Articolo metodologico

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine ​​degradazione

DOI:

10.3791/52021

⸱

6 novembre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un robusto test biologico per quantificare il tasso relativo di proteolisi da parte del sistema ubiquitina-proteasoma. La lettura del saggio è il tasso di crescita del lievito in coltura liquida, che dipende dai livelli cellulari di una proteina reporter che comprende un segnale di degradazione fuso con un marcatore metabolico essenziale.

Abstract

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Proteina degradazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è un importante meccanismo di regolazione per le proteine ​​omeostasi in tutti gli eucarioti. L'approccio standard per la determinazione intracellulare degradazione delle proteine ​​si basa su test biochimici per seguire la cinetica di declino proteine. Tali metodi sono spesso laboriosa e che richiede tempo e quindi non suscettibili di esperimenti volti a valutare diversi supporti e condizioni di degrado. In alternativa, sono stati sviluppati saggi di crescita a base di cellule, che sono, nel loro formato convenzionale, saggi end-point che non può determinare quantitativamente relativi cambiamenti nei livelli di proteina.

Qui si descrive un metodo che determina fedelmente le variazioni dei tassi di degradazione delle proteine ​​da loro accoppiamento con lievito cinetica di crescita delle cellule. Il metodo si basa su un sistema di selezione stabilito dove uracile Auxotrofia di URA3 -deleted cellule di lievito viene salvato da una proteina reporter esogena espressa, Composto da una fusione tra il gene URA3 essenziale e determinante degradazione (degron). La proteina reporter è progettato in modo che la sua velocità di sintesi è costante mentre la sua velocità di degradazione è determinata dal degron. Come la crescita delle cellule in terreno uracile-carente è proporzionale ai relativi livelli di URA3, cinetica di crescita sono del tutto dipendenti dalla degradazione delle proteine ​​giornalista.

Questo metodo di misura con precisione variazioni di intracellulari cinetica di degradazione delle proteine. E 'stato applicato a: (a) valutare il contributo relativo dei fattori-ubiquitina coniugare note alla proteolisi (b) E2 coniugare enzima struttura-funzione analizza (c) Identificazione e caratterizzazione di nuovi degrons. L'applicazione del sistema basato URA3 degron- trascende campo degradazione delle proteine, come può anche essere adattato ai cambiamenti di monitoraggio dei livelli di proteine ​​associate con funzioni di altre vie cellulari.

Introduzione

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Il sistema di degradazione ubiquitina-proteasoma è una grande macchina di regolamentazione, che è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi delle proteine ​​in tutti gli eucarioti. Il gruppo di continuità coniuga inizialmente più molecole di ubiquitina ad una proteina bersaglio dopo che la proteina poli-ubiquitina-tag è degradata dal proteasoma 26S. Nella maggior parte dei casi, il fattore limitante per l'ubiquitina mediata degradazione è ubiquitinazione substrato, mediato da E2 coniugando enzimi e E3 legatura enzimi (E3 ligasi) 1. Di conseguenza, la stabilità intracellulare di specifiche proteine ​​riflette la loro suscettibilità alla ubiquitina-coniugazione e l'attività dei loro enzimi ubiquitinazione affini.

Ligasi E3 sono i componenti di riconoscimento del substrato principali del gruppo di continuità. Come tali, questi enzimi riconoscono degrons nei loro substrati che sono o assenti o non esposto nelle loro controparti stabili 2. Per esempio, molti regolatori del ciclo cellulare must essere sintetizzato e degradato in maniera temporalmente specifico al fine di mantenere la progressione del ciclo cellulare in ordine. La degradazione di queste proteine ​​è spesso controllata dalla fosforilazione, mediata da cellule di segnalazione chinasi regolate 3,4. D'altra parte, le proteine ​​aberrante piegati sono riconosciuti attraverso degrons criptici. Si tratta di regioni che normalmente sono nascosti nella struttura nativa e sono esposti su struttura perturbazione. Tali degrons comprendono domini idrofobici 5-7 e segmenti intrinsecamente disordinati 8.

Dalla scoperta fondamentale della ubiquitina-sistema di degradazione delle proteine ​​e la caratterizzazione dei suoi fondamentali nei lisati di reticolociti 9, genetica del lievito è stato determinante nella scoperta molti dei componenti del sistema ubiquitina 10. Il successo di lievito come organismo modello per l'analisi sistematica della degradazione proteica dal gruppo di continuità è dovuto principalmente al fatto che il gruppo di continuità è altoly conservato in tutti gli eucarioti 4, unita alla loro riconducibilità come sistema sperimentale. In effetti, i sistemi a base di lievito sono comunemente impiegati per decifrare i meccanismi di azione della macchina ubiquitinazione.

Studiando proteina degradazione mediante biochimici solito richiede la preparazione di estratti cellulari. Mentre le proteine ​​cellulari animali possono essere estratti in condizioni relativamente blande che conservano le interazioni e la funzione della proteina, la presenza di una parete cellulare robusto in lievito 11 richiede condizioni perturbazione considerevolmente più dure che possono influenzare il recupero delle proteine. In effetti, diverse modalità di rottura delle cellule di lievito variano notevolmente nella loro capacità di recuperare proteine ​​intatte in quantità che rappresentano correttamente la loro abbondanza relativa cellulare. Ulteriore inesattezza è inerente i diversi metodi utilizzati per la determinazione del tasso di degradazione di proteine ​​specifiche: a base di etichettatura relativa ad esperimenti metabolici "pulse-chase" seguita da immunoprecipitation, per isolare proteine ​​specifiche 12, spesso non è strettamente quantitativo. Così, quando la degradazione delle proteine ​​viene confrontato con questo metodo, estrema cautela deve essere esercitata nell'interpretazione dei risultati. Per ovviare a questo inconveniente, un cicloesimmide alternativa (CHX) test inseguimento può essere impiegato 12. In questo saggio, l'inibitore di traduzione è aggiunta a colture cellulari e cambiamenti temporali nei livelli di proteine ​​allo steady-state vengono successivamente monitorati. Tuttavia, l'utilizzo di CHX è limitato alle proteine ​​con emivite relativamente brevi (<90 min), l'inibizione a lungo termine della sintesi proteica è citotossico. In particolare, entrambi i saggi suddette richiedono l'uso di anticorpi specifici per proteine ​​che non sono sempre disponibili.

Per superare queste limitazioni tecniche, i ricercatori hanno sviluppato diversi approcci che non richiedono l'estrazione delle cellule e la manipolazione diretta di proteine. Un approccio si basa sulla creazione di yea auxotrophicceppi st, ottenuti per delezione di geni codificanti enzimi metabolici essenziali. Tali geni includono HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, codifica per gli enzimi necessari per la biosintesi degli aminoacidi, così come URA3 che codifica OMP decarbossilasi (URA3), un enzima essenziale della pirimidina ribonucleotide biosintesi. URA3 è stato ampiamente utilizzato in studi di degradazione proteica. In questi test, espressione costitutiva di URA3 salva la crescita delle cellule URA3 in uracile con deficit medio 13. Di conseguenza, destabilizzare URA3 attraverso la fusione di un degron può ridurre la crescita delle cellule su terreno minimo privo di uracile. Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi di degradazione delle proteine, compresa l'individuazione di degrado determinanti 5, E3 ligasi 14 e ubiquitinazione ausiliario fattori 15 e la scoperta di nuovi UPS degrons 16. Tutti questi metodi impiegati crescita cellulare su piastre di agar come test di lettura. Tuttavia, tche il criterio di crescita (crescita positivo / negativo), mentre la robusta ed efficiente, è per lo più qualitativa e non fornisce informazioni quantitative che è importante per valutare la potenza di un degron o il contributo relativo dei diversi fattori di degrado ausiliari.

Abbiamo quindi messo a punto e utilizzato vettori di lievito e metodi di screening che consente un'analisi sistematica e quantitativa di degradazione delle proteine ​​da parte del URA3 -degron sistema di fusione. Il protocollo si basa su un saggio di facile impugnatura che misura la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettive (Gils) e sulla generazione delle curve di crescita standard. Cinetica di crescita del lievito sono caratterizzate da tre fasi principali - il ritardo, l'esponenziale (log) e la fase stazionaria. Calcolo della cinetica di replicazione del lievito durante la fase log in condizioni selettive, che è determinata dai livelli di espressione della URA3-degron, fornisce un imparziale misurazione quantitativa of degradazione delle proteine. Questo metodo può essere applicato a misurare e comparare i tassi di degradazione di substrati multipli UPS contemporaneamente in più ceppi e in diverse condizioni.

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Protocollo

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Cultura 1. Cella

  1. Trasformare le opportune cellule di lievito auxotrofi, come Try467 (Tabella 2), con un plasmide contenente (a) un URA3 -degron fusione e (b) un indicatore metabolico aggiuntivo per la selezione plasmid e manutenzione.
    NOTA: Un esempio di un plasmide adatto è YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) Questo è un plasmide integrativo di lievito contenente una proteina di fusione comprendente Deg1 - un degron derivato dalla trascrizione di lievito. fattore Mat2 17, FLAG epitopo - per il rilevamento mediante immunoblotting, Vma12 - una proteina stabile ER, e URA3 15,18 (Figura 3A). (Per plasmidi utilizzati in questo studio e per ulteriori esempi di plasmidi adatti Vedere la Tabella 3).
  2. Per la selezione plasmide e la manutenzione, mantenere le cellule in piastre di agar in un sintetico adatto Defined (SD) medium privo di marcatori di selezione amino acidi 19 (ad esempio, Deg1 -UV è selezionato e mantenuto sotto SD-LYS terreni selettivi).
  3. Grow cellule O / N a 30 ° C in un mezzo selettivo SD adatto per la manutenzione plasmide fino al raggiungimento di una fase stazionaria. Far crescere le cellule in provette o in una piastra a 96 pozzetti, a seconda del numero di campioni da esaminare (sezione 2).

2. Preparazione delle cellule per l'analisi

  1. Quando un piccolo numero di campioni (N≤15) sono da dosare, diluire le cellule e sostituire il mezzo come segue:
    1. Diluire 50 ml di cellule da un / cultura N O con 150 ml di SD media per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti (fondo chiaro). Nota, il primo campione è designato come vuota contiene solo medio.
    2. Determinare i valori di OD 600 dei campioni nella piastra a 96 pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre.
    3. Calcolare il diametro effettivo 600 in ciascun pozzetto moltiplicando il valore OD 600 per il fattore di diluizione (x4), da which il valore della lettura vuota viene sottratto. Normalizzare i valori ottenuti dividendo per 0,55 per ottenere un percorso di lunghezza calcolata di 1 cm secondo la legge di Lambert-Beer. Nota, questo valore è costante durante la misurazione del diametro esterno 600 di 200 microlitri di cellule in una piastra da 96 pozzetti standard.
    4. Il volume esatto necessario per ottenere cellule di lievito in quantità equivalente ad OD 600 di 0,25 e trasferirlo in una provetta Eppendorf.
    5. Centrifugare le cellule ad alta velocità (12.000 xg) per 1 min.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno selettivo appropriato (vedere paragrafo 3.1) per ottenere OD 600 di 0,25.
    7. Trasferire 200 ml di ceppi diluiti in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
  2. Quando un gran numero di campioni (N> 15) sono da esaminare, diluire le cellule e sostituire il mezzo senza preventiva OD 600 di misura, come segue:
    1. Trasferire 10 ml di cellule stazionarieadulto O / N in una piastra a 96 pozzetti in una nuova piastra a 96 pozzetti contenenti 190 ml (diluizione 1:20) dei terreni selettivi appropriati (vedere paragrafo 3.1).

3. Cinetica di crescita in coltura liquida In condizioni selettive (Gils)

  1. Utilizzare i seguenti supporti per le misure di crescita con il giornalista URA3-degron:
    1. Per i controlli positivi di crescita del lievito in condizioni non restrittive, uso plasmide supporto SD selettivi (vedere paragrafo 1.2). Se non è richiesta la selezione plasmide, per esempio, quando si utilizza un plasmide integrativo come Deg1 -UV, medio SD contenente tutti gli aminoacidi necessari (SD completo) può essere utilizzato.
    2. Per i campioni sperimentali di misura della crescita in condizioni restrittive, utilizzare SD-URA medio.
  2. Impostare un lettore di micropiastre multimodale a:. Una temperatura di incubazione di 30 ° C, OD 600 intervalli di misurazione di 15 minuti, e un cicli orbitali e lineari agitando di 1 min ogni sette min
    NOTA: Questo dual-mode agitazione è stato ottimizzato per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule; tuttavia, altri modi di agitazione o addirittura nessun scuotimento può funzionare così.
  3. Incubare le cellule a 30 ° C in un lettore di micropiastre O / N o finché le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria (12-24 ore).
  4. Esportare i dati grezzi in un file di foglio di calcolo.
  5. Determinare la cinetica di crescita del lievito utilizzando MDTcalc, un software personalizzato che calcola il tempo minimo (in ore) per le cellule di raddoppiare il loro numero di abitanti (minimo tempo di raddoppio (MDT), per dettagli vedere paragrafo 4).

4. Calcolo del minimo tempo di raddoppiamento (MDT): Principi dell'algoritmo MDTcalc

NOTA: Principi dell'algoritmo MDTcalc, utilizzando un campione rappresentativo di cellule di lievito Try467 (Tabella 2) derivate in SD multimediale completa, sono illustrati nella Tabella 1 e Figura 1, che mostra un foglio di calcolo di dati e di crescita trame, respecmente.

  1. Sottrarre OD 600 valori vuoti, ottenuti nella rispettiva bene, da ciascuno dei valori ottenuti nel pozzetto. Dividere le differenze risultanti da 0,55 (per piastre a 96 pozzetti) per correggere la lunghezza del percorso ottico. Tracciare i valori finali (Tabella 1, Trans.) Contro il tempo per produrre la curva di crescita del lievito effettiva (OD 600 / h) (Figura 1A).
  2. Calcolare log 2 (OD 600) per ciascuno dei valori trasformati per convertire la fase di crescita logaritmica in una curva lineare (Figura 1B).
  3. Calcolare la pendenza di un intervallo di 10 punti temporali (N = 10) a partire dal tempo 0 e spostando contemporaneamente punto alla volta fino a N <10 (Tabella 1, Slope; Figura 1C).
  4. Calcolare il valore inverso di ciascuna pista per ottenere il tempo richiesto per la popolazione cellulare di raddoppiare (Tabella 1, 1 / pendenza; Figura 1C). Calcolare il minimo1 / valore di pendenza per determinare la MDT (Tabella 1, rettangolo nero; Figura 1C). Estrarre il MDT calcolato per le cellule nel campione (Tabella 1, 1 / Slope, rettangolo nero) dal l'intervallo di tempo selezionato (tabella 1, delineato dal rettangolo rosso, figure 1B, 1D).
    NOTA: Il tasso di crescita delle cellule su SD-URA media è inversamente proporzionale alla MDT.

5. Uso MDTcalc

  1. Copiare i file di programma integrati in una determinata cartella sul computer.
  2. Assicurarsi che il file di foglio di calcolo contenente i dati di crescita viene salvato e chiuso. Aprire il programma applicativo MDTcalc per vedere l'inizio viene visualizzata la schermata.
    1. Inserire le informazioni richieste, come mostrato nella Figura 2:
      1. Sotto 'Percorso file', cliccare sul rettangolo a destra per individuare il file di foglio di calcolo.
      2. Sotto 'nome foglio', scrivere il nome del foglio elettronico dove tegli dati grezzi si trova.
      3. Sotto 'Posizione di partenza', inserire la coordinata foglio di calcolo del tempo 0 del primo campione.
      4. Sotto 'Tempo colonna', inserire la lettera che definisce la posizione della colonna punto di tempo (tempo dovrebbe essere fornito in secondi).
      5. Sotto 'colonna vuota', inserire la lettera che definisce la posizione della colonna vuota (solitamente, ma non necessariamente in A1 della piastra a 96 pozzetti).
      6. Sotto 'valore OD', scegliere la trasformata OD 600 valore minimo richiesto per l'avvio di calcolo MDT (di solito ,15-0,25). L'impostazione di questo valore previene i calcoli di MDT per le colture in fase di latenza a causa di eccessiva diluizione in modo da MDT viene calcolato solo per i campioni che raggiungono il valore definito OD 600 o superiore.
    2. Una volta inserito l'ultimo valore, premere il pulsante 'Calcola' nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che la barra di avanzamento sulla destra cambia gradualmente green. Non aprire il file di foglio di calcolo durante il processo di calcolo.
    3. Esporta le due serie di dati che appaiono automaticamente sullo schermo al completamento del calcolo MDT in un foglio. Assicurarsi che i dati includono: (a) il valore MDT per ogni bene che supera il test minimo valore OD (come indicato nella sezione 5.2.1.6) e (b) il punto di tempo iniziale dell'intervallo da cui la MDT è stato calcolato (Inizio tempo).

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Risultati

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Indagare il ruolo degli enzimi della via Doa10 nella degradazione di un substrato giornalista

Per verificare la validità del metodo Gils è stato confrontato con un saggio degrado tradizionale. Questo esperimento valuta il contributo relativo di componenti della membrana ER-localizzato Doa10 E3-ligasi complessa 20,21 alla degradazione del substrato giornalista controllo di qualità delle proteine ​​Deg1- VU (Figura 3A). Il plasmide Deg1...

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Discussione

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Qui si descrive un saggio basato sulla crescita delle cellule per la determinazione del tasso di degradazione delle proteine ​​relativi, definiti "la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettiva" (Gils). Il test Gils ha diversi vantaggi: è semplice da configurare, l'acquisizione dei dati e l'analisi è semplice ed è estremamente modulare. Di conseguenza, Gils può essere applicata contemporaneamente a più campioni in un facile da usare formato di piastra multi-bene che può essere adatt...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Yuval Reiss e il Dr. William Breuer per aver esaminato criticamente il manoscritto e Omri Alfassy per aver contribuito allo sviluppo del test dello schermo Ura3-GFP. Ringraziamo anche il Dr. M. Hochstrasser e il Dr. R. Kulka per i plasmidi e i ceppi. Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia israeliana delle scienze (sovvenzione 786/08) e dalla fondazione scientifica binazionale Stati Uniti-Israele (sovvenzione 2011253).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Difco lievito base azotata senza amminoacidi e solfato di ammonioBD Biosciences233520Per la crescita del lievito su terreni minimi SD. Gli aminoacidi da fornire sono: Arginina, Istidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptofano
Solfato di ammonioSigma - AldrichA4418
GlucosioSigma - Aldrich16325
AdeninaSigma - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
Aminoacidipiù alti purezza disponibile 
Piastre a 96 pozzettiNunc167008È possibile utilizzare qualsiasi altra marca compatibile
Cicloesamide Sigma - AldrichC7698Batteria di lavoro 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO seriesTecanPer l'incubazione del lievito e le misure di OD600. È possibile utilizzare qualsiasi altro lettore a temperatura controllata compatibile.
Software sperimentaleMDTcalc

Riferimenti

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