L'analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Sommario

Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l'infortunio.

Abstract

Lesione cerebrale ischemica è tra le condizioni più comuni e devastanti compromettenti corretto funzionamento del cervello e porta spesso a persistenti deficit funzionali nei pazienti affetti. Nonostante gli sforzi di ricerca intensiva, non esiste ancora una opzione di trattamento efficace disponibile che riduce il danno neuronale e protegge i neuroni nelle aree ischemiche dalla morte secondario ritardo. La ricerca in questo settore in genere comporta l'uso di modelli animali elaborati e problematici. Culture fetta organotipica Entorhino-ippocampale sfidati con deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) sono stabilite in modelli in vitro che imitano l'ischemia cerebrale. L'aspetto innovativo di questo studio è che i cambiamenti dei vasi sanguigni cerebrali sono studiati in aggiunta ai cambiamenti neuronali e la reazione sia del compartimento neuronale e il compartimento vascolare possono essere confrontati e correlati. I metodi presentati in questo protocollo ampliare notevolmente le potenziali applicazioni della oganotypic approccio cultura fetta. L'induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con mezzi relativamente semplici in culture fetta organotipiche e porta a danni affidabile e riproducibile nel tessuto neurale. Ciò è in netto contrasto con i complicati e problematici esperimenti sugli animali che inducono ictus e ischemia in vivo. Ampliando l'analisi per comprendere lo studio della reazione del sistema vascolare potrebbe fornire nuovi modi su come conservare e ripristinare le funzioni cerebrali. L'approccio della cultura fetta presentato qui potrebbe trasformarsi in uno strumento interessante e importante per lo studio del danno cerebrale ischemico e potrebbe essere utile per testare potenziali misure terapeutiche volte a neuroprotezione.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale è particolarmente sensibile ad una perdita o riduzione di ossigeno e glucosio da parte del sistema vascolare. Anche un piuttosto breve interruzione della fornitura di sangue al cervello può indurre una perdita permanente della funzione delle aree cerebrali interessate conducono alle tipiche sindromi ictus. Oltre alla perdita neuronale nelle aree colpite primari, di solito si aggiunge la perdita neuronale ritardata attraverso danni secondari. Purtroppo fino ad oggi, nessun trattamento neuroprotettivo per la riduzione della morte neuronale secondaria era disponibile ^1. Le attività di ricerca per lo studio dei meccanismi di danno secondario si basano su l'uso di modelli animali di ischemia cerebrale come mezzo occlusione dell'arteria cerebrale e varie tecniche di occlusione trombotica (per una recente rassegna vedi punto ^2). In parallelo, anche a causa di limitazioni e problemi etici con l'uso di modelli animali, la cultura fetta organotipica di vari tessuti del sistema nervoso centrale sono stati utilizzati che permettono la study delle reazioni neuronali a vari tipi di lesioni ^3-5.

Per studiare la reazione neuronale in condizioni che mimano lesione cerebrale ischemico, è stato sviluppato il sistema di modello di deprivazione di ossigeno glucosio (OGD). In questo modello, culture fetta sono temporaneamente esposti a un mezzo che manca di glucosio ed è stata equilibrata con gas azoto in assenza di ossigeno. Con tale trattamento, è possibile indurre danno neuronale e la perdita che è piuttosto simile a quella osservata dopo danno ischemico in vivo ^{6, 7.} Nell'ippocampo, tale trattamento induce la perdita neuronale specificamente nel CA1, ma non nella zona CA3 e giro dentato dell'ippocampo. Al contrario, lo studio delle reazioni vascolari in culture fetta finora non è stato ampiamente intrapresa. Una ragione ovvia è la mancanza di circolazione e vaso sanguigno perfusione nel modello di cultura fetta. Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che è possibile mantenere bvasi Lood in CNS fetta culture per diversi giorni ^{8, 9.}

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di monitorare non solo il destino dei neuroni dopo OGD ma estendere lo studio al destino e il rimodellamento del sistema vascolare, che è una parte importante della risposta lesioni. Fino ad ora tali studi hanno richiesto il ricorso alla sperimentazione animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Nel protocollo qui presentato, ci sarà dettaglio come tali studi può essere fatto in organotipica culture fetta entorhino-ippocampale sfidato sia con ipossia o da lesioni eccitotossici seguita da analisi di entrambe le reazioni di sopravvivenza e vascolari neuronali. Questo protocollo si basa su uno studio precedentemente pubblicato sull'argomento ¹⁰ e può essere utile per qualsiasi laboratorio interessato interazioni neurovascolari nel SNC.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità delle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e sono stati esaminati e autorizzati dalle autorità svizzere.

1. Impostazione culture fetta Organotipica Entorhino-ippocampali

1. Preparare organotipica culture fetta entorhino-ippocampale (EHOSCs) da postnatali cuccioli giorno 4 (P4) del mouse utilizzando il metodo di incubazione statico ^4,11. Qui, utilizzare C57BL6 e CB6F1 topi.
   1. Prendete circa 30 minuti per il mouse cucciolo per la preparazione di culture fetta, cioè, 3 ore per una cucciolata di 6 cuccioli di topo. Effettuare tutte le operazioni in condizioni sterili in un banco di lavoro a flusso laminare con strumenti chirurgici sterilizzati.
   2. Al fine di evitare una possibile interferenza dalla posizione della sezione lungo l'asse setto-temporale, utilizzare solo ippocampo fette di metà settale. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i passaggi a RT.
2. Tagliare tha testa di un cucciolo topo P4 con le forbici chirurgiche. Non è necessaria alcuna anestesia per questo passo.
   1. Rimuovere il cranio intorno al cervello e identificare la fessura tra la fine caudale degli emisferi cerebrali e del mesencefalo. Rimuovere con cura la parte del cervello rostrale al mesencefalo dal cranio e metterlo in mezzo preparazione ghiacciata composto da MEM supplementato con una forma stabilizzata di L-glutammina.
3. Continuare la dissezione sotto uno stereomicroscopio con il cervello essere immersi nel ghiaccio medio preparazione freddo. Rimuovere restanti meningi dagli emisferi corticali. Identificare l'ippocampo alla superficie caudale mediale dell'emisfero e separarlo insieme alla corteccia entorinale adiacente dal resto del cervello.
   1. Trasferire il tessuto di un elicottero del tessuto e tagliare a fette spesse 400 micron in condizioni asettiche trasversale all'asse setto-temporale dell'ippocampo.
4. Mettere le fette su ceInserti cultura ll (circa 6 fette per inserto) e incubare in 6 pozzetti con 1 ml per pozzetto di mezzo di incubazione (47 ml di MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml di siero di cavallo, 1 ml Glutamax I, 1 ml di una soluzione sterile 10% di glucosio, pH 7,3) in atmosfera umidificata con 5% di CO ₂ a 37 ° C. Modificare il supporto il giorno successivo e poi a giorni alterni fino a 1 settimana.

2 In Vitro ipossia e deprivazione di ossigeno e glucosio con riperfusione

1. Vedere la Tabella 1 per un calendario preciso momento della procedura. EHOSCs di coltura per 5 giorni (DIV5) prima dell'esposizione all'ipossia o OGD. A questo punto il tempo cambiare il supporto da mezzo di incubazione contenente siero di cavallo 25% di siero medio gratuito con la seguente composizione: Neurobasal media con supplemento B27 2%, 1% e il Glutamax ulteriore 0,1% di glucosio.
2. Preparare il terreno OGD come dettagliato nel riferimento 7 .Le concentrazioni finali dei componenti sarà il seguente: 0.3CaCl ₂ mM, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO _3, 70 mM KCl, 1,25 mM saccarosio NaH ₂ PO _4, 2 MgSO mm _4, e 10 mM a pH 6.8. Aggiungere 1 ml di OGD medio in ciascun pozzetto di due piastre di coltura di tessuto 6 pozzetti.
   1. Profumato il mezzo OGD con N ₂ per 1 ora in una camera di ipossia e poi sigillare e mantenere O / N in un incubatore a 37 ° C.
   2. Utilizzare strisce anaerobici come indicatori di ipossia. Si consideri il mezzo per essere ossigeno libero quando il colore delle strisce cambiato dal rosa al bianco.
   3. Per l'induzione di ipossia, utilizzare mezzo privo di siero con glucosio invece di OGD media. Prima dell'uso, profumato il mezzo con N ₂ in una camera di ipossia come descritto sopra per OGD medie.
3. Prima che le fette sono esposti a OGD, perfusione il mezzo OGD nuovo con N ₂ per 30 min. Aggiungere 2 ml di 1 mg / ml di ioduro di propidio (PI) soluzione per bene (per una concentrazione finale di 2 mg / ml) per le fette per 30 min e selezionaresolo fette sani per la sperimentazione, come indicato da un basso numero di cellule positive PI.
4. Utilizzare il programma di esposizione OGD e riperfusione indicato nella figura 1. Privare le fette di ossigeno sia solo (ipossia) o di ossigeno e glucosio (OGD) per 15 min.
   1. Per l'induzione di ipossia o OGD, trasferire le fette in OGD medio e mantenere per 15 minuti nella camera di ipossia. Assicurarsi che tutti i materiali che rimangono sui lati dell'inserto vengono aspirati via quando le colture vengono commutati da medie a regolare OGD medio e indietro.
   2. Dopo ipossia o OGD, sostituire il supporto OGD con terreno privo di siero ossigenato e le culture sono autorizzati a recuperare per 3, 24 o 48 ore in mezzo privo di siero in incubatrice regolare a 37 ° C con il 5% di CO _2. Aggiungere PI nuovamente prima del fissaggio per la determinazione della morte cellulare.

3. trattamenti farmacologici di Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

1. CulturE EHOSCs per 5 giorni (DIV5) nel mezzo di incubazione prima dell'esposizione ai trattamenti farmacologici. Inizia trattamenti farmacologici sia durante OGD o immediatamente dopo OGD quando le fette sono trasferiti mezzo privo di siero.
2. Trattamenti per la protezione da OGD.
   1. Aggiungere 100 mM 6-ciano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) o 1 mM tetrodotossina (TTX) al mezzo di coltura durante l'induzione OGD (per 15 minuti) o subito dopo induzione OGD per 30 min. Poi, incubare in normossia mezzo privo di siero per 48 ore prima della fissazione.
3. Trattamenti per l'induzione della morte eccitotossica.
   1. Dopo 5 giorni in culture interruttore medio di incubazione di siero media liberi contenente 100 mM (RS) -α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic acido (AMPA) per 30 min.
   2. Rimuovere il terreno di coltura contenente AMPA per aspirazione (fare attenzione a rimuovere ogni residuo di supporto su inserti), quindi trasferire le fette di piatti freschi con il normale mezzo privo di siero eli conserva per 48 ore fino fissazione.

4. Fissazione e Immunostaining di Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

1. Propidio ioduro (PI) colorazione.
   1. Aggiungere PI per 30 min al mezzo di coltura di fette residenti ad una concentrazione di 2 mg / ml. Visualizza colture vive con un microscopio invertito dotato di ottica di fluorescenza e selezionare fette per ulteriori trattamenti. Per PI colorazione in combinazione con immunoistochimica, aggiungere la soluzione PI 30 minuti prima della fissazione delle culture.
2. Fissazione delle fette.
   1. Rimuovere il terreno di coltura da 6 pozzetti e aggiungere 3 ml di preparati al momento 4% paraformaldeide (PFA) in ciascun pozzetto. Quindi, posizionare la piastra 6-bene in frigorifero e fissare O / N a 4 ° C.
   2. Rimuovere la soluzione PFA il giorno seguente e lavare le fette di 3-4 volte con tampone fosfato (PBS).
3. La rimozione delle fette dalla I coltura cellularensert e la procedura di blocco per immunoistochimica di sezioni free-floating.
   1. Staccare con cautela e rimuovere le fette dagli inserti cultura utilizzando un pennello arte del formato 0 o più piccolo. Trasferire ogni singola fetta in un pozzetto di una piastra ben 96 riempita con tampone di bloccaggio (PBS con siero normale di capra 3% (NGS) e il 2% Triton-X100). Mantenere le fette nel buffer di blocco per 2 ore a temperatura ambiente sotto costante agitazione da un agitatore orbitale.
4. Immunostaining delle culture fetta
   1. Per l'etichettatura dei vasi sanguigni utilizzano policlonale anti-laminina a una diluizione di 1: 200 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100.
   2. Per neuroni etichettatura utilizzano anti-proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2) alla diluizione di 1: 500 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100.
   3. Incubare le fette con anticorpi primari per 48 ore a 4 ° C con costante agitazione. Dopo il periodo di incubazione, lavarli in PBS con 0,5% Triton-X100 per 3-4 volte.
   4. Diluire anticorpi secondari 1: 500 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100. Incubare le fette per 2 ore a temperatura ambiente al buio con gli anticorpi secondari coniugati Alexa fluoroforo. Utilizzare l'appropriato di capra anti-coniglio o anticorpo secondario di capra anti-topo coniugato con Alexa 350 o 488.
   5. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le fette per tre volte con soluzione salina tamponata con Tris (TBS); montarli su vetrini e applicare il coprioggetto le diapositive con Mowiol.
5. Microscopia delle fette colorate
6. Vedi le fette macchiati sia su un microscopio standard attrezzature epifluorescenza o con un microscopio confocale. Prendete le immagini con una fotocamera adeguata. Per alcune immagini, invertire il contrasto fluorescenza al fine di produrre navi scuro macchiate su uno sfondo luminoso (figure 5 e 6).

5 Determinazione della densità dei vasi regionale nei Culture

1. Quantificare il VesseDensità l basata su incroci nave come descritto in riferimento 8.
2. Utilizzare fette colorate per la laminina per queste misurazioni. Sovrapporre le immagini registrate di ingrandimento 10X con una griglia 6 x 6, dove ogni griglia è pari a 100 x 100 micron per metro quadrato, campo totale di 0,25 mm ^2.
3. Overlay tre di queste reti nella regione CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Contare le navi che attraversano le linee della griglia.
4. Per ottenere risultati con una buona rilevanza statistica, effettuare le misure in almeno 3 esperimenti indipendenti, ognuno compresi i dati da 3 cuccioli di topo con 3 fette per il mouse cucciolo.
5. Determinare il valore medio di attraversamenti delle navi dalle griglie per ogni regione e di effettuare un'analisi statistica mediante ANOVA con correzione di Bonferroni come post hoc di prova (p <0.05 definito come significativo) utilizzando appropriati software di statistiche.

Risultati

La privazione dell'ossigeno glucosio e ipossia induce la morte neuronale e la riduzione dei vasi sanguigni in particolare nella regione ippocampale CA1.
OGD o ossigeno-privazione solo per 15 min indotto una forte induzione di morte cellulare come visto da propidio ioduro colorazione specificamente nell'area CA1 dell'ippocampo (Figura 3) analogo a quello descritto in precedenza ^7. Con i marcatori di visualizzare la rete di vasi sanguigni, si è constatato che la densità dei vasi s...

Discussione

Con i metodi qui presentati, ippocampo culture fetta organotipica può essere utilizzato come uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l'infortunio. Mentre culture fetta organotipica sono stati utilizzati in passato per studiare le reazioni neuronali dopo ischemia ^{6, 7,} il nuovo aspetto dello studio simultaneo di cambiamenti vascolari aumenta notevolmente le potenziali applicazioni di questo metodo. L'induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con me...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreno essenziale minimo MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	forma stabilizzata di L-glutammina
Inserti per colture cellulari	Millicell Millipore	PICM03050
Terreno basale Eagle	Gibco	41010-026
Siero di cavallo	Gibco	26050-088
Terreno neurobasale	Gibco	21103-049
Integratore B27	Gibco	17504-044
Strisce anaerobiche	Sigma-Aldrich	59886
Soluzione di ioduro di propidio	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	Re D systems	0169-10
CNQX	R& D sistemi	0190/10
TTX	R& D systems	1078/1
policlonale anti-laminina	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-mouse 350	Sonde molecolari	A11045
Alexa anti-mouse 488	Sonde molecolari	A11001
Alexa anti-coniglio 350	Sonde molecolari	A11046
Alexa anti-coniglio 488	Sonde molecolari	A11008
Software di statistica	Software GraphPad	GraphPad Prism
Tritatessuti McIlwain	Ted Pella	10180
Camera per ipossia	Billups-Rothenberg	MIC-101