e then sopravvissuto.

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Protocollo

1. Preparazione di cellule di Imaging Live Cell

  1. Per facilitare l'individuazione di cambiamenti morfologici, scegliere cellule aderenti quali HeLa (carcinoma cervicale umana) cellule che sono piatta sul substrato per visualizzare meglio alterazione della membrana plasmatica e organelli intracellulari.
    Nota: Storno apoptosi è stata osservata in diverse cellule di mammifero 12,13, comprese le cellule del fegato di topo primaria, macrofagi primari topo, i cardiomiociti primari di ratto, e anche delle cellule linee come il rene embrionale cellule HEK-293T umani, africani scimmia verde renali COS epiteliali -7 cellule, il mouse del muscolo cardiaco HL-1 le cellule, fibroblasti di topo NIH 3T3, furetto (Mustela putoris furo), le cellule del cervello, le cellule CRL1656 A375 cancro della pelle umana, cellule CRL1973 cancro ai testicoli umani, piccole celle H446 carcinoma polmonare a cellule umane, il cancro del fegato umano cellule HepG2, cellule MCF7 cancro al seno umano, cellule PC3 cancro alla prostata umano, e neuroblastoma cellule SH-SY5Y umani.
  2. Pre-lavaggio vetrini di vetro di coltura cellulare fondo piatti con etanolo assoluto per la pulizia e la sterilizzazione.
    Nota 1: l'uso di piatti fondo di vetro è raccomandato per l'alta qualità contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, e alto confocale di ingrandimento o microscopia a fluorescenza (vedi la discussione).
    Nota 2: Per ingrandimenti elevati (40X, 60 / 63x o 100X obiettivi e le alte aperture numeriche 1.3 o 1.4), l'uso di piatti di coltura cellulare con fondo di vetro più sottile (spessore 0,085-0,16 mm) offre più le distanze per l'imaging di lavoro (vedi protocollo 3 ).
  3. A seconda del tipo di cellula, vetro fondo piastre di coltura possono richiedere rivestimento con poli-D-lisina (0,1 mg / ml), collagene (soluzione 0,01% in 0,01 M di acido acetico) e / o di fibronectina (5 mg / ml) prima semina cellule.
    Nota: è necessaria ottimizzazione del tipo e della concentrazione di agente di rivestimento per linee cellulari differenti. Cellule HeLa possono aderire direttamente sul vetro senza rivestimento. Tuttavia, alcune cellule, Such come topo muscolo cardiaco HL-1 le cellule, non può aderire direttamente alle superfici vetrate, ma richiedono protocolli di coltura e di rivestimento specifici 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 cellule in 35 millimetri di vetro pre-rivestite di cellule bottom cultura piatti e incubare a 37 gradi Celsius (° C), con il 5% di CO 2 per un giorno per raggiungere l'80% di confluenza.
    Nota 1: Le condizioni ottimali di densità cellulare, tempo di incubazione, e la condizione cultura può variare, a seconda del tipo di cellula. Confluenza cellulare può influenzare la risposta apoptotica delle cellule (vedi protocollo 2). Ad alta confluenza, le cellule potrebbero essere meno sensibili alle stesse concentrazioni di stimoli apoptotici.
    Nota 2: Evitare di cellule confluenti, come ad alta densità cellulare può oscurare cambiamenti morfologici delle singole cellule e dei loro organelli.

2. Applicazione e rimozione di apoptosi cellulare stimoli

  1. Poco prima dell'uso, pre-mix l'agente che induce l'apoptosi, con 37 ° C terreno di coltura cellulare. Etanolo (3,6-4,5% Vol / vol) è servito come apoptosi induttore nel presente manifestazione.
    Nota 1: I dati pubblicati e non pubblicati dimostrano che le cellule possono anche invertire apoptosi che viene attivato da altri stimoli apoptotici 12,13, come ad esempio dimetilsolfossido (DMSO, 8% vol / vol per 24 ore), staurosporina (STS, 0,5 micron per 1 ora), e taxolo (1 micron per 12 ore). È necessaria ottimizzazione del dosaggio per innescare l'apoptosi in differenti tipi di cellule per ottenere la dose minima che può innescare la maggioranza delle cellule nella popolazione di sottoporsi apoptosi.
    Nota 2: Pre-miscelazione agenti che inducono apoptosi con mezzo di coltura cellulare è importante evitare l'esposizione uniforme delle cellule apoptotiche stimoli.
  2. Immagine di un gruppo di cellule di salute nel piatto di coltura cellulare prima di applicare l'agente che induce l'apoptosi di stabilire morfologie di base.
  3. Rimuovere il supporto originale dal piatto di coltura cellulare, e quindi applicare 2 ml di premiscelato agente che induce l'apoptosi al piatto aattivare le cellule di sottoporsi apoptosi. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 (o altre condizioni di coltura normale).
  4. Dopo l'incubazione, osservare le cellule dalla luce, fluorescenza o microscopia confocale per monitorare la progressione della funzionalità apoptotici.
    Nota 1: Le cellule in fase di apoptosi mostreranno caratteristiche morfologiche, biochimiche e molecolari di apoptosi che può essere rilevato al microscopio e biosensori basati fluorescenza (vedere Protocolli di 3 e 4).
    Nota 2: Il tempo di incubazione delle cellule con differenti induttori dell'apoptosi varierà, a seconda del tipo di cellula, condizioni cellulari (come confluenza e stato nutrizionale), e la dose di stimoli morte applicata. Titolazione attenta può essere richiesto.
  5. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, rimuovere l'agente che induce l'apoptosi lavando le cellule una volta con caldo (37 ° C, o altra temperatura cultura normale) fresco terreno di coltura cellulare.
    Nota 1: Come le cellule apoptotiche sono più liberamente attaccati supiastra di coltura, è importante applicare e rimuovere medie delicatamente in modo che le cellule non verranno lavati via.
    Nota 2: in diretta sospeso cellule possono essere recuperati dal surnatante mediante centrifugazione delicata (160 g per 1 min) e aggiunto di nuovo al piatto cultura.
  6. Incubare le cellule a 37 ° C con 2 ml / piastra da 35 mm di fresco terreno di coltura cellulare in 5% CO 2. In alternativa, l'uso medio condizionato (terreno di coltura privo di cellule raccolte da cellule sane) per migliorare ulteriormente la sopravvivenza delle cellule apoptotiche.
    Nota: lavaggio e cellule incubazione con mezzo fresco consentono la maggioranza delle cellule per invertire apoptosi indotta etanolo dopo esposizione etanolo 12,13. Tuttavia, ripetendo questa fase di lavaggio può essere richiesto quando le cellule sono esposte ad altri stimoli apoptotici (vedi la discussione).

3. Microscopia Live Cell

  1. Si consiglia di utilizzare un confocale o fluorescenza microscopio invertito con controllo ambientale (37 ° C,2) 5% CO per le cellule vive microscopia.
    Nota: È anche possibile immagine le cellule utilizzando microscopi verticali con un obiettivo immersione dell'acqua. Immergere l'obiettivo direttamente nel terreno di coltura per celle di immagine. Tuttavia, le cellule possono essere schiacciati dall'obiettivo immersione durante la messa a fuoco.
  2. Pre-riscaldare il microscopio (come camera ambientale di controllo, fase incubatore, e riscaldamento oggettiva) almeno 2 ore prima di imaging.
    Nota: Questo consente ai componenti del microscopio di raggiungere termo-equilibrio, in modo che possa evitare la deriva della messa a fuoco e spostamento del piano xy dovuto alla dilatazione e contrazione termica dei componenti.
  3. Posizionare un piatto di vetro fondo 35 mm di cellule in coltura (Vedere protocollo 1) sul palcoscenico di un microscopio invertito e catturare le immagini delle cellule utilizzando un obiettivo 40X o 63X piano a Apochromat con apertura numerica (NA) 1.3 o 1.4 per l'imaging cellule dal fondo del piatto con vetrino.
    Nota: Evitare di applicare più di 2 ml di terrenoa 35 millimetri di vetro piatto inferiore, come il peso del mezzo potrebbe causare curvatura del fondo di vetro, rendendo difficile l'immagine di un campo di celle nello stesso piano focale.
  4. Mantenere cellule a 37 ° C o la corrispondente temperatura normale durante l'intero processo di imaging.
    Nota: Il processo di apoptosi, e probabilmente l'inversione di apoptosi, dipende da attività enzimatiche sensibili alla temperatura. Pertanto, mantenendo le cellule a 37 ° C (ad esempio con una fase di microscopio top incubatore) è importante tutto l'esperimento. Diminuzione temperatura potrebbe rallentare la risposta apoptotica e la risposta di recupero dopo la rimozione dello stimolo apoptotico.
  5. Utilizzare un dispositivo di umidità o di porre un foglio trasparente (vedi Materiali) sul piatto cultura per ridurre la perdita di acqua per evaporazione dal mezzo.
    Nota: la pellicola potrebbe disturbare la polarità della luce per microscopia DIC. Ripristinare polarità regolando il polarizzatore nel percorso della luce.
  6. Mantenere pHmezzo di coltura cellulare (pH 6.8 -7.3) incubando in 5% CO 2 con una camera di controllo ambientale sul microscopio.
    Nota: Manutenzione del pH nel terreno di coltura può essere ottenuto anche con l'aggiunta di tampone HEPES, oppure utilizzando commerciale CO 2 medio -indipendente (Vedere Materials). Le condizioni ottimali possono variare, a seconda del tipo di cellula.
  7. Ridurre al minimo di fluorescenza / laser (eccitazione intensità della luce) l'esposizione alle cellule durante il processo di imaging per evitare fototossicità riducendo l'intensità di fluorescenza al più basso necessario per ottenere immagini di alta qualità di cellule / strutture cellulari o biosensori espressi (dettagli nel protocollo 4).

4. Strategie per individuare e seguire Anastasis durante e dopo apoptotici Eventi

  1. Membrana plasmatica blebbing, condensazione citoplasmatica, restringimento delle cellule e la formazione del corpo apoptotico (vedi figure 1A - C, E).
    1. Eseguire time-lapse diffe cellule vivecontrasto renziale interferenza (DIC) o microscopia a contrasto di fase per monitorare un gruppo di cellule di salute e di osservare la loro morfologia cellulare (Vedere protocollo 3 per microscopia cellule vive, e vedi la discussione).
      Nota 1: ridurre l'intensità della fonte di luce per DIC / fase di imaging contratto per evitare di fototossicità alle cellule.
      Nota 2: Se DIC e microscopio a contrasto di fase non sono disponibili, utilizzare CellTracker per macchiare citosol per delineare la morfologia delle cellule vive per microscopia confocale o epi-fluorescenza e monitorare la morfologia cellulare.
    2. Applicare stimolo morte cellulare per attivare le cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici).
    3. Osservare cellule trattate per caratteristiche morfologiche di apoptosi, come membrana plasmatica blebbing, condensazione citoplasmatica, restringimento delle cellule e la formazione del corpo apoptotico (Figure 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lavare via stimoli di morte, e le cellule ri-approvvigionamento con terreno fresco quando le cellule displacaratteristiche morfologiche y di apoptosi.
      Nota 1: Applicare stimolo morte cellulare o cambiare il mezzo di coltura cellulare sul palco microscopio durante time-lapse imaging cellulare dal vivo può essere ottenuto utilizzando una camera di coltura cellulare di perfusione, o può essere eseguita direttamente sul piatto di coltura cellulare pipettando con cautela senza toccare il piatto, durante gli intervalli tra imaging.
      Nota 2: sistemi di compensazione della deriva Usa attenzione per evitare fuori fuoco delle cellule a causa della perdita di termo-equilibrio del sistema del microscopio dopo la modifica del mezzo di coltura cellulare (vedi la discussione).
    5. Continuo time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule che presentano caratteristiche di apoptosi. Le cellule che invertire l'apoptosi in grado di riparare i danni e recuperare normale morfologia piatta (Figure 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Frammentazione mitocondriale, DNA / condensazione della cromatina, e la frammentazione nucleare (vedi figure 1D, 1F, 1G).
    1. Per visualizzare mitochondria, cellule macchia con 50 deep dye nM MitoTracker rosso / rosso / verde fluorescente, e contemporaneamente colorano il nucleo con 10 ug / ml di Hoechst 33342 blu colorante nucleare in un terreno di coltura per 20 minuti a 37 ° C con il 5% di CO 2.
      Nota 1: Ridurre la concentrazione di coloranti e la durata dell'incubazione per evitare citotossicità e ridurre fluorescenza di fondo quando necessario. Ottimizzare le condizioni di colorazione per ottenere un buon rapporto segnale rumore con la minima quantità di colorante e l'incubazione tempo per la colorazione.
      Nota 2: Utilizzare le macchie fluorescenti per i mitocondri, come MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, o MitoTracker Verde FM, che non perde fuori dai mitocondri durante l'apoptosi. Questo permette di visualizzare la morfologia mitocondriale durante l'apoptosi e Anastasis. Vedere i materiali e le attrezzature per la tavola dettagli su queste macchie.
    2. Conservare cellule colorate al buio per evitare photobleaching.
    3. Rimuovere l'eccesso macchia lavando le cellule3 volte con 37 ° C-buffer fosfato salino (PBS) o soluzione fresca mezzo di coltura cellulare, con 1 min di incubazione in un mezzo fresco tra ogni lavaggio, e poi incubare ulteriormente nel mezzo fresco per 20 minuti prima del lavaggio finale per consentire eccessiva macchie per uscire le celle per ridurre sfondo segnali non specifici per l'imaging.
      Nota: Abbreviare i tempi di incubazione con mezzo cellulare dopo colorazione può provocare alta sfondo per l'imaging.
    4. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o microscopia a fluorescenza di cellule sane immagine prima di applicare l'induzione di apoptosi (Vedere protocollo 3 per microscopia cellule vive).
      Nota: Le cellule sane mostrano mitocondri tubolari e nuclei rotondi nella maggior parte dei tipi di cellule (figure 1D, 1F, 1G).
    5. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule).
    6. Continua time-lapse microscopia cellule in vivo di osservare alterazioni morpholog mitocondriale e nucleareies subito dopo lo stimolo di morte è applicata alle celle. Osservare cellule per visualizzare distingue apoptosi come frammentazione mitocondriale e gonfiore, la condensazione della cromatina e frammentazione nucleare, contrariamente alle cellule sane visualizzazione mitocondri tubolari e nuclei rotondi.
    7. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, lavare e la fornitura di cellule con terreno fresco, e continuare time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule. Le cellule che invertire apoptosi riacquistare mitocondriale normale morfologia nucleare (figure 1D, 1F, 1G).
      Nota: Eseguire la microscopia DIC in parallelo quando possibile ottenere ulteriori informazioni per l'accesso alle fasi di apoptosi osservando le alterazioni della morfologia cellulare nello stesso gruppo di cellule (vedi protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  3. Rilevazione di rilascio mitocondriale di citocromo c utilizzando cellule che esprimono stabilmente un GFP fusione citocromo c protein (vedi figura 2).
    1. Cellule Macchia stabilmente esprimenti citocromo c-GFP 23,24 con MitoTracker Red per etichettare mitocondri cellulari polarizzati (per vivere cella mitocondri colorazione Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    2. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o epi-microscopia a fluorescenza per monitorare le cellule sane (dettagli nel protocollo 3 per l'imaging cellulare dal vivo).
      Nota: Il segnale GFP citocromo c localizza prevalentemente nei mitocondri delle cellule sane (figure 2A i, 2B).
    3. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule). Continua la microscopia time-lapse per osservare traslocazione del citocromo c-GFP dai mitocondri al citoplasma (Figure 2Aii-iii, 2B).
      Nota: rilascio mitocondriale di citocromo c nel citosol è un marker di membrana mitocondriale esterna permeabilizzazione (MOMP)4, un passaggio fondamentale in mitocondri-dipendente apoptosi 21,22
    4. Quando le cellule mostrano il segnale GFP citocromo c nel citoplasma, rimuovere lo stimolo morte cellulare, e le cellule di alimentazione con terreno fresco (Vedi protocollo 2). Continua time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule con GFP citosolico.
      Nota: Le cellule che invertire apoptosi ritrovare normale morfologia cellulare, e ridurre il loro segnale GFP citocromo c citosolico presumibilmente attraverso la degradazione o la traslocazione di nuovo ai mitocondri (Figure 2Aiv-vii, 2B).
    5. Cattura immagini DIC in parallelo per ottenere ulteriori informazioni per l'accesso le fasi di apoptosi osservando alterazioni nella morfologia delle cellule in cellule singole o gruppi di cellule (Vedi protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  4. Rilevazione di attività caspasi usando un biosensore caspasi (vedi figura 3)
    1. Cellule trasfezione con la caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS per16 a 24 ore prima di sottoporli ad uno stimolo apoptotico 13.
    2. Colorare le culture trasfettate con Hoechst 33342 per etichettare nuclei cellulari (per la cella colorazione nucleare in diretta Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    3. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o epi-microscopia a fluorescenza per monitorare le cellule sane (dettagli nel protocollo 3 per l'imaging cellulare dal vivo).
      Nota: Il segnale biosensore NES-DEVD-YFP-NLS localizza principalmente nel citoplasma delle cellule sane grazie al suo segnale di esportazione nucleare (NES) (Figure 3A, 3Bi e 3C, vedi la discussione).
    4. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule). Continua la microscopia time-lapse per osservare la traslocazione nucleare di YFP.
      Nota: L'attivazione delle caspasi fende il motivo DEVD nel caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS, con conseguente YFP-NLS traslocazione dal citoplasma al nucleo (Figure 3A, 3Bii-iv, vedi la discussione).
    5. Quando le cellule mostrano YFP nucleare, rimuovere lo stimolo apoptotico, e le cellule di alimentazione con terreno fresco (vedi protocollo 2).
      Nota: Le cellule che inversa apoptosi riconquistare normale morfologia cellulare, ma mantenere il segnale YFP nucleare (Figure 3Bv-x, celle 1 e 2, e 3D).
    6. Continua time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule che mostrano YFP nucleare.
      Nota: Il segnale YFP nucleare diventerà degradate parecchie ore dopo che le cellule hanno invertito apoptosi (Figure 3B, vi-x, Cella 1, vedere i risultati e discussione) presumibilmente attraverso i normali meccanismi di clearance delle cellule, come la degradazione del proteasoma.
    7. Cattura immagini DIC in parallelo per ottenere ulteriori informazioni per accedere alle fasi di apoptosi osservando alterazioni nella morfologia cellulare in cellule singole o un gruppo di celle. (Vedere Protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  5. L'esposizione della superficie cellulare della fosfatidilserina (vedi figura 4)
    1. Cellule Seed su glass coprioggetto per raggiungere confluenza cella 80% (vedi protocollo 1).
    2. Co-macchia le cellule con MitoTracker rosso fluorescente e blu Hoechst 33342 macchia per i mitocondri e nuclei, rispettivamente (per mitocondriale delle cellule vive e colorazione nucleare Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    3. Attivare le cellule a sottoporsi apoptosi mediante un induttore di apoptosi (Vedere protocollo 2).
    4. Applicare fluorescente marcato annessina V (vedi Materiali) per colorare le cellule apoptotiche 10 min a 37 ° C prima della rimozione del induttore apoptosi per rilevare l'esposizione della fosfatidilserina sulla superficie delle cellule apoptotiche.
      Nota 1: Healthy cellule non sono colorate con annessina V perché fosfatidilserina è normalmente sequestrato su quello interno-volantino della membrana plasmatica delle cellule 38. Le cellule apoptotiche sono colorate con annessina V, che si lega alla fosfatidilserina sulla superficie cellulare (Figure 4A e 4B).
      Nota 2: annessina V fluorescente marcato può essere applicato anche a colorare le cellule apoptotiche immediatamente dopo la rimozione del induttore apoptosi, con 10 min di incubazione.
    5. Rimuovere stimoli morte cellulare, lavare le cellule colorate con caldo PBS o mezzo fresco una volta, e quindi la fornitura di cellule con terreno fresco per 2 ore a 37 ° C con il 5% di CO 2 (Vedi protocollo 2).
      Nota 1: Le cellule che invertita apoptosi riconquistare la morfologia normale e mantenere fluorescente segnale annessina V dopo aver recuperato la morfologia normale (figure 4A, 4B e).
      Nota 2: Il segnale annessina V diminuisce con il tempo sulle cellule recuperate (vedi la discussione).
    6. Fissare le cellule in momenti scelti con 4% paraformaldeide contenente 8% di saccarosio in 1x PBS per 20 minuti al buio a temperatura ambiente, e lavare le cellule fissate con PBS per 3 volte per rimuovere paraformaldeide prima cellule montaggio su vetrini coprioggetto con antifade di montaggio (vedi Materiali) per microscopia confocale o epi-fluorescenza e osservare annessina V sulle cellule dopo la rimozione di apoptosi induttore.
      Nota 1: saccarosio in fissativo conserva la struttura della membrana cellulare durante la fissazione.
      Nota 2: Conservare la soluzione paraformaldeide al buio a 4 ° C per prevenire il degrado.
      Nota 3: Warm up soluzione paraformaldeide a temperatura ambiente prima di applicarlo alle cellule per la fissazione per evitare shock freddo alle cellule.

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Risultati

Per studiare l'inversione di apoptosi, le cellule di coltura di tessuti vengono prima esposti ad uno stimolo morte per innescare l'apoptosi. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, terreno di coltura fresco viene poi applicato per lavare via stimolo e poi incubare le cellule morenti per consentire il recupero (Figura 1A). Qui, la questione chiave affrontata è fino a che punto le singole cellule in coltura morenti possono progredire verso l'apoptosi e ancora subire Anastasis. Questa doman...

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Discussione

Anastasis si riferisce al fenomeno in cui le cellule che hanno attivato cellule morte percorso successivamente invertire il processo di morte e sopravvivere. Qui, abbiamo dimostrato che l'imaging cellulare dal vivo può essere utilizzata per confermare che le stesse cellule singole, infatti, possono invertire apoptotica processo di morte cellulare in una fase avanzata, e poi continuare a sopravvivere e riprodursi. I nostri protocolli descrivono diversi cellulari ottimizzati condizioni trattamento specifico tipo di in...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz per suggerire la parola "Anastasis" per descrivere l'inversione di apoptosi; Douglas R. verde per le cellule HeLa esprimono stabilmente citocromo c-GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner per H446 cellule; Heather Lamb per l'assistenza in disegno a fumetti al video; Yee Hui Yeo per preziosa la discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la borsa di studio Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), borsa di studio Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH), e del Comitato Grants Università di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Research Foundation Life Sciences.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopia confocale LSM780Carl Zeiss Piatto di
coltura con fondo in vetroMatTek CorporationP35G-0-14-C
CultFoitrasparente Carl Zeiss000000-1116-084
Mezzo indipendente CO2Life Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker Rosso CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
Annessina V marcata fluorescenteBiovisionK201

Riferimenti

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