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Articolo metodologico

L'infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l'analisi di differenziazione emopoietiche

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DOI:

10.3791/52022

⸱

20 ottobre 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In questo articolo

Sommario

La manipolazione dell'espressione genica temporale nelle cellule staminali embrionali (ESC) differenzianti può essere ottenuta utilizzando sistemi genici inducibili. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari è costosa e richiede tempo. Questo protocollo consente di ottenere una rapida espressione di un transgene in cellule derivate da ES in differenziazione e la successiva analisi della differenziazione ematopoietica a valle.

Abstract

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono un modello eccezionale per chiarire i meccanismi molecolari della differenziazione cellulare. Sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo delle cellule progenitrici ematopoietiche precoci (HPC). L'espressione genica nelle ESC può essere manipolata con diverse tecniche che consentono di determinare il ruolo delle singole molecole nello sviluppo. Una difficoltà è che l'espressione di geni specifici ha spesso effetti fenotipici diversi a seconda della loro espressione temporale. Questo problema può essere aggirato dalla generazione di cellule staminali embrionali che esprimono in modo inducibile un gene di interesse utilizzando tecnologie come il sistema transgenico inducibile dalla doxiciclina. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari inducibili è costosa e richiede tempo. Qui descritto è un metodo per disaggregare i corpi embrioidi (EB) derivati da ESC in sospensioni di singole cellule, infettare retroviralmente le sospensioni cellulari e quindi riformare gli EB appendendo la goccia. La differenziazione a valle viene quindi valutata mediante citometria a flusso. Utilizzando questo protocollo, è stato dimostrato che l'espressione esogena di un gene microRNA all'inizio del differenziamento delle ESC blocca la generazione di HPC. Tuttavia, quando espresso in cellule derivate da EB dopo la produzione del mesoderma nascente, il gene del microRNA migliora la differenziazione ematopoietica. Questo metodo è utile per studiare il ruolo dei geni dopo la derivazione di uno specifico tessuto dello strato germinale.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali murine (ESC) sono pluripotenti, rimangono indifferenziate e si autorinnovano in presenza della citochina Fattore Inibitorio della Leucemia (LIF)1. Dopo la sospensione della LIF, si differenzieranno spontaneamente in strutture tridimensionali (3D) chiamate corpi embrioidi (EB)2. L'architettura 3D consente lo sviluppo dei tre strati germinali ectoderma, endoderma e mesoderma, che in seguito danno origine ai tipi di tessuto maturo3. Le ESC sono un modello eccezionale per chiarire i meccanismi molecolari del differenziamento cellulare, in particolare lo studio dello sviluppo delle cellule progenitrici ematopoietiche precoci (HPC)4.

L'espressione genica nelle ESC può essere manipolata con diverse tecniche che consentono di determinare un ruolo delle singole molecole nello sviluppo. Una delle tecniche più comuni consiste nell'utilizzare la ricombinazione omologa per generare linee ESC, che mancano di un gene di interesse5,6. Ci sono anche un certo numero di tecniche che sono state utilizzate per sovraesprimere i geni. La prima tecnica utilizzata per modificare l'espressione genica nelle ESC è stata quella di infettarle con retrovirus ricombinanti7,8. Il gene di interesse, tuttavia, viene spesso silenziato poiché le ESC si differenziano in tipi di cellule progenitrici e mature. L'uso di lentivirus ha avuto successo nel limitare il silenziamento dei geni espressi viralmente9. Altri vettori virali utilizzati per la sovraespressione includono l'adenovirus e il virus adeno-associato10. Inoltre, le tecniche di trasfezione standard per introdurre stabilmente plasmidi di espressione sono ampiamente utilizzate per l'espressione del transgene ESC11. Una difficoltà con questi sistemi è che spesso l'espressione di un gene specifico ha effetti diversi a seconda della sua espressione temporale. Ad esempio, la proteina Smad1 influenza lo sviluppo delle cellule ematopoietiche in modo diverso durante le diverse fasi di sviluppo dell'EB12,13.

Questo problema può essere aggirato dalla generazione di ESC che esprimono inducibilmente un gene di interesse. Il sistema più comune per l'espressione inducitiva dei transgeni nelle ESC utilizza l'operone di resistenza alla tetraciclina di E. Coli (Escherichia coli). Sono stati sviluppati diversi sistemi di tetracicline. Una delle strategie più popolari è stata sviluppata da Kyba e colleghi14. Hanno generato una linea ESC (Ainv15), che ha il gene transattivatore della tetraciclina inversa inserito nel locus ROSA26 costitutivamente attivo. Un elemento di risposta alla tetraciclina (TRE), un sito LoxP a valle (locus di X-over P1 dal batteriofago P1) e una cassetta di neomicina senza promotore sono stati introdotti nel locus HPRT (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi) sul cromosoma X. Utilizzando un approccio di ricombinazione CRE, un gene di interesse, insieme a un promotore eucariotico per guidare l'espressione del gene di resistenza alla neomicina, può essere inserito nel sito LoxP. Gli ESC correttamente mirati vengono isolati mediante selezione G418. Questi cloni mirati devono quindi essere testati per l'espressione inducibile dalla doxiciclina (o tetraciclina) del transgene. Questo approccio ha generato con successo linee ESC che esprimono induttivamente HoxB4, Stat5, SCL e Smad714-17. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari inducibili richiede molto tempo. Qui descritto è un metodo per disaggregare i corpi embrioidi (EB) derivati da ESC in sospensioni di singole cellule, infettare retrovialmente le sospensioni cellulari in diversi giorni di sviluppo e quindi riformare gli EB appendendo la goccia. La differenziazione a valle viene successivamente valutata mediante citometria a flusso. In questo articolo viene mostrato un esempio di come l'espressione dei miRNA nelle cellule derivate da EB influenzi il differenziamento ematopoietico. Questo metodo è utile per studiare il ruolo dei geni dopo la derivazione di uno specifico tessuto dello strato germinale.

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Protocollo

1 embrionali Corpo (EB) Formazione

  1. Gelatina-adattare CES che si sono mantenuti su fibroblasti di embrione di topo (MEF). Passage CES 3 volte su 6 e piastra di coltura dei tessuti rivestiti con lo 0,1% di gelatina per rimuovere MEF.
    1. Grow celle ESC mezzi di manutenzione con LIF per mantenere le cellule indifferenziate (Tabella 1). Assicurarsi che le cellule non superano mai il 80% di confluenza. Utilizzare passaggio basso (10 o meno passaggi dopo la rimozione dal MEF) per la differenziazione delle cellule.
  2. Il giorno prima del CES sono coltivate per EB differenziazione, passaggio le cellule in modo che saranno circa il 50-70% confluenti il ​​giorno successivo. Continuare coltura di cellule in ESC terreno di mantenimento per mantenere pluripotenza delle cellule.
  3. Il giorno della differenziazione, mezzi di manutenzione ESC aspirare e lavare con 1 ml di tampone fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, e 11,9 mM tampone fosfato, pH 7.4) per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
    1. Aggiungere 200 ml di 0,25% trypsin / EDTA a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 3 min.
    2. Disattivare la tripsina / EDTA con 800 ml di mezzi di differenziazione. Pipettare su e giù in un 2 ml pipetta sierologica con una punta p200 per rompere-le cellule in una sospensione di cellule singole. Assicurarsi che la punta P200 si adatta comodamente alla fine in modo multimediale non va tra la pipetta e l'interfaccia punta.
    3. Pipettare su e giù circa 5-10 volte. Fare attenzione a non creare bolle durante il pipettaggio.
  4. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Portare al volume di 10 ml con PBS. Centrifugare a 315 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il surnatante. Lavare due volte con 5 ml di PBS per rimuovere il supporto restanti contenenti LIF. Centrifugare come al punto 1.4 per ogni lavaggio.
    1. Risospendere il pellet cellulare finale in 2 ml di mezzi di differenziazione (Tabella 2).
  6. Contare le cellule con un contatore emocitometro o cellulare e piastra 6,000-10,000 cellule / ml in una piastra Petri 10 centimetri(Cultura non-tessuto trattato).
    1. Determinare le esatte cellule / ml empiricamente per ogni linea ESC. Utilizzare piastre di Petri sterili normalmente utilizzati per il lavoro batterica o piastre di aderenza basso.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati di differenziazione, EBS dovrebbero costituire ambiti che rimangono in sospensione senza associare alla piastra. Prova diverse marche di piastre per trovare quelli con meno aderenza.
    2. Incubare i CES di differenziazione in un tessuto C cultura incubatore 37 ° con il 5% di CO 2.
Reagente Stock Concentrazione finale Volume Azienda Numero di catalogo
DMEM 1x 410 ml S Igma / Aldrich D5796
FBS (ES schermato) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Non essenziali Aminoacidi 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutammina 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / streptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanolo 14.3 M 114 mM 4 microlitri Sigma / Aldrich M3148
Leucemia inibitorio Factor (LIF) 10 7 unità / ml 1.000 unità / ml 50 microlitri Millipore ESG1107
ONTENUTO "> Tabella 1: ESC Manutenzione Media.

Reagente Stock Concentrazione finale Volume Azienda Numero di catalogo
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (User sottoposti a screening per la differenziazione ottimale) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Non essenziali Aminoacidi 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutammina 100x 1x 5 ml Vita Technologie 35050
Penncillin / streptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanolo 14.3 M 114 mM 4 microlitri Sigma / Aldrich M3148

Tabella 2: Differenziazione Media.

2. preparazione di cellule EB per infezione da virus

  1. Nella fase di sviluppo desiderato (tra il giorno 2 e il giorno 3), trasferire i EBs dalla piastra di Petri 10 centimetri di tubo da 15 ml. Lavare la piastra con 5 ml di PBS e aggiungere il lavaggio al tubo conico.
  2. Pellet EBS a 315 xg a temperatura ambiente per 5 min. Lavare le cellule EB con 5 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco delle cellule scongelati (contenente enzimi proteolitici e collagenolitica) e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 ° (o incubatore) per 30 minuti con OCCagitazione asional (da sfogliare o luce vortex).
  4. Aggiungere 1 ml di media differenziazione. Pipettare su e giù con una pipetta 2 ml con una punta p200 pipetta. Collocare la provetta nel 37 ° C bagnomaria ancora per 30-60 min.
  5. Centrifugare le cellule a 315 xg per 5 minuti e lavare le cellule con PBS.

3. Infezione da virus

  1. Risospendere le cellule in 1,5 ml di media differenziazione. Trasferire la sospensione cellulare a un non-tessuto piastra di coltura trattata 6-bene.
  2. Preparare il retrovirus con tecniche standard prima del tempo. Aggiungere 5 a 100 ml di surnatante virale alle cellule seconda titolo virale. Non aggiungere polibrene per migliorare infezione come questo inibisce la successiva riforma della EBS.
  3. Spinoculate le cellule con virus mediante centrifugazione a 2120 xg per 90 min a temperatura ambiente.

4. Differenziare virali Celle EB infetti in Drops Hanging

  1. Aggiungere 2 ml di media differenziazione in ciascun pozzetto di infected EB sospensione cellulare.
  2. Pipettare 3,5 ml di sospensione cellulare infetto EB in un serbatoio di reagente sterile per multipipettors. Utilizzare il multipipettor da Dispensare 15-20 righe di otto 20 ml gocce sul coperchio rovesciato della piastra di 15 centimetri Petri.
  3. Aggiungere 10 ml di PBS sterile o acqua per la metà inferiore della piastra Petri. Poi invertire il coperchio con le gocce e posto sulla piastra di Petri. Assicurarsi che le gocce sono appesi a testa in giù dal coperchio con PBS o acqua sotto per mantenere la camera umidificata.
  4. Porre le capsule nella 37 ° C tessuto cultura incubatore con il 5,0% di CO 2.
  5. Dopo 2 giorni, raccogliere EBs formate nel appeso gocce di invertire coperchio e lavaggio con 4.5 ml di mezzi di differenziazione.
    1. Mezzi di trasferimento e EBs ad una nuova cultura 10 centimetri non-tessuto Petri piatto. Lavare il coperchio ancora una volta con 3 ml di mezzi di differenziazione e trasferimento alla piastra 10 cm.
  6. Celle di raccolta per l'analisi mediante citometria a flusso dopo un totale di 8giorni di cultura a partire dal trasferimento iniziale delle cellule di supporto differenziazione (-LIF).

5. Celle Preparazione per l'analisi Citofluorimetro

  1. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 10 ml. Lavare la piastra con 5 ml di PBS e trasferire allo stesso tubo conico.
  2. Cellule pellet a 315 x g. Lavare pellet con 10 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco delle cellule scongelati e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 ° per 30 minuti con agitazione occasionale. Per il rilevamento di alcuni antigeni di superficie delle cellule, tripsina può essere utilizzato in sostituzione.
  4. Aggiungere 1 ml di mezzi di differenziazione e pipettare su e giù con una pipetta 2 ml. Utilizzare una punta p200 alla fine della pipetta per contribuire a spezzare-up digerito EB in sospensione di cellule singole.
    1. Posizionare il tubo in un bagno di 37 ° C l'acqua di nuovo per 60 minuti in modo che le proteine ​​integrali di membrana di riciclare alla superficie cellulare.
  5. Agglomerare cellule a 315 xg per 5 min.
  6. Lavare le cellule with 0,1% di sieroalbumina bovina Fraction V (BSA) preparato in PBS (PBS / BSA) e incubare le cellule con specifiche fluorescente contrassegnati anticorpi.

6. Citometria a flusso Analisi per ematopoietiche Progenitori

  1. Mettere 10 6 cellule EB derivate in un 5 ml 12 x 75 mm tondo tubo inferiore. Per regolare citofluorimetro impostazioni di compensazione, utilizzare sfere di compensazione secondo le istruzioni del produttore.
  2. Cellule pellet a 315 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in soluzione residua PBS / BSA nel tubo.
  3. Per la rilevazione ESC HPC, incubare le cellule con anticorpi fluorescenti marcato: anti-topo CD41-PE (R-Phycoerytherin) e anti-topo CD117 (CKIT) -APC / Cy7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. Diluire gli anticorpi 1: 100 in PBS / BSA. Aggiungere 100 ml di anticorpo diluito per ogni campione. Determinare la corretta diluizione di anticorpi per ogni fornitore, clone, e lotto o anticorpi. Determinare diluizione ottimale per l'etichettatura di cellule individualmente.
  4. Incubare campioni su ghiaccio al buio per 30 min.
  5. Aggiungere 2 ml di PBS / BSA e pellet cellule a 315 xg per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 300 ml di PBS o un altro buffer isotonico.
  7. Filtro risospese cellule attraverso un tappo filtro cella (0.35 mM) per rimuovere grandi aggregati di cellule.
  8. Analizzare le cellule su un citometro a flusso.

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Risultati

In questi studi gelatinizzati RW4 (derivato dal ceppo del mouse 129X1 / SVJ CES) sono stati utilizzati. EBs sono stati isolati in 3 giorni di differenziazione. Per ottenere i migliori risultati EBS devono essere sferica e non aderente (Figura 1A, B). Dopo spinoculation con il virus co-esprimono la GFP marcatore fluorescente con un gene di interesse, EBS sono stati riformati secondo il metodo della goccia pendente. EBs sono stati riformati con successo da sospensioni cellulari preparate da 2,0, 2,5, e 3,...

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Discussione

Come discusso in precedenza, cloni ESC inducibile che esprimono un gene di interesse possono essere generati utilizzando sistemi di doxiciclina, tuttavia, la generazione di queste linee è ad alta intensità di tempo e di lavoro. Descritto in questo protocollo è un metodo per esprimere un gene di interesse in sospensione di cellule singole preparate con ESC derivato EBS. Queste cellule infette vengono poi riformate in EBs da appendere goccia per esaminare la successiva differenziazione. Nell'esempio (figura 3)...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da un progetto pilota e da sovvenzioni di fattibilità dall'Indiana University School of Medicine Center (IUSM) per l'eccellenza in ematologia molecolare (NIDDK, 5P30DK090948). Ulteriori finanziamenti sono stati forniti da una sovvenzione per il miglioramento biomedico da parte di IUSM. Vorremmo ringraziare la dottoressa Karen Cowden Dahl per aver commentato il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMSigma/AldrichD5796
β-mercaptoetanoloSigma/AldrichM3148
FBS (ES Screened)HycloneSH30070.03E
FBS (Definito)HycloneSH30070.03
Aminoacidi non essenzialiLife Technologies11140
L-GlutamminaLife Tecnologie35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Tripsina/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Tripsina/EDTALife Technologies25200
Piastre per colture tissutali Falcon 6- pozzettoFisher Scientific08-772-1B
Falcon Piastre non trattate 6 pozzettiFisher Scientific08-772-49
Falcon Petri piatto 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Falcon Petri piatto 15 cmFisher Scientific08-757-148
Falcon Tubo 5 mlFisher Scientific14-959-11A
Falcon Tubo 5 ml con tappoFisher Scientific08-771-23
Certificati sterili bianchiU.S.A. Scientific111-0700
Ratto anti-topo CD41 PE-coniugatoBiolegend133906
Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-coniugatoBiolegend105826
RW4 ESCATCCCRL-12418
filtrante

Riferimenti

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