Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

Sommario

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte dal sangue periferico mediante una strategia di riprogrammazione episoma based e inibitori delle istone deacetilasi.

Abstract

Questo manoscritto illustra un protocollo per la creazione efficiente umani indotti cellule senza integrazione staminali pluripotenti (iPSCs) da sangue periferico mediante plasmidi episomiale e istone deacetilasi (HDAC). I vantaggi di questo approccio includono: (1) l'uso di una quantità minima di sangue periferico come materiale di base; (2) nonintegrating vettori di riprogrammazione; (3) un metodo conveniente per la generazione di vettori iPSCs liberi; (4) un singolo trasfezione; e (5) l'uso di piccole molecole per facilitare riprogrammazione epigenetica. In breve, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono isolati da campioni salasso di routine e poi coltivate in fattori di crescita definiti per produrre una popolazione di cellule progenitrici degli eritrociti altamente proliferativo che è notevolmente suscettibile di riprogrammazione. Nonintegrating, plasmidi episomiale nontransmissible esprimono OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, LIN28A, e un p53 breve tornante (sh) RNA sono Introdced negli eritroblasti ottenuti tramite un singolo nucleofection. Cotrasfezione di un episoma che esprime migliorato proteina fluorescente verde (eGFP) permette una facile identificazione delle cellule trasfettate. Un plasmide replica carenti separata esprimono Epstein-Barr antigene nucleare 1 (EBNA1) viene anche aggiunto alla miscela di reazione per l'aumentata espressione di proteine ​​episomiale. Le cellule trasfettate sono poi piastrate su uno strato di fibroblasti embrionali di topo irradiati (iMEFs) per continuare la riprogrammazione. Appena colonie IPSC-simili vengono ordinate circa dodici giorni dopo nucleofection, inibitori HDAC vengono aggiunti al mezzo per facilitare rimodellamento epigenetica. Abbiamo trovato che l'inclusione di inibitori HDAC aumenta regolarmente la generazione di colonie IPSC completamente riprogrammato per 2 volte. Una volta che le colonie IPSC presentano tipico di cellule staminali embrionali umane (hESC) morfologia, sono gentilmente trasferiti in piastre di coltura singoli Imef-rivestite di tessuto per la continua crescita ed espansione.

Introduzione

iPSCs sono derivati ​​da tessuti somatici attraverso l'espressione ectopica di un insieme minimo di geni pluripotenza. Questa tecnica è stata inizialmente dimostrata dalla trasduzione retrovirale di fibroblasti umani con OCT4, SOX2, Klf4, e cMyc, che sono altamente espressi nello stato pluripotenti ^1. Questi transitoriamente espressi "fattori di riprogrammazione epigenetica" alterano il paesaggio e profilo di espressione genica della cellula bersaglio analogo alle cellule staminali embrionali umane ^2. Una volta creato, iPSCs potenzialmente può essere differenziato in qualsiasi tipo di tessuto per ulteriori indagini. Così, e....

Protocollo

Scritto consenso informato, come approvato dai Institutional Review Boards del Fred Hutchinson Cancer Research Center e il Children "s Hospital di Filadelfia, è stato ottenuto da pazienti prima di raccogliere campioni di sangue periferico. Sono state rispettate tutte le linee guida istituzionali. Tutti gli esperimenti sugli animali, tra cui la generazione MEF e formazione di teratoma è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale.

1. Ficoll Separazione dei PBMC ed espansione degli eritroblasti - Giorno 0

1. Diluire sangue periferico 1: 1 con Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). In un tubo da 1....

Risultati

Tre giorni dopo nucleofection e prima placcatura cellule nucleofected sul iMEFs, l'efficienza del nucleofection successo dovrebbe essere stimata mediante microscopia a fluorescenza per eGFP. La Figura 1 mostra un tipico esperimento nucleofection con circa il 5-10% della popolazione totale di cellule che esprimono eGFP.

Colonie riprogrammato IPSC cominceranno ad apparire circa due settimane dopo nucleofection. Le colonie sono generalmente circolare con bordi ben definiti e po.......

Discussione

Per successo generazione IPSC quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi avvertimenti importanti che devono essere considerati. Durante la fase di espansione eritroblasti, il programma di cambiamento dei media deve essere rigorosamente rispettata, come deviazioni possono portare alla stimolazione inefficiente della popolazione di cellule progenitrici bersaglio e una minore efficienza di generazione IPSC. È importante fare nuovo mezzo di espansione con desametasone fresca ad ogni cambio di supporto; e il mezzo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Conservare a 4 °C. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Negozio a 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Negozio a 4 °C.
siero fetale bovino (FBS)	Life Technologies	10437028	Store a -20 ° C fino al momento del bisogno. Scongelare, aliquotare, conservare a 4 °C.
dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Conservare a temperatura ambiente.
QBSF-60 terreno senza siero	Fisher Scientific	50-983-234	Negozio a 4 °C.
penicillina/streptomicina	Life Technologies	15140122	Store a 4 °C.
Kit Nucleofector Linea Cellulare V	Lonza	VCA-1003	Conservare a 4 °C.
Soluzione di gelatina al 2%	Sigma-Aldrich	G1393	Conservare a 4 gradi C, liquefare in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Negozio a 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Negozio a 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Negozio a 4 °C.
L-glutammina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquota, congelare a -20 °C.
aminoacidi non essenziali (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Conservare a 4 gradi C, al riparo dalla luce.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store a 4 °C.
KnockOut siero di ricambio	Life Technologies	10828-028	Aliquota, congelare a -20 °C.
piruvato di sodio, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Conservare a 4 °C.
bicarbonato di sodio, 7,5%	Life Technologies	25080094	conservare a 4 °C.
fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Produrre 10 mg/ml di stock in DPBS, aliquotare, congelare a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
butirrato di sodio	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Fare 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquota, congelare a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
hES Clonazione e clonazione cellulare Integratore per il recupero	Stemgent	01-0014-500	Conservare a -20 ° C fino al momento del bisogno. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
Matrigel BD BD	Biosciences	35-4277	Scongelamento notturno sul ghiaccio a 4 ° deg; C, aliquotare in provette pre-raffreddate utilizzando puntali per pipette pre-raffreddati. Conservare a -20 ° C fino al momento del bisogno. Scongelare a 4 gradi C, utilizzare immediatamente.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquota, congelare a -20 °C.
acido ascorbico, in polvere	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Produrre 5 mg/ml in DPBS, filtro sterile, conservare a 4 °C.
fattore di cellule staminali umane ricombinanti (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Marca 100 μ g/m di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
interleuchina umana ricombinante 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Marca 100 μ g/ml di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
eritropoietina (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Produce 1000 U/ml di stock in SFEM, aliquota, congelare a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
fattore di crescita insulino-simile umano ricombinante 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Marca 100 μ g/ml di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M7522	Produce 1000x stock (100 mM) in DPBS.
desametasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Fare 50x stock (50 μ M) in DPBS, filtro sterile, conservare a 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Produce 2.000x stock (400 mM) in DPBS, aliquota, congelare a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.
piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti	Fisher Scientific	08-772-29
provetta conica da 15 ml	Sarstedt	62553002
provetta Eppendorf da 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Fisher Scientific	08-772-1B
piastre per coltura a pozzetti da 35 mm	BD Biosciences	353001
Pipette sierologiche monouso da 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Pipette sierologiche monouso da 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Pipette sierologiche monouso da 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l puntali per pipette, puntali barriera	Genessee	24-404
pipette in vetro Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
pipetta ausiliaria	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624