Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Sommario

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Abstract

Le culture dei fotorecettori arricchito cono derivati ​​da retine pulcino embrionali sono diventati uno strumento indispensabile per i ricercatori di tutto il mondo che studiano la biologia dei neuroni della retina, in particolare fotorecettori. Le applicazioni di questo sistema vanno oltre la ricerca di base, in quanto possono essere facilmente adattate alle alte tecnologie throughput per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, la manipolazione genetica dei fotorecettori retinici in queste culture ha dimostrato di essere molto impegnativo, che costituiscono una limitazione importante per l'utilità del sistema. Abbiamo recentemente sviluppato e validato un ex ovo tecnica plasmide elettroporazione che aumenta il tasso di trasfezione di cellule retiniche in queste culture per cinque volte rispetto ad altri protocolli attualmente disponibili ^1. In questo metodo occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27, l'RPE viene rimosso, e la coppa retinica viene posto in una soluzione contenente plasmide e elettroporate utilizzando CUSTOM- facilmente costruitoelettrodi in. Le retine sono poi dissociate e coltivate utilizzando le procedure standard. Questa tecnica può essere applicata a studi overespressione nonché alla downregulation dell'espressione genica, per esempio attraverso l'uso della tecnologia RNAi plasmide-driven, comunemente ottenendo l'espressione del transgene nel 25% della popolazione fotorecettori. Il formato video di questa pubblicazione rendere questa tecnologia facilmente accessibile ai ricercatori del settore, che consente lo studio della funzione dei geni in colture primarie della retina. Abbiamo incluso anche spiegazioni dettagliate sulle fasi critiche di questa procedura per un esito positivo e la riproducibilità.

Introduzione

Colture di cellule dissociate da retine pulcino embrionali sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia cellulare dei fotorecettori, tra cui la loro sopravvivenza ^2-9, differenziazione ^10-12, crescita dei neuriti ^13, e altro ancora. I vantaggi di questo sistema, sviluppato nel 1980 da Ruben Adler e collaboratori e perfezionati dai suoi e altri gruppi ^14-20, risiedono nelle caratteristiche intrinseche del pulcino come un modello animale ^21. Le grandi dimensioni dell'occhio pulcino, anche a stadi embrionali, fornisce una grande quantità di materiali per le culture. Inoltre, quando le culture vengono eseguite utilizzando giorno embrionale (ED) 5 - 6 retine, 55-80% dei loro cellule progenitrici differenziarsi come fotorecettori ^{14,15,18,22,23,} e dal momento che circa il 86% dei fotorecettori in questo animale sono coni ^24, queste culture sono particolarmente adatti per studi che mettono in questo tipo cellulare.

Abbiamo recentemente sviped e caratterizzato una semplice tecnica che consente ad alta efficienza plasmide trasfezione delle cellule in queste culture, ampliando così l'utilità di questo sistema facilitando studi missexpression genetica ^1. Lo sviluppo di questa tecnica derivava da un vuoto nella letteratura scientifica di metodi che fornisca un livello accettabile di trasfezione per consentire lo studio della funzione genica in maniera autonoma cella. Ciò è in parte perché colture neuronali primarie sono notoriamente difficili da trasfettare ^25,26. Alcune delle tecniche più utilizzate in precedenza disponibili per questo scopo inclusi metodi di transfezione chimici quali lipofezione o calcio trasfezione fosfato-mediata, che determinano efficienze dell'ordine del 3-5% e possono esercitare una notevole tossicità ^27-32. Anche se l'uso di plasmidi con un sistema reporter enzimatico può aggirare il problema della scarsa efficienza di trasfezione amplificando il segnale, non lo fannodiscriminare effetti specifici delle cellule, ed i loro risultati sono basati su una piccola popolazione di cellule che potrebbe non essere rappresentativo dell'intero. Un altro metodo ampiamente usato al pulcino, infezione da virus RCA, è applicabile solo alle cellule proliferanti e quindi non adatto a questo sistema di coltura retinico primario ^33.

Nel protocollo corrente occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27 (ED 5), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) viene rimosso, e la coppa retinica è posto in una camera di elettroporazione riempita con una soluzione plasmide contenente e elettroporate con misura elettrodi, seguita da dissociazione della retina e della cultura utilizzando tecniche standard ^21. Dopo ottimizzare questa procedura siamo stati in grado di ottenere sempre efficienza di trasfezione dell'ordine del 22% del numero totale di cellule in coltura e 25% nella popolazione fotorecettore sola, senza compromettere le caratteristiche di sopravvivenza e la differenziazione delleculture ^1. Qui forniamo un protocollo dettagliata che illustra tutte le fasi importanti di questa procedura al fine di assicurare il successo e la riproducibilità di questa tecnica.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo lavoro sono stati eseguiti secondo le linee guida raccomandate dalla cura degli animali e del Comitato uso presso la Johns Hopkins University.

1. Ahead of Time: preparazione di strumenti, reagenti e piatti

1. Preparazione di uova: incubare fecondate uova di gallina bianca Livorno a 37,5 ° C e 60% di umidità relativa per 5 giorni in una incubatrice uovo.
   NOTA: Un incubatore con capacità di oscillazione può essere utile per la standardizzazione e la sincronizzazione di sviluppo embrionale, ma a dondolo non è strettamente necessario per l'esito di questo protocollo.
2. Plasmidi Preparazione:
   1. Disegno plasmide per costruire sovraespressione o downregulation gene (ad esempio tramite l'uso della tecnologia RNAi ^1,34) come necessario. Includere un gene reporter (come EGFP, RFP o LacZ) nel costrutto, quando possibile.
      NOTA: Alcuni promotori di uso comune come CMV, possono diventare a tacere dopo il tempo. Il promot CAGer (pollo beta-actina promotore con CMV enhancer) è una buona alternativa, fornendo espressione efficiente a lungo termine del gene di interesse ^35-37.
   2. Preparare una soluzione plasmide ad una concentrazione di 1,5 mg / mL in PBS sterile. OPTIONAL: Preparare la soluzione plasmide prima del tempo e conservarlo congelato fino al momento dell'uso.
      NOTA: maggiore concentrazione plasmide non comportino un aumento significativo dell'efficienza, mentre l'uso di concentrazioni plasmide più basse riducono l'efficienza di trasfezione ^1.
3. Elettrodi:
   1. Per l'uso anodo un oro spessa punta elettrodo (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment). Pulire con il 70% di etanolo.
      NOTA: Isolamento dell'oro punta dell'elettrodo, lasciando circa 0,5 mm a vista, è consigliabile per ridurre la dispersione della corrente elettrica. Informazioni per materiale isolante può essere trovato nella tabella di materiali specifici.
   2. Fare un catodo di 2,5 mm quadrati bbue filamento, largo 4,5 mm (normalmente utilizzato in estrattori micropipetta). Con l'aiuto di una pinza, svitare la scatola quadrata e raddrizzare filamento in una lunga striscia. Poi, al microscopio dissezione e utilizzando un righello come guida, piegare il filamento in una forma quadrata 'U' lunga 3 mm alla base e 2 mm su un lato, con l'altro lato della lunghezza rimanente del filamento (Figura 1 , C - D). Utilizzando pinze, immergere l'elettrodo nel 96% di etanolo e fiamme al sterilizzare. Quindi collegare un cavo elettrico con un piccolo coccodrillo per il braccio più lungo dell'elettrodo.
4. Elettroporazione Camera Setup:
   1. Preparare la camera di elettroporazione tagliando il coperchio di una provetta sterile da 1,5 ml e apposizione, lato piatto verso il basso, ad una piastra di Petri 100 mm usando nastro (Figura 1E).
      NOTA: altro contenitore in forma di un pozzo di dimensioni simili funzionerebbe; tuttavia, un coperchio provetta è facilmente accessibile e autoclavabile. Il pozzodeve essere sufficiente per ospitare un elettrodo pulcino occhio e catodo grande, ma non così grande da risultare in una perdita di soluzione plasmide.

2. Ex ovo Elettroporazione Procedura

1. Preparazione degli strumenti:
   1. Sterilizzare gli strumenti di micro-dissezione (2 coppie di grandi pinze Moloney curve per aprire i gusci d'uovo e scavando embrioni, 2 paia di fine-tip curvo pinzette Dumont per la rimozione di RPE, un paio di Bonn dentato forcipe per obiettivo la rimozione e vitreo) per immersione il punte in 96% di etanolo e fiammeggiante. Ambito dissezione Pulire con panni immersi nel 70% di etanolo. Scaldare una bottiglia di soluzione salina bilanciata sterile calcio-magnesio-libero di Hank (CMF-HBSS) in un bagno d'acqua a 37 ° C. Riempire 100 mm sterili piastre Petri a 3/4 con caldo CMF-HBSS.
   2. Mettere camera di elettroporazione con un altro microscopio dissezione pulito e riempire con 120 ml di soluzione di plasmide. Collegare gli elettrodi agli apparecchi elettroporazione, rendendoAssicurarsi elettrodo misura è collegato al polo negativo e oro punta dell'elettrodo al polo positivo.
2. Embrione Collezione:
   1. Pulire le uova strofinando conchiglie con salviette bagnate nel 70% di etanolo. Mantenere la procedura sterile per tutto il resto del protocollo per evitare di portare la contaminazione nelle culture. Utilizzando grandi pinze Moloney curve aprire con attenzione un buco nel guscio d'uovo picchiettando delicatamente sulla punta arrotondata di un uovo (sopra la camera d'aria) e poi presa e tirando fuori pezzi di conchiglia.
   2. Con un altro paio di pinze rimuovere membrane e raccogliere embrione da scavare fuori l'uovo (facendo attenzione a non danneggiare l'embrione). Mettere in un piatto con CMF-HBSS.
      NOTA: raccogliere il maggior numero di embrioni necessari per ottenere il numero desiderato di tazze retina per elettroporazione come specificato in 2.4.4
   3. PUNTO CRITICO: stage gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton ^38.
      NOTA: Per ottenere gli embrioni ottimali di efficienzadeve essere di fase 27 (Figura 2A).
   4. Eutanasia gli embrioni di decapitazione con pinze Moloney.
3. Ottenere Coppe retina:
   1. Usando sottili pinzette Dumont, enucleare con attenzione gli occhi e trasferimento in un nuovo piatto CMF-HBSS.
   2. Partendo dalla parte posteriore di ciascun occhio, in prossimità della testa del nervo ottico, e utilizzando due pinzette Dumont fine, introdurre una punta di ciascuna coppia di pinzette tra la retina neurale e RPE e accuratamente sezionare la RPE essendo cauto per non danneggiare neurale retina (Figura 2B).
      NOTA: La mancanza di Ca ²⁺ e Mg ²⁺ nella soluzione aiuterà il RPE stacca dalla retina neurale più facilmente.
4. Elettroporazione:
   1. Impostare i parametri di elettroporatore per fornire impulsi di 5 quadrati di 15 volt, 50 msec, durata e intervallo 950 msec. Luogo 'U' a forma di elettrodo negativo all'interno della camera di elettroporazione (microcentrifuga coperchio di riempimentoED con 120 ml di soluzione contenente plasmide).
   2. Usando pinzette Dumont curvi trasferire una tazza retinica alla camera di elettroporazione (scavando, non pressatura), e posizionarlo all'interno dell'elettrodo sagomato 'U', con la parte posteriore della retina verso il fondo dell'elettrodo e la lente rivolta verso l'alto ( Figura 2D).
   3. Posizionare l'anodo in modo che tocchi la parte anteriore dell'occhio, accanto alla lente, e utilizzando pedale del electroporator fornire gli impulsi elettrici.
   4. Trasferire tazza retina elettroporate in un piatto Petri con CMF-HBSS e ripetere la procedura di elettroporazione con ciascuno dei restanti tazze retiniche.
      NOTA: Fino a 6 tazze retina può essere elettroporate con la stessa soluzione plasmide senza una significativa diminuzione efficienza di trasfezione.
   5. Rimuovere la lente e corpo vitreo di ogni coppa retinica elettroporate da loro presa con Bonn pinza dentata e tirando dolcemente attraverso tegli pupilla apertura tenendo l'occhio in posizione con la parte posteriore delle pinzette Dumont curve.
   6. Procedere alla dissociazione e la cultura delle cellule della retina elettroporate seguenti procedure standard.
      NOTA: per un protocollo dettagliato sulla dissociazione e la cultura di cellule retiniche pulcino si riferiscono a Vergara e Canto-Soler 2012, sui file ⁴ 21 In questo protocollo le cellule vengono seminate a bassa densità su 6 pozzetti poliornitina rivestite o 35. piatti -mm (6 x 10 ⁵ cellule / 35 mm di diametro e o piatto). Il mezzo utilizzato è medium 199 con penicillina / glutammina, siero di vitello fetale al 10% (FCS), e acido linoleico-BSA a 100 ug / ml. Le colture vengono mantenute in un umidificata 37 ° C incubatore con 5% di CO _2. Con questa procedura, 5 - 6 x 10 ^{6 cellule} in genere può essere ottenuto per ogni fase 27 occhio elettroporate.
      NOTA: Idealmente, non più di 3 ore dovrebbe passare tra il prelievo e la placcatura delle cellule, per assicurare una buona sopravvivenza cellularee ridurre al minimo lo stress. Una tipica temporizzazione per l'osservazione e l'ulteriore analisi è dopo 4 giorni di coltura, poiché a questo punto le cellule hanno raggiunto una buona differenziazione morfologica e molecolare e la sopravvivenza è ancora alto.

Risultati

Qui vi presentiamo un semplice protocollo per plasmide trasfezione in enucleate pulcino tazze retina per la successiva coltura cellulare dissociata. Trasfezione si ottiene elettroporazione utilizzando facile fare elettrodi personalizzati (Figure 1 - 2). I parametri descritti in questo protocollo sono stati ottimizzati per ottenere efficienze di trasfezione che variano tra il 20 e il 27% (con una media del 22%) (Figura 3D). Si noti che, per le ragioni sopra esposte, questi risultati sono...

Discussione

La fase più critica per il successo di questo protocollo è la selezione della fase appropriata degli embrioni. In pubblicazioni precedenti, una serie di stadi embrionali è dato per queste colture, tipicamente definito dai giorni di incubazione o embrionali giorni (ED); così è di solito presume che l'utilizzo ED 5 a ED 6 embrioni produrrà risultati equivalenti. Tuttavia abbiamo trovato che sulla fase 27 (ED 5), l'efficienza di trasfezione sarà circa il 22% della popolazione cellulare totale, come indicato in prec...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ECM 830 Electro Square Porator	BTX / Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, a forma di L, 5 mm Punta d'oro	BTX / Harvard Apparatus	45-0115 modello 512	Elettrodo con punta in oro utilizzato come anodo
Tubo in poliimmide	Vention Medical	su misura	Diametro interno: 0,5 mm / spessore della parete: 0,15 - 0,2 mm. Utilizzato per isolare l'elettrodo
con punta d'oroFilamento quadrato da 2,5 mm, larghezza 4,5 mm	Sutter Instrument Company	FB245B	Utilizzato per realizzare l'elettrodo catodico
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo	rosso Gibco - Life Technologies	14175-095
Pinza Moloney	Roboz	RS-8254	seghettata; leggera curva; Pinzetta Dumont da 4,5" di lunghezza
5/45	Roboz	RS-5058	Modello #5, angolo di 45 gradi; .10 x .06 mm di dimensione della punta; 109 mm di lunghezza
Micropinze Bonn, 1x2 denti	Roboz	RS-5172	Piattaforma di legatura; 1x2 denti, 0,12 mm di lunghezza; 3,75" di lunghezza; 0,3 mm di larghezza della punta