Articolo metodologico

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

DOI:

10.3791/52032

⸱

28 gennaio 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.

Abstract

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Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.

Introduzione

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Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2.

Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani e / oi loro tutori a dare il consenso per la partecipazione allo studio. I campioni di urina sono una fonte non invasiva di cellule somatiche che sono modificabili a metodi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule di urina raccolti da pazienti distrofia muscolare possono essere colta ed efficiente riprogrammati in iPSCs utilizzando trasduzione retrovirale con i fattori di Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc; OSKM) 1. Lo svantaggio di consegna del gene retrovirale è l'integrazione casuale dei geni riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite. Per superare questo limite, abbiamo usato il Sendai non-integrazione per la riprogrammazione delle cellule urine.

Dettagli Questo protocollo virus riprogrammazione Sendai di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare, che possono poi essere differenziati in cardiomiociti o altri tipi di cellule per ulteriori studi. Questo protocollo può anche essere adattato per altre malattie specifiche del paziente.

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Protocollo

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NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio.

1. Tamponi e preparati media

  1. Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS).
  2. Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium.
    1. KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti, aggiungere 5 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 50 ng / ml di estratto pituitario bovino (BPE), 30 ng / ml di tossina del colera, e la soluzione penna / strep (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina) a 500 ml medie KSF.
    2. Progenitor cellulare Medium: Aggiungere tre quarti di DMEM con un quarto dei mezzi Ham-F12 e integrare con il 10% FBS, 0,4 mg / ml idrocortisone, 0,1nM tossina del colera, 5 ng / ml di insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di transferrina, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml EGF, e la penna / strep soluzione.
  3. hES Media: Aggiungi il 20% di sostituzione KO siero (K-SR), aminoacidi non essenziali 1x MEM, 2 mm L-glutammina, 100 micron β-mercaptoetanolo, 20 ng / ml bFGF e penna / strep a 400 ml DMEM / F12.

2. Campione di urine Collection

  1. Istruire i pazienti di bere liquidi 30 min prima della raccolta delle urine per garantire che una quantità adeguata (~ 30-40 ml) di urina possono essere raccolti.
  2. Dare i pazienti e / o dei loro tutori un kit di raccolta delle urine, contenente i seguenti elementi: (1) istruzioni scritte su come ottenere campione di urina cattura sterile o pulite, (2) toilettes antibatteriche umide, e (3) un 100 ml sterile bicchiere di raccolta dei campioni. Informare i pazienti di raccogliere campioni.
  3. Porre immediatamente i campioni di urina sul ghiaccio e trasferimento laboraTory in un dispositivo di raffreddamento. Processo immediatamente l'urina per l'isolamento delle cellule. Se il ritardo è inevitabile, conservare i campioni in ghiaccio per un massimo di 4 ore con una minima perdita di vitalità cellulare.

3. Isolamento ed espansione di cellule urina

NOTA: eseguire le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica.

  1. Usando pipette sterili, i campioni di urina trasferimento sterilizzato provette da 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT.
  2. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nel tubo; fare attenzione a non disturbare il pellet.
  3. Risospendere e combinare i pellets da più tubi in 7 ml di tampone di lavaggio e ripetere centrifugazione a 400 xg per 10 min a RT.
  4. Con attenzione aspirare il surnatante, lasciando il pellet e ~ 0,2-0,5 ml di surnatante. Risospendere in 2-3 ml di urinario Progenitor cellulare (UPC) di medie e trasferire la sospensione in 4-6 pozzetti di una nonrivestito 24-pozzetti.
  5. Dopo 72 ore, integrare la cultura con 0,5 ml di fresco UPC medie per bene e cambiare media ogni 2-3 giorni dopo. Gli eritrociti e cellule squamose che non si attaccano alla piastra saranno rimossi con il mezzo modifiche.
  6. Monitorare cultura dopo 4-6 giorni.
    NOTA: Piccole 2-4 colonie di cellule inizieranno ad apparire. Le cellule saranno arrotondati o allungata, che rappresentano di tipo I o di tipo II di epiteliale renale (RE) le cellule rispettivamente 3.
  7. Cambiare la media ogni 2-3 giorni dal momento che, una volta compaiono le cellule, che sarà oggetto di una fase di rapida espansione.
  8. Una volta che le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, circa 9-15 giorni dopo la placcatura, dissociare e il passaggio delle cellule (15,000-18,000 cellule / cm 2) sul 2-4 pozzetti di 24 pozzetti per un'ulteriore espansione. Segna questo come cellulare di passaggio 1 (P1).
  9. Caratterizzare cellule di urina per le specifiche lignaggio attraverso l'analisi di citometria di flusso, immunohistochemcolorazione ical o tramite reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR).
  10. Riprogrammare cellule urina isolate (sezione 4) o congelare giù a congelamento (DMEM integrato con il 10% di siero e il 10% DMSO) per crioconservazione a lungo termine.

4. Urine Riprogrammazione cellulare Utilizzando Sendai Virus

NOTA: La corretta gestione e l'uso di DPI (dispositivi di protezione individuale) è raccomandato durante la manipolazione degli agenti trasfettando. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSL2 Biological Safety Cabinet. Il corretto smaltimento dei trasfezione cellule agente e / o transfettate si consiglia di evitare il rischio di pericoli per l'ambiente e per la salute. Per urine riprogrammazione cellulare, utilizzare un Sendai Riprogrammazione Kit con modifiche al protocollo alimentatore-dipendente dal produttore, come descritto di seguito.

  1. Per garantire un'elevata efficienza riprogrammazione utilizzando il Sendai, uso passaggi 1-5 di cellule di urina che sono rapidily dividendo. Se le cellule non replicano bene o diventano senescenti, disfarsene in quanto non riprogrammare in modo efficiente.
  2. Seed 60.000 cellule per pozzetto in due pozzetti di una piastra 6 bene. Segna questo come giorno -2. Regolare la densità di semina delle cellule (5 x 4-9 OTTOBRE x 10 4 cellule per pozzetto) come necessario per raggiungere 80-90% di confluenza di giorno 0.
  3. Il giorno 0 (48 ore dopo la placcatura le cellule), preparare i vettori di riprogrammazione Sendai (SEV) contenenti ciascuno dei quattro fattori OSKM. Aggiungere ognuno dei vettori a 1 ml di pre-riscaldato a medio UPC. Utilizzare un MOI di 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), che è sufficiente per cellule urina riprogrammazione. Aspirare il medio e aggiungere lentamente il 1 ml UPC + SeV ad un pozzetto delle celle di urina. Utilizzare il secondo e il controllo negativo trasduzione.
  4. Il giorno 1, sostituire il mezzo di UPC + SeV fresca media UPC. Alcuni morte cellulare è visto dopo 24 ore a causa di citotossicità virale.
  5. A seconda dell'efficienza di clon riprogrammatoe formazioni e la morfologia compatta, continuano a cambiare il mezzo di tutti i giorni fino al giorno 6 o 7.
  6. Un giorno prima della dissociazione di cellule trasdotte (giorno 5 o 6), preparare piastre alimentatore MEF placcando mitomicina-C (10 ug / ml per 3 ore) trattati-MEF a densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2, su 0.1 % di gelatina rivestito 100 mm 2 piatti di coltura.
  7. Il giorno successivo (giorno 6 o 7), dissociare le cellule con 0,25% tripsina, risospendere le cellule in UPC medio e piastra 5 x 10 4 - Piastra alimentatore 2 x 10 5 cellule / 100 mm 2 MEF.
  8. Il giorno seguente, passare hES medie e cambiare il mezzo ogni giorno. Osservare le cellule al microscopio per monitorare le cellule trasformate.
    NOTA: Le cellule formano aggregati clonali con morfologia caratteristica ciottoli e avere maggiore nucleo rapporto citoplasmatica (12-18 giorni dopo trasduzione).
  9. Entro due o tre settimane dopo la trasduzione, raccogliere le colonie e il trasferimento di nuove piastre per clonespansione al.
  10. Eseguire colorazione delle cellule in tempo reale per la selezione dei cloni IPSC incubando le cellule con TRA-1-81 anticorpi per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2 seguita dal contatore colorazione con colorante fluorescente specifico anticorpo secondario coniugato per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2.
  11. Utilizzare un pollice G 1½ ago 26 a tratteggio incrociato più grandi TRA-1-81 positivi cloni IPSC in piccoli pezzi uguali dimensioni (4-6 pezzi per clone).
  12. Utilizzare una pipetta punta sterile per raccogliere e trasferire 10-20 pezzi cross-nati da più cloni in tutti i pozzetti di Matrigel (10 mg / cm 2) Rivestiti 24 pozzetti con HES media.
    NOTA: Pezzi di un singolo clone placcato singolarmente in un unico pozzo non si espandono o mantenere pluripotenza.
  13. Cambiare dal hES all'IPSC medio 24-48 ore dopo i cloni riprogrammati sono attaccati alla superficie Matrigel.
  14. Durante la manutenzione su piastre Matrigel rivestite, SCRA manualmentepe-off tutte le cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione MEF con una pipetta punta ad arricchire per distrofici iPSC (MD-IPSC) cloni pienamente riprogrammate e pluripotenti.
  15. Dopo i singoli cloni hanno raggiunto ~ 100 micron dimensioni, espandere i cloni dissociandosi con EDTA 0,48 mm (etilendiamminotetraacetico) soluzione per 3 min e placcatura piccoli aggregati di cellule di MD-iPSCs sospese in iPSC medio (integrato con 5 micron Y27632, Rho Kinase inibitore ) su Matrigel freschi (10 mg / cm 2) rivestito 12 pozzetti. Cambiare iPSC media giornaliera.
  16. Riprogrammazione completa di ogni clone può essere determinata sia da analisi di espressione genica di geni OSKM e colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (Oct3 / 4 e TRA-1-81). Una valutazione rigorosa del potenziale pluripotenza dovrebbe essere impiegato per confermare le linee IPSC completamente riprogrammati in grado di differenziare in tre foglietti embrionali. Ciò può essere eseguito mediante corpo embrioide (EB) formazione e differenziazione dosaggio o terAtoma test formazione.

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Risultati

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La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP)...

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Discussione

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Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i picc...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da Advancing a Healthier Wisconsin e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso il numero di sovvenzione 8UL1TR000055. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

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Materiali

Antibodies

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materials
4 Oz. Tazza per campioni con coperchioSTL Medical SupplyM9AMSAS340per la raccolta di campioni di urina
Provette BD-Falcon da 15 mlFisher Scientific352097
Provette BD-Falcon da 50 mlFisher Scientific352098
Vetrini coprioggetti rotondiFisher Scientific12-545-81
Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS SendaiLife TechnologiesA1378-001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023
Pen-Strep senza glutammina Life Technologies15140-122Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Supplemento di B-27 con insulina (50x)Life Technologies17504-044Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
Integratore B-27 senza insulina (50x)Life Technologies0050129SACaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
DMEM/F12 (1:1)Life Technologies11330-032Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Versene, 1:5.000Life Technologies15040066Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
bFGF (10 µ g)Life Technologies13256-029Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Cartucce contacelluleLife TechnologiesC10228
Knockout Serum (500  Tecnologie divita10828-028Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Congelamento di colture cellulari di recupero MediumLife Technologies12648-010
Cheratinocita-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
DMEM, glucosio alto, GlutamaxLife Technologies10566-016Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima
dell'uso Ham's F-12 Nutrient Mix Life Technologies11765-054Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
EGF proteina umana ricombinante, forma liquidaLife TechnologiesPHG0311Lcaldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso
Insulina, ricombinante umano, zinco SolnLife Technologies12585-014Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
TeSR-E8Stem Cell Technologies5940Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
ROCK Inhibitor (Y-27632)SelleckS1049Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
MatrigelBD Biosciences354277qualificata hESC, LVED
Free RNeasy Mini Kit Qiagen74104
Kit di sintesi iScript cDNABio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo-ScientificK1081
FBS-QualificatoSigma AldrichF6178Caldo in 37 gradi ... C bagnomaria prima dell'uso
Bioreagente AdeninaSigma AldrichA2786-5GCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Tossina del colera da Vibrio choleraeSigma AldrichC8052-.5MGCaldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
IdrocortisoneSigma AldrichH0888-1GCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Olo-transferrina da SigmaAldrichT0665-50MGumano caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodicoSigma AldrichT6397-100MGCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
DAPI Santa Cruz BiotechnologySC-3598
Fluoromount Aquous mount mediumSigma AldrichF4680
16% ParaformaldeideAlfa-Aesar43368<
Mouse anti CD44 - marcato con FITC BD Biosciences560977
Topo anti CD146 - marcato con PEBD Biosciences561013
Topo anti CD73 - marcato con PEBD Biosciences561014
Topo anti-alfa;-actina muscolare lisciaSigma AldrichA2547
Topo anti-VimentinaAbcamab8978-100
Topo Anti - TRA-1-81Life Technologies411100
Coniglio anti 3/4 ottobreSanta Cruz BiotechnologySC-9081
Topo anti distrofinaLeica BiosystemsNCL-DYSB
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
  2. Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
  3. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  6. Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
  7. Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
  8. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  9. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
  10. Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
  11. González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
  12. Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).

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