Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.
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Articolo metodologico
Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le culture dei fotorecettori arricchito cono derivati da retine pulcino embrionali sono diventati uno strumento indispensabile per i ricercatori di tutto il mondo che studiano la biologia dei neuroni della retina, in particolare fotorecettori. Le applicazioni di questo sistema vanno oltre la ricerca di base, in quanto possono essere facilmente adattate alle alte tecnologie throughput per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, la manipolazione genetica dei fotorecettori retinici in queste culture ha dimostrato di essere molto impegnativo, che costituiscono una limitazione importante per l'utilità del sistema. Abbiamo recentemente sviluppato e validato un ex ovo tecnica plasmide elettroporazione che aumenta il tasso di trasfezione di cellule retiniche in queste culture per cinque volte rispetto ad altri protocolli attualmente disponibili 1. In questo metodo occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27, l'RPE viene rimosso, e la coppa retinica viene posto in una soluzione contenente plasmide e elettroporate utilizzando CUSTOM- facilmente costruitoelettrodi in. Le retine sono poi dissociate e coltivate utilizzando le procedure standard. Questa tecnica può essere applicata a studi overespressione nonché alla downregulation dell'espressione genica, per esempio attraverso l'uso della tecnologia RNAi plasmide-driven, comunemente ottenendo l'espressione del transgene nel 25% della popolazione fotorecettori. Il formato video di questa pubblicazione rendere questa tecnologia facilmente accessibile ai ricercatori del settore, che consente lo studio della funzione dei geni in colture primarie della retina. Abbiamo incluso anche spiegazioni dettagliate sulle fasi critiche di questa procedura per un esito positivo e la riproducibilità.
Introduzione
Colture di cellule dissociate da retine pulcino embrionali sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia cellulare dei fotorecettori, tra cui la loro sopravvivenza 2-9, differenziazione 10-12, crescita dei neuriti 13, e altro ancora. I vantaggi di questo sistema, sviluppato nel 1980 da Ruben Adler e collaboratori e perfezionati dai suoi e altri gruppi 14-20, risiedono nelle caratteristiche intrinseche del pulcino come un modello animale 21. Le grandi dimensioni dell'occhio pulcino, anche a stadi embrionali, fornisce una grande quantità di materiali per le culture. Inoltre, quando l....
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Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo lavoro sono stati eseguiti secondo le linee guida raccomandate dalla cura degli animali e del Comitato uso presso la Johns Hopkins University.
1. Ahead of Time: preparazione di strumenti, reagenti e piatti
- Preparazione di uova: incubare fecondate uova di gallina bianca Livorno a 37,5 ° C e 60% di umidità relativa per 5 giorni in una incubatrice uovo.
NOTA: Un incubatore con capacità di oscillazione può essere utile per la standardizzazione e la sincronizzazione di sviluppo embrionale, ma a dondolo non è strettamente necessario per l'esito di questo protocollo. - Plasmidi....
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Risultati
Qui vi presentiamo un semplice protocollo per plasmide trasfezione in enucleate pulcino tazze retina per la successiva coltura cellulare dissociata. Trasfezione si ottiene elettroporazione utilizzando facile fare elettrodi personalizzati (Figure 1 - 2). I parametri descritti in questo protocollo sono stati ottimizzati per ottenere efficienze di trasfezione che variano tra il 20 e il 27% (con una media del 22%) (Figura 3D). Si noti che, per le ragioni sopra esposte, questi risultati sono.......
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Discussione
La fase più critica per il successo di questo protocollo è la selezione della fase appropriata degli embrioni. In pubblicazioni precedenti, una serie di stadi embrionali è dato per queste colture, tipicamente definito dai giorni di incubazione o embrionali giorni (ED); così è di solito presume che l'utilizzo ED 5 a ED 6 embrioni produrrà risultati equivalenti. Tuttavia abbiamo trovato che sulla fase 27 (ED 5), l'efficienza di trasfezione sarà circa il 22% della popolazione cellulare totale, come indicato in prec.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare David O'Brien per il suo supporto nell'analisi dei dati, e tutti i membri del laboratorio Canto-Soler per le loro discussioni critiche. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH EY004859 and EY022631 (MVCS), dal Core Grant EY1765 e da una sovvenzione dipartimentale illimitata di Research to Prevent Blindness, Inc.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX / Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, a forma di L, 5 mm Punta d'oro | BTX / Harvard Apparatus | 45-0115 modello 512 | Elettrodo con punta in oro utilizzato come anodo |
| Tubo in poliimmide | Vention Medical | su misura | Diametro interno: 0,5 mm / spessore della parete: 0,15 - 0,2 mm. Utilizzato per isolare l'elettrodo |
| con punta d'oroFilamento quadrato da 2,5 mm, larghezza 4,5 mm | Sutter Instrument Company | FB245B | Utilizzato per realizzare l'elettrodo catodico |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo | rosso Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| Pinza Moloney | Roboz | RS-8254 | seghettata; leggera curva; Pinzetta Dumont da 4,5" di lunghezza |
| 5/45 | Roboz | RS-5058 | Modello #5, angolo di 45 gradi; .10 x .06 mm di dimensione della punta; 109 mm di lunghezza |
| Micropinze Bonn, 1x2 denti | Roboz | RS-5172 | Piattaforma di legatura; 1x2 denti, 0,12 mm di lunghezza; 3,75" di lunghezza; 0,3 mm di larghezza della punta |
Riferimenti
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al.
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Ristampe e permessi
