Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.
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Articolo metodologico
Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.
Introduzione
Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2.
Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani e / oi loro tutori a dare il consenso per la partecipazione allo studio. I campioni di urina sono una fonte non invasiva di cellule somatiche che sono modificabili a metodi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule di urina raccolti da pazienti distrofia muscolare possono essere colta ed efficiente riprogrammati in iPSCs utilizzando trasduzione retrovirale con i fattori di Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc; OSKM) 1. Lo svantaggio di consegna del gene retrovirale è l'integrazione casuale dei geni riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite. Per superare questo limite, abbiamo usato il Sendai non-integrazione per la riprogrammazione delle cellule urine.
Dettagli Questo protocollo virus riprogrammazione Sendai di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare, che possono poi essere differenziati in cardiomiociti o altri tipi di cellule per ulteriori studi. Questo protocollo può anche essere adattato per altre malattie specifiche del paziente.
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Protocollo
NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio.
1. Tamponi e preparati media
- Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS).
- Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium.
- KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti, aggiungere 5 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 50 ng / ml di estratto pituitario bovino (BPE), 30 ng / ml di tossina del colera, e la soluzione penna / strep (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina) a 500 ml medie KSF.
- Progenitor cellulare Medium: Aggiungere tre quarti di DMEM con un quarto dei mezzi Ham-F12 e integrare con il 10% FBS, 0,4 mg / ml idrocortisone, 0,1nM tossina del colera, 5 ng / ml di insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di transferrina, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml EGF, e la penna / strep soluzione.
- hES Media: Aggiungi il 20% di sostituzione KO siero (K-SR), aminoacidi non essenziali 1x MEM, 2 mm L-glutammina, 100 micron β-mercaptoetanolo, 20 ng / ml bFGF e penna / strep a 400 ml DMEM / F12.
2. Campione di urine Collection
- Istruire i pazienti di bere liquidi 30 min prima della raccolta delle urine per garantire che una quantità adeguata (~ 30-40 ml) di urina possono essere raccolti.
- Dare i pazienti e / o dei loro tutori un kit di raccolta delle urine, contenente i seguenti elementi: (1) istruzioni scritte su come ottenere campione di urina cattura sterile o pulite, (2) toilettes antibatteriche umide, e (3) un 100 ml sterile bicchiere di raccolta dei campioni. Informare i pazienti di raccogliere campioni.
- Porre immediatamente i campioni di urina sul ghiaccio e trasferimento laboraTory in un dispositivo di raffreddamento. Processo immediatamente l'urina per l'isolamento delle cellule. Se il ritardo è inevitabile, conservare i campioni in ghiaccio per un massimo di 4 ore con una minima perdita di vitalità cellulare.
3. Isolamento ed espansione di cellule urina
NOTA: eseguire le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica.
- Usando pipette sterili, i campioni di urina trasferimento sterilizzato provette da 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT.
- Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nel tubo; fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Risospendere e combinare i pellets da più tubi in 7 ml di tampone di lavaggio e ripetere centrifugazione a 400 xg per 10 min a RT.
- Con attenzione aspirare il surnatante, lasciando il pellet e ~ 0,2-0,5 ml di surnatante. Risospendere in 2-3 ml di urinario Progenitor cellulare (UPC) di medie e trasferire la sospensione in 4-6 pozzetti di una nonrivestito 24-pozzetti.
- Dopo 72 ore, integrare la cultura con 0,5 ml di fresco UPC medie per bene e cambiare media ogni 2-3 giorni dopo. Gli eritrociti e cellule squamose che non si attaccano alla piastra saranno rimossi con il mezzo modifiche.
- Monitorare cultura dopo 4-6 giorni.
NOTA: Piccole 2-4 colonie di cellule inizieranno ad apparire. Le cellule saranno arrotondati o allungata, che rappresentano di tipo I o di tipo II di epiteliale renale (RE) le cellule rispettivamente 3. - Cambiare la media ogni 2-3 giorni dal momento che, una volta compaiono le cellule, che sarà oggetto di una fase di rapida espansione.
- Una volta che le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, circa 9-15 giorni dopo la placcatura, dissociare e il passaggio delle cellule (15,000-18,000 cellule / cm 2) sul 2-4 pozzetti di 24 pozzetti per un'ulteriore espansione. Segna questo come cellulare di passaggio 1 (P1).
- Caratterizzare cellule di urina per le specifiche lignaggio attraverso l'analisi di citometria di flusso, immunohistochemcolorazione ical o tramite reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR).
- Riprogrammare cellule urina isolate (sezione 4) o congelare giù a congelamento (DMEM integrato con il 10% di siero e il 10% DMSO) per crioconservazione a lungo termine.
4. Urine Riprogrammazione cellulare Utilizzando Sendai Virus
NOTA: La corretta gestione e l'uso di DPI (dispositivi di protezione individuale) è raccomandato durante la manipolazione degli agenti trasfettando. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSL2 Biological Safety Cabinet. Il corretto smaltimento dei trasfezione cellule agente e / o transfettate si consiglia di evitare il rischio di pericoli per l'ambiente e per la salute. Per urine riprogrammazione cellulare, utilizzare un Sendai Riprogrammazione Kit con modifiche al protocollo alimentatore-dipendente dal produttore, come descritto di seguito.
- Per garantire un'elevata efficienza riprogrammazione utilizzando il Sendai, uso passaggi 1-5 di cellule di urina che sono rapidily dividendo. Se le cellule non replicano bene o diventano senescenti, disfarsene in quanto non riprogrammare in modo efficiente.
- Seed 60.000 cellule per pozzetto in due pozzetti di una piastra 6 bene. Segna questo come giorno -2. Regolare la densità di semina delle cellule (5 x 4-9 OTTOBRE x 10 4 cellule per pozzetto) come necessario per raggiungere 80-90% di confluenza di giorno 0.
- Il giorno 0 (48 ore dopo la placcatura le cellule), preparare i vettori di riprogrammazione Sendai (SEV) contenenti ciascuno dei quattro fattori OSKM. Aggiungere ognuno dei vettori a 1 ml di pre-riscaldato a medio UPC. Utilizzare un MOI di 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), che è sufficiente per cellule urina riprogrammazione. Aspirare il medio e aggiungere lentamente il 1 ml UPC + SeV ad un pozzetto delle celle di urina. Utilizzare il secondo e il controllo negativo trasduzione.
- Il giorno 1, sostituire il mezzo di UPC + SeV fresca media UPC. Alcuni morte cellulare è visto dopo 24 ore a causa di citotossicità virale.
- A seconda dell'efficienza di clon riprogrammatoe formazioni e la morfologia compatta, continuano a cambiare il mezzo di tutti i giorni fino al giorno 6 o 7.
- Un giorno prima della dissociazione di cellule trasdotte (giorno 5 o 6), preparare piastre alimentatore MEF placcando mitomicina-C (10 ug / ml per 3 ore) trattati-MEF a densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2, su 0.1 % di gelatina rivestito 100 mm 2 piatti di coltura.
- Il giorno successivo (giorno 6 o 7), dissociare le cellule con 0,25% tripsina, risospendere le cellule in UPC medio e piastra 5 x 10 4 - Piastra alimentatore 2 x 10 5 cellule / 100 mm 2 MEF.
- Il giorno seguente, passare hES medie e cambiare il mezzo ogni giorno. Osservare le cellule al microscopio per monitorare le cellule trasformate.
NOTA: Le cellule formano aggregati clonali con morfologia caratteristica ciottoli e avere maggiore nucleo rapporto citoplasmatica (12-18 giorni dopo trasduzione). - Entro due o tre settimane dopo la trasduzione, raccogliere le colonie e il trasferimento di nuove piastre per clonespansione al.
- Eseguire colorazione delle cellule in tempo reale per la selezione dei cloni IPSC incubando le cellule con TRA-1-81 anticorpi per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2 seguita dal contatore colorazione con colorante fluorescente specifico anticorpo secondario coniugato per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2.
- Utilizzare un pollice G 1½ ago 26 a tratteggio incrociato più grandi TRA-1-81 positivi cloni IPSC in piccoli pezzi uguali dimensioni (4-6 pezzi per clone).
- Utilizzare una pipetta punta sterile per raccogliere e trasferire 10-20 pezzi cross-nati da più cloni in tutti i pozzetti di Matrigel (10 mg / cm 2) Rivestiti 24 pozzetti con HES media.
NOTA: Pezzi di un singolo clone placcato singolarmente in un unico pozzo non si espandono o mantenere pluripotenza. - Cambiare dal hES all'IPSC medio 24-48 ore dopo i cloni riprogrammati sono attaccati alla superficie Matrigel.
- Durante la manutenzione su piastre Matrigel rivestite, SCRA manualmentepe-off tutte le cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione MEF con una pipetta punta ad arricchire per distrofici iPSC (MD-IPSC) cloni pienamente riprogrammate e pluripotenti.
- Dopo i singoli cloni hanno raggiunto ~ 100 micron dimensioni, espandere i cloni dissociandosi con EDTA 0,48 mm (etilendiamminotetraacetico) soluzione per 3 min e placcatura piccoli aggregati di cellule di MD-iPSCs sospese in iPSC medio (integrato con 5 micron Y27632, Rho Kinase inibitore ) su Matrigel freschi (10 mg / cm 2) rivestito 12 pozzetti. Cambiare iPSC media giornaliera.
- Riprogrammazione completa di ogni clone può essere determinata sia da analisi di espressione genica di geni OSKM e colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (Oct3 / 4 e TRA-1-81). Una valutazione rigorosa del potenziale pluripotenza dovrebbe essere impiegato per confermare le linee IPSC completamente riprogrammati in grado di differenziare in tre foglietti embrionali. Ciò può essere eseguito mediante corpo embrioide (EB) formazione e differenziazione dosaggio o terAtoma test formazione.
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Risultati
La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP)...
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Discussione
Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i picc...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da Advancing a Healthier Wisconsin e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso il numero di sovvenzione 8UL1TR000055. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.
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Materiali
Antibodies
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Tazza per campioni con coperchio | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | per la raccolta di campioni di urina |
| Provette BD-Falcon da 15 ml | Fisher Scientific | 352097 | |
| Provette BD-Falcon da 50 ml | Fisher Scientific | 352098 | |
| Vetrini coprioggetti rotondi | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS Sendai | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep senza glutammina | Life Technologies | 15140-122 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Supplemento di B-27 con insulina (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| Integratore B-27 senza insulina (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Versene, 1:5.000 | Life Technologies | 15040066 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| bFGF (10 µ g) | Life Technologies | 13256-029 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Cartucce contacellule | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 Tecnologie di | vita | 10828-028 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Congelamento di colture cellulari di recupero Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Cheratinocita-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| DMEM, glucosio alto, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima |
| dell'uso Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| EGF proteina umana ricombinante, forma liquida | Life Technologies | PHG0311L | caldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso |
| Insulina, ricombinante umano, zinco Soln | Life Technologies | 12585-014 | Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | qualificata hESC, LVED |
| Free RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Kit di sintesi iScript cDNA | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualificato | Sigma Aldrich | F6178 | Caldo in 37 gradi ... C bagnomaria prima dell'uso |
| Bioreagente Adenina | Sigma Aldrich | A2786-5G | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Tossina del colera da Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso |
| Idrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Olo-transferrina da Sigma | Aldrich | T0665-50MG | umano caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| 3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mount medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldeide | Alfa-Aesar | 43368< | |
| Mouse anti CD44 - marcato con FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Topo anti CD146 - marcato con PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Topo anti CD73 - marcato con PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Topo anti-alfa;-actina muscolare liscia | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Topo anti-Vimentina | Abcam | ab8978-100 | |
| Topo Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Coniglio anti 3/4 ottobre | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Topo anti distrofina | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
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Ristampe e permessi
