Articolo metodologico

L'immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

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DOI:

10.3791/52036

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30 agosto 2014

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1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

In questo articolo

Sommario

Il presente lavoro illustra la convenienza dell'uso dell'immunoterapia sublinguale per aumentare la risposta immunitaria innata nei polmoni e conferire protezione contro la polmonite pneumococcica acuta nel topo.

Abstract

La via sublinguale è stata ampiamente utilizzata per fornire piccole molecole nel flusso sanguigno e per modulare la risposta immunitaria in diversi siti. È stato dimostrato che induce efficacemente risposte umorali e cellulari nei siti sistemici e mucosi, vale a dire i polmoni e il tratto urogenitale. La vaccinazione sublinguale può favorire la protezione contro le infezioni delle vie respiratorie inferiori e superiori; Può anche promuovere la tolleranza agli allergeni e migliorare i sintomi dell'asma. La modulazione della risposta immunitaria polmonare mediante immunoterapia sublinguale (SLIT) è più sicura della somministrazione diretta di formulazioni per via intranasale perché non richiede la somministrazione di molecole potenzialmente dannose direttamente nelle vie aeree. A differenza della somministrazione intranasale, gli effetti collaterali che coinvolgono la tossicità cerebrale o la paralisi facciale non sono promossi dalla SLIT. I meccanismi immunitari alla base della SLIT rimangono sfuggenti e il suo uso per il trattamento delle infezioni polmonari acute non è stato ancora esplorato. Pertanto, è necessario lo sviluppo di modelli animali appropriati di SLIT per esplorare ulteriormente i suoi potenziali vantaggi.

Questo lavoro mostra come eseguire la somministrazione sublinguale di agenti terapeutici nei topi per valutare la loro capacità di proteggere dalla polmonite pneumococcica acuta. Vengono illustrati gli aspetti tecnici della manipolazione del topo durante l'inoculazione sublinguale, l'identificazione precisa della mucosa sublinguale, il drenaggio dei linfonodi e l'isolamento dei tessuti, il lavaggio broncoalveolare e i polmoni. I protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula per l'analisi FACS sono descritti in dettaglio. Vengono discusse altre applicazioni a valle per l'analisi della risposta immunitaria. Vengono inoltre spiegati gli aspetti tecnici della preparazione dell'inoculo di Streptococcus pneumoniae e della provocazione intranasale dei topi.

SLIT è una tecnica semplice che consente lo screening di molecole candidate per modulare la risposta immunitaria dei polmoni. I parametri che influenzano il successo della SLIT sono legati alle dimensioni molecolari, alla suscettibilità alla degradazione e alla stabilità di formulazioni altamente concentrate.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo lavoro è illustrare i benefici dell'immunoterapia sublinguale per il trattamento delle infezioni respiratorie acute (ARI) e presentare i vantaggi di questa via di somministrazione rispetto ad altre vie di somministrazione, in particolare intranasale.

ARI causano milioni di morti ogni anno, specialmente nei bambini sotto i cinque anni. Lo Streptococcus pneumoniae rimane uno dei principali agenti eziologici della polmonite batterica nei neonati e negli anziani1,2. Ad oggi, il principale trattamento disponibile si basa sull'uso di antibiotici, ma i ceppi resistenti sono in continua crescita3,4.

SLIT induce ampie risposte a livello sistemico e anche mucoso, in particolare a livello del tratto respiratorio5. Ha dimostrato efficacia contro l'infezione influenzale, promuovendo una protezione a lungo termine con la produzione di risposte umorali e cellulari6,7. Inoltre, è stato dimostrato che il trattamento profilattico con lisati batterici somministrati per via sublinguale riduce le esacerbazioni della bronchite cronica ostruttiva negli anziani8 e previene le infezioni respiratorie ricorrenti nei bambini9. La SLIT è stata ampiamente utilizzata per il trattamento di allergie e asma. Gli studi clinici hanno dimostrato non solo la sua efficacia nel modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio, ma anche la sua sicurezza10. Nonostante il crescente interesse delle aziende farmaceutiche e dei ricercatori per la SLIT, i meccanismi coinvolti nell'induzione delle risposte immunitarie della mucosa dopo la somministrazione sublinguale di composti rimangono oscuri. Recentemente, l'attenzione si è concentrata sui meccanismi che promuovono la tolleranza associati alla desensibilizzazione agli allergeni. È stato proposto che le cellule residenti e reclutate nella mucosa sublinguale, come le cellule dendritiche e i macrofagi, possano promuovere la tolleranza dopo SLIT11-13. Le cellule dendritiche della mucosa orale possono promuovere le cellule T helper11 che producono IFN-gamma e IL-10, oltre a ricircolare nella mucosa genitale distale e promuovere le cellule T CD8+ 14. Tuttavia, si sa poco sull'impatto della SLIT sulle cellule innate o sulla sua capacità di migliorare l'eliminazione dei patogeni durante le infezioni respiratorie acute.

Il controllo naturale dell'infezione da pneumococco nei polmoni dipende in gran parte dall'attivazione efficiente e rapida delle difese innate locali. In precedenza abbiamo dimostrato che il miglioramento dell'immunità innata dei polmoni con una singola dose intranasale di flagellina (FliC), un agonista di TLR5 e NLRC4, protegge il 75-100% dei topi sottoposti a test con una dose letale di un isolato clinico di Streptococcus pneumoniae sierotipo 1. È stato dimostrato che questa protezione dipende dal reclutamento locale di cellule GR1+ (probabilmente neutrofili polimorfonucleati, PMN) e non dipende da anticorpi, cellule B o T15.

La flagellina è il componente strutturale del flagello batterico. Nella sua forma monomerica è riconosciuto da due recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR), il TLR5 che rileva la FliC16 extracellulare e l'inflammasoma NLRC4/NAIP5 che rileva la flagellina intracellulare17,18. Quando la FliC viene rilevata dai PRR, viene innescata un'importante risposta infiammatoria. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'instillazione di FliC purificato dal sierotipo Typhimurium di Salmonella enterica nei polmoni guida una rapida produzione di chemochine e citochine, specialmente quando riconosciute dall'epitelio polmonare che a sua volta orchestra il reclutamento di cellule immunitarie nelle vie aeree, principalmente PMN15,19-21. Sebbene transitoria, la sostanziale infiltrazione di neutrofili che avviene nelle vie aeree dopo la somministrazione nasale di FliC potrebbe essere un problema se ci si sposta verso terapie cliniche per uso umano. Un'infiammazione eccessiva potrebbe essere dannosa per la funzione polmonare. Inoltre, è stato dimostrato che la somministrazione intranasale di molecole immunostimolanti può causare paralisi facciale e/o tossicità cerebrale22-24.

L'immunoterapia sublinguale offre un'alternativa più sicura per modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio rispetto alla via intranasale. Non è invasivo, indolore, semplice e ha una buona compliance del paziente25. Inoltre, come accennato in precedenza, può indurre risposte protettive nella mucosa respiratoria senza i rischi associati alla somministrazione diretta intranasale o intrapolmonare di formulazioni. La via sublinguale potrebbe essere utilizzata in alternativa per fornire molecole che hanno grandi effetti sul sistema immunitario del polmone, ma che hanno dimostrato di essere tossiche o di provocare una grande infiammazione se somministrate per via intranasale. Oltre a questi vantaggi, le formulazioni per l'immunoterapia sublinguale hanno un costo di produzione inferiore poiché i prodotti non sterili possono essere somministrati per questa via e lo shock endotossico non è un problema per la SLIT. D'altra parte, vale la pena notare che dosi più elevate dei composti immunostimolatori rispetto a quelle utilizzate per via intranasale o parenterale sono necessarie per indurre una risposta immunitaria nei polmoni; anche quando si utilizza il modello murino di SLIT sono necessarie soluzioni altamente concentrate poiché il sito anatomico in cui vengono depositate le formulazioni è piccolo.

Sulla base dei nostri dati pubblicati in precedenza, abbiamo sviluppato un modello di protezione utilizzando l'immunoterapia sublinguale con flagellina come immunostimolante modello. Abbiamo dimostrato che una singola dose di flagellina ha indotto una sopravvivenza del 60% contro la polmonite pneumococcica invasiva causata dal ceppo sierotipo 1, mentre tutti i topi del gruppo di controllo sono morti di infezione entro 5 giorni. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che un numero maggiore di PMN viene reclutato nelle vie aeree di animali protetti dopo il trattamento sublinguale con flagellina, suggerendo che queste cellule potrebbero essere coinvolte nel meccanismo di protezione indotto dall'immunoterapia sublinguale.

Questo video mostra in dettaglio come eseguire l'immunoterapia sublinguale e anche come recuperare il tessuto rilevante dalla mucosa sublinguale, drenando i linfonodi, nonché i polmoni e le vie aeree per eseguire ulteriori analisi. Inoltre, illustra la tecnica generale di preparazione delle cellule per l'analisi FACS e mostra brevemente come preparare le sospensioni di Streptococcus pneumoniae e come eseguire infezioni intranasali nel topo per impostare il modello di infezione acuta.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli N ° 071140-000821-12 e 08.052.010 approvato dalla Commissione onorario per Sperimentazione animale e del Consiglio della Scuola di Medicina, Universidad de la República direttiva - Uruguay.

1 sublinguale Amministrazione della terapeutica dell'agente

  1. Preparare la soluzione contenente l'agente terapeutico da testare. Regolare la concentrazione di amministrare un volume massimo di 10 ml per topo.
    NOTA: Per flagellin purificato da Salmonella enterica sierotipo Typhimurium la dose ottimale di indurre una protezione nel topo infettato con la prima dose letale di S. pneumoniae sierotipo 1 E1586, un tasso di mortalità del 100% è di 10 mcg / mouse. Flagellina soluzione deve essere riscaldata a 65 ° C per 5 minuti per assicurare il rilascio dei monomeri. Per ulteriori informazioni sulla purificazione flagellin vedi riferimento 26.
    1. Varconcentrazione efficace y di diversi agenti immunomodulatori secondo la sua dimensione molecolare, la purezza, la suscettibilità alla proteolisi e l'uso di agenti mucoadesivi. Regolare la concentrazione ottimale per ogni composto da testare per massimizzare i suoi effetti. Se sono stati condotti studi precedenti per via intranasale per un particolare composto, utilizzare una dose iniziale da 5 a 10 volte superiore per testare la sua efficacia per via sublinguale.
  2. Anestetizzare i topi iniettando un cocktail contenente 110 mg / kg di ketamina con 5,5 mg / kg Xylacine e lasciare che gli animali riposare per 7-10 minuti.
  3. Verificare il corretto anestesia premendo delicatamente la zampa di una delle zampe posteriori; se adeguatamente anestetizzato l'animale non si muove in risposta allo stimolo.
  4. Stendere un sottile strato di vet unguento negli occhi di ogni mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
    NOTA: anestetici inalatorie come isofluorane possono essere utilizzati anche al posto ketamina / Xylacine se un sistema equipped con camera e naso induzione coni è disponibile. Utilizzare la camera di induzione per anestetizzare gli animali e amministrare il immunostimolante per via sublinguale. Collegare immediatamente l'animale a un cono di naso per almeno 15 minuti per tenerlo sotto anestesia per evitare di deglutizione e permettere l'assorbimento del composto terapeutico.
  5. Pipettare la soluzione contenente la soluzione immunostimolante o controllo del veicolo; utilizzando il pollice e l'indice della mano non dominante prendere il mouse e tenerlo in posizione verticale.
  6. Utilizzando il posto mano dominante un paio di pinze chiuse sotto la lingua e tenerlo in posizione con le dita medio e anulare, aprire le pinze per sollevare leggermente la lingua.
  7. Prendere la pipetta e somministrare la soluzione sul pavimento della bocca laterale e dorsale della lingua.
  8. Rimuovere le pinze e lasciare il resto del mouse per 3 a 5 minuti prima di rimetterlo in gabbia. Per garantire che normotermia è mantenuto nella microfono anestetizzatoe collegare le gabbie di un sistema di riscaldamento gabbia. Se tale sistema non è disponibile, luogo topi appartenenti al medesimo gruppo di trattamento di nuovo nel corrispondente una gabbia accanto all'altro sopra la biancheria da letto e in parte li coprono con fogli di carta tissue pulite per aiutarli a mantenere la temperatura corporea.
  9. Raccogliere campioni di tessuto in qualsiasi punto di tempo dopo l'instillazione di un agente immunomodulante per analizzare variazioni delle popolazioni cellulari indotte dal trattamento.
    NOTA: In questo particolare protocollo di somministrazione flagellin è stata effettuata 2 ore prima della sfida. Determinare il tempo ottimale tra il trattamento e la sfida per ogni particolare agente terapeutico e patogeno da testare.

2 Preparazione della sospensione batterica e intranasale sfida con Streptococcus pneumoniae

NOTA: S. pneumoniae è un patogeno umano naturale che può causare malattie mortali come la polmonite invasiva, sepsie meningite. La trasmissione può avvenire per inalazione o contatto con la mucosa. Pertanto, tutti i campioni che possono essere state a contatto con S. pneumoniae deve essere gestita in un apposito impianto di biosicurezza di livello II con un armadio biosicurezza di classe II. Controllare le procedure operative standard della vostra istituzione per quanto riguarda la manipolazione di agenti patogeni di tipo II per indumenti protettivi, smaltimento dei rifiuti e le misure di sicurezza supplementari che possono applicarsi. Gli animali infetti devono essere tenuti in gabbie a ventilazione individuale in isolatori dotati di filtri HEPA. Vaccini anti-pneumococco e la terapia antibiotica sono disponibili. Per ulteriori informazioni, vedere i riferimenti 27 e 1.

  1. Scongelare una aliquota di uno stock sospensione di lavoro di Streptococcus pneumoniae di nota numero CFU batterica preparato come descritto in 15.
  2. Centrifugare per 5 minuti a 2500 xg e RT.
  3. Eliminare il surnatante e lavare il pellet batterico sospendendolo in 1 ml di stsoluzione salina erile. Utilizzare puntali con filtro per la preparazione batteriche di sospensione, diluizioni o per sfida animale.
  4. Centrifuga di nuovo come descritto al punto 2.2.
  5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in volume appropriato di soluzione salina sterile per ottenere una sospensione di 4x10 5 CFU / 50 microlitri. Questa dose corrisponde alla dose minima batterica di S. pneumoniae sierotipo 1 E1586 che provoca una mortalità del 100% in topi BALB / c secondo studi precedenti 15.
    NOTA: Quando si stabilisce un modello di polmonite pneumococcica nei topi, la dose batterica minima che provoca il 100% di mortalità deve essere determinata per ogni particolare combinazione di ceppo batterico, sierotipo e ceppo del mouse.
  6. Omogeneizzare la sospensione batterica vortex o pipettare su e giù per 5 volte.
  7. Carico 50 ml di sospensione batterica con una punta filtro sterile e infondere il volume totale nelle narici di un topo anestetizzato. Tenere il upri del mouseght per 2 minuti e lasciare riposare in posizione dorsale per altri 2 min. Applicare veterinario unguento sui occhi e tornare gli animali per gabbia; assicurarsi di mantenere la normotermia mentre sotto anestesia.
    NOTA: In questo studio sfida batterica è stata effettuata in un volume di 50 microlitri per garantire la consegna di almeno il 90% del totale CFU nei polmoni come precedentemente determinato in 15,28. Per ridurre al minimo disagio dei volumi minori dell'animale (ad esempio, 20 ml) può essere utilizzato. Tuttavia, la consegna efficiente di batteri nei polmoni deve essere controllato; questo può essere fatto raccogliendo i polmoni 5 minuti dopo la sfida e il conteggio CFU in omogenati polmonari da placcatura diluizioni seriali su piastre di agar sangue.
  8. Confermare i numeri di CFU della sospensione batterica utilizzata per l'infezione da placcatura diluizioni seriali di 10 volte su piastre di agar sangue. Incubare O / N a 37 ° C con il 5% di CO 2 e contare il numero di colonie mucoidi presentano un caratteristico alone verde di albatteri pha emolitiche.

3 Tissue Raccolta e preparazione del campione per Citometria a flusso (FACS) Analisi

3.1) raccolta di tessuto

  1. Euthanize l'animale da dislocazione cervicale o utilizzando una camera di CO 2; aprire la cavità toracica tutta la strada fino al collo e fare un'incisione lungo le zampe anteriori per esporre il lato ventrale del collo e zona sottomandibolare.
  2. Con le belle punta ricurva pinza tirare delicatamente le ghiandole salivari e dei tessuti molli adiacenti per esporre il lato dorsale del pavimento della bocca. Utilizzando curve pinze punta sottile, prendere la mandibolare e accessori linfonodi mandibolari tirando delicatamente e metterli in una provetta contenente RPMI completo (cRPMI, per 500 ml-10% di siero fetale bovino, 5 ml di una soluzione contenente 10.000 U / ml penicillina e 10 mg / ml di streptomicina soluzione e 5 ml di L-glutammina 200 mM) o soluzione di acido nucleico conservante secondo il procedimento a valle che verràessere effettuata successivamente.
  3. Per aprire la cavità toracica fare una incisione nella membrana; utilizzando un paio di pinze ratto-dentata morsetto la cartilagine xifoideo dello sterno e con attenzione tagliare le costole su entrambi i lati dorsali a partire dalle costole false tutta la strada fino a raggiungere il punto in cui le costole vere incontrano il manubrio dello sterno.
  4. Tenendo la cartilagine xifoideo dello sterno con le pinze, tirare delicatamente per esporre gli organi della cavità toracica.
  5. Rimuovere le costole completamente tagliando le prime costole e la clavicola. Il timo apparirà come una struttura bianca di due lobi situati nella porzione anteroventral del torace vicino alla base del cuore.
  6. Prendete uno dei lobi fissando con un paio di pinze e utilizzare un paio di forbici per rimuovere i legamenti tra la sua faccia inferiore e il pericardio. Procedere per rimuovere il secondo lobo.
  7. Identificare la cavità addominale e aprirlo tagliando lungo l'asse mediano del mmuro uscular per esporre gli organi. Con un paio di pinze tagliare la cava posteriore e vena aorta toracica; rimuovere l'eccesso di sangue con un tessuto assorbente.
  8. Per analizzare le popolazioni di cellule residenti e infiltranti degli alveoli eseguire lavaggio broncoalveolare (BAL). Tagliare i muscoli nella parte ventrale del collo per esporre la trachea e l'esofago; separarli fare incisioni a fianchi laterali e dorsali delle strutture.
  9. Sollevare la trachea con le pinze e fare una piccola incisione con un bisturi per introdurre un trasferimento pipetta sottile punta riempita con 1 ml di PBS senza Ca 2 + / Mg 2 + + 1 mM EDTA. Infondere e aspirare il volume totale di almeno tre volte; aspirare e trasferire la sospensione cellulare di una provetta sterile da 1,5 ml e posizionarlo sul ghiaccio.
  10. Per analizzare le popolazioni cellulari presenti nel parenchima polmonare, prima defluire in polmoni iniettando 5 ml di PBS senza Ca 2 + / Mg 2 + e 1 mM EDTA nel ventricolo destrodel cuore.
    NOTA: Ciò elimina la maggior parte dei globuli rossi e le cellule immunitarie presenti nei vasi sanguigni dei polmoni. Se perfusione è stata eseguita correttamente, i polmoni colore si sposterà dal rosa al bianco.
  11. Isolare cuore dai polmoni fissando dalla base del ventricolo sinistro e delicatamente tagliare i vasi sanguigni con forbici per rimuovere completamente. Dai polmoni perfusi e metterli in cRPMI o soluzione di acido nucleico conservante in base all'analisi valle da eseguire.
  12. Per l'analisi delle popolazioni di cellule della mucosa sublinguale, isolare la testa dell'animale e rimuovere le ghiandole salivari e dei tessuti molli adiacenti se non è stato fatto nella fase 3.2.1.
  13. Fare un'incisione su ciascun lato della bocca fino a raggiungere l'articolazione mandibola e separare la mascella inferiore insieme con la lingua e pavimento della bocca, utilizzando perni di fissaggio a bordo dissezione. Tirare la lingua; utilizzando un bisturi fanno un'incisione in cui il baSE della lingua incontra il pavimento della bocca fino a raggiungere i terzi molari per esporre la mucosa sublinguale.
  14. Rimuovere completamente la lingua; prendere una biopsia 0,5 millimetri e posizionarlo accanto ai incisivi inferiori. Tagliare dall'inserimento del tessuto gengivale sublinguale e premere delicatamente fino a quando il pavimento della bocca è stato tagliato fuori completamente.
  15. Ripetere ancora una volta ora mettendo la biopsia vicino ai terzi molari per completare la rimozione del tessuto sublinguale. Mettere in una provetta pulita contenente cRPMI o conservanti acido nucleico.

3.2) Preparazione dei campioni per l'analisi FACS.

  1. Trasferire tessuto isolato da ogni topo dei polmoni in una piastra da 24 pozzetti e tritateli con un paio di forbici pulita fino ad ottenere piccoli pezzi di tessuto di circa 2 mm. Aggiungere 1 ml per pozzetto di mezzo di digestione contenente 30 mg di collagenasi di tipo II, 50 mg DNAsi-I in 1 ml di RPMI senza FBS. Pipettare su e giù per cinque volte e incubare a37 ° C e 5% di CO 2 per 40 min.
    1. Per l'analisi di popolazioni cellulari nel tessuto sublinguale, sostituire il mezzo digestione in 3.2.1 con una contenente 2 unità di dispasi, 30 mg di tipo II collagenasi 50 mg DNAsi-I in 1 ml di RPMI. Incubare il tessuto prelevato da un topo in 500 ml di mezzo di digestione per 20 minuti a 37 ° C in un agitatore orbitale a 50 rpm.
  2. Dopo l'incubazione, pipettare su e giù fino a 10 volte o 30 secondi fino a quando la maggior parte del tessuto è stato interrotto. Filtrare la sospensione cellulare anche se un 40 micron filtro cella sterile e lavare con 5 ml di PBS completato con 5 mM EDTA.
    NOTA: la digestione completa della matrice extracellulare e tessuto fibroso non sarà raggiunto. Tuttavia, tempi di incubazione più lunghi in presenza di collagenasi e / o dispasi o triturazione aggressivo non sono raccomandati in quanto si tradurrà in un aumento della morte cellulare e distruzione delle proteine ​​extracellulari che incidono sul risultato complessivo della FACS.
  3. Centrifugare a 400 xg, 5 min, 4 ° C.
    1. Per l'analisi delle popolazioni cellulari in BAL, centrifugare le cellule a 400 xg, 5 min, a 4 ° C e continuare con il passo 3.2.4.
    2. Per l'analisi di popolazioni cellulari nei linfonodi, inserire un filtro 70 micron cella su una piastra di Petri sterile e mettere la linfonodi insieme con 1 ml di cRPMI nel filtro. Estrarre il tuffo di una 2 ml siringa sterile e usarlo come un pestello per schiacciare i linfonodi nei confronti della maglia del filtro. Sciacquare il filtro cella con 1 ml di fresca cRPMI e trasferire le cellule dalla capsula di Petri in una provetta sterile.
  4. Prelevare un'aliquota rappresentante di ciascun campione e macchiare con Trypan Blue per determinare il numero di cellule vitali.
  5. Risospendere le cellule in FACS-EDTA: PBS-EDTA 5 mM-1% di siero bovino Albumina per comporre una sospensione di 2x10 7 cellule / ml e aggiungere 50 ml in un tubo citometro.
  6. Preparare una miscela di anticorpi 2X contenente l'appropriate combinazioni di anticorpi contro marcatori di superficie e fluorocromi in base allo strumento FACS disponibile. Aggiungere 50 microlitri della miscela anticorpale 2X in ogni provetta contenente la sospensione cellulare.
    NOTA: Titolare ciascun fluorocromo anticorpo marcato per determinare la quantità ottimale da utilizzare, per un protocollo dettagliato vedi riferimento 29.
  7. Incubare 30 min in ghiaccio al buio.
  8. Lavare una volta con 3 ml di FACS-EDTA e centrifugare le cellule per centrifugazione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere le cellule in 200 microlitri dello stesso tampone e analizzare in un citometro di flusso.
    NOTA: Se la manipolazione di un gran numero di campioni, il protocollo di colorazione per l'analisi FACS sopra descritto può essere eseguito in piastre a 96 pozzetti con fondo a U, invece di tubi citometro. Tuttavia, se si utilizza 96 pozzetti passi piastre di lavaggio deve essere eseguita aggiungendo fino a 200 ml di FACS-EDTA e ripetendo 4 volte la filatura le cellule a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C tra ogni washipasso ng.
  9. A questo punto, fissare i campioni per l'analisi del citometro a flusso più tardi (fino a 72 ore dopo la fissazione).
    1. Per fissare le cellule, dopo marcatura con i FACS-anticorpi lavare le cellule in PBS senza Ca 2 + / Mg 2 +, 1 mM EDTA, senza FBS. Sospendere le cellule in 50 ml dello stesso tampone e aggiungere 50 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% appena preparata in ipertonica (2X) PBS senza Ca 2 + / Mg 2 +.
    2. Incubare per 20 min a RT e lavare 3 volte in FACS-EDTA.
    3. Risospendere le cellule in 200 microlitri di FACS-EDTA e conservare a 4 ° C e al riparo dalla luce per un massimo di 72 ore.
      NOTA: FSC-SSC può essere influenzata da fissazione. Se il fissaggio di controllo campioni compatibilità di anticorpi marcati modo fluorescente con il produttore in quanto coloranti tandem possono essere degradati in presenza di agenti fissativi. Se i campioni provenivano da animali infetti fissazione è altamente raccomandato per garantire che non patogeni vitali saranno presenti quando Analycantano i campioni in macchina FACS dal microaerosols possono essere generati durante l'acquisizione del campione.

4 Estrazione di RNA totale, cDNA Synthesis e Real Time PCR.

4.1) estrazione di RNA e sintesi di cDNA.

  1. Omogeneizzare il tessuto nella soluzione di acido nucleico di conservante scelta dalla rottura meccanica (ad esempio, utilizzando un omogeneizzatore rotore-statore, ad alta velocità di agitazione tessuto-ruptor e perline, ecc). Centrifugare a 12.600 xg per 15 min e 4 ° C per rimuovere i frammenti di tessuto. Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
  2. Estrarre l'RNA con il metodo di scelta seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: RNA è altamente suscettibile alla degradazione, se non sta per essere utilizzato subito dopo l'isolamento, rendere aliquote e memorizzarli in tubi liberi RNAsi a -80 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. I tubi devono essere maneggiati con i guanti in ogni momento. Dopo lo scongelamento dei campioni di unlways tenerli su ghiaccio.
  3. Misurare l'assorbanza di acidi nucleici a 260 nm e calcolare la concentrazione in mg / mL.
  4. Preparare DNAse-impasto con l'aggiunta di (per 1 campione): 7.6 ml di acqua ultrapura, 1 ml di tampone 10X DNAse-I, 0,4 microlitri di DNAsi-I (grado di amplificazione) stock 1 U / ml e aggiungere 8,4 ml di il DNAse-I mix di ogni campione contenente 1 mg di RNA totale.
    1. Utilizzare RNA ad una concentrazione di 1 mg / mL ed eseguire la reazione retrotrascrizione (RT-PCR) aggiungendo 1 ml di RNA come stampo. Se i campioni sono troppo diluito e la concentrazione è inferiore al previsto, aggiungere grandi quantità di RNA totale invece di acqua. Non superare il 20% del volume finale di reazione quando si aggiunge l'RNA specialmente se il protocollo di estrazione di RNA di scelta coinvolto miscela di fenolo-cloroformio dal fenolo tracce potrebbero influenzare il rendimento della RT-PCR.
  5. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente seguita da 10 minuti a 4 ° C o ice. (Non superare il tempo di incubazione !!)
  6. Aggiungere 1 ml di EDTA 25 mM (grado biologia molecolare) a ciascuna provetta e incubare a 65 ° C per 10 minuti per inattivare il DNAsi-I.
  7. Preparare retrotrascrizione (RT) mix come segue (per 1 reazione): 1 ml primer esameriche casuali stock 0,2 mg / ml, 1 ml dNTP magazzino 10 mm, 4 microlitri di buffer 5X M-MLV-RT, 2 microlitri DTT 0,1 M, 1 ml RNAse OUT magazzino 40 U / ml, e 1 ml M-MLV retrotranscriptase magazzino 200 U / ml.
  8. Aggiungere 10 ml di RT-PCR mescolano alla DNAsi-I tubo di reazione 10 microlitri.
  9. Effettuare la reazione PCR in un termociclatore secondo il seguente programma:
    Ciclo 1X: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C
  10. Diluire il cDNA 1: 5 con l'aggiunta di 80 ml di acqua ultrapura. Conservare a -20 ° C.

4.2) Real time PCR (qPCR).

  1. Preparare la miscela di reazione qPCR come segue (per 1 reazione): 5 ml master mix contenente Taq DNA Polymerase, colorante SYBR Green, PCR Buffer, dNTP mix e MgCl 2 (vedi 4.2.2); 0,9 ml di una soluzione 10 mM magazzino del primer forward, 0,9 ml di una soluzione 10 mM magazzino del primer reverse, acqua ultrapura 1.2 ml, e 2 ml di template cDNA precedentemente diluiti come indicato al punto 4.1.10.
    NOTA: concentrazione di reagente e in bicicletta protocolli utilizzati in questa sezione sono stati ottimizzati per essere effettuata in concreto con i reagenti e gli strumenti descritti nella "Tabella dei Materiali e reagenti", altre marche possono essere utilizzati, ma volumi di reazione, la concentrazione del reagente e il protocollo di ciclismo possono variare. Controllare le istruzioni del produttore prima di eseguire RT-qPCR.
  2. Impostare lo strumento qPCR come segue:
    Ciclo 1X: 15 min, 95 ° C
    40X cicli: 15 sec, 95 ° C seguita da 1 min, 60 ° C (a questo punto acquisiscono fluorescenza).
    NOTA: Per la quantificazione relativa dell'mRNA secondo il metodo Ct 30 un reference gene deve essere selezionato per la normalizzazione dei valori Ct. Riferimento gene di scelta deve essere testato in condizioni di analisi specifiche come la sua espressione può variare; ACTB, GAPDH o 18S sono alcuni dei geni normalmente scelto come riferimenti.
  3. Impostare il valore di soglia e analizzare i dati.

Risultati

Immunoterapia sublinguale può essere utilizzato con successo per modulare la risposta immunitaria polmoni. Abbiamo mostrato che una singola dose di flagellina, l'agonista TLR5 e NLRC4, può indurre significativo sovraregolazione del mRNA codificante la CXCL1 chemochine, CCL20 e la citochina IL-6 rispetto ai controlli trattati con soluzione salina. Fold induzione di livelli di mRNA alzato a 8 ore dopo SLIT e tornare ai livelli basali dopo 20 ore (Figura 1). Tuttavia, quando la SLIT è stata effettuata 2 ore prima infezione intranasale con S. Pneumoniae, i livelli di CXCL1 e IL6 mRNA rimasero sovraregolati significativamente anche 24 ore dopo SLIT rispetto agli animali non trattati (Figura 2).

Analisi delle popolazioni cellulari in BAL e tessuto polmonare mediante FACS rivelato che gli animali trattati con FLIC per via sublinguale avevano aumentato numero di neutrofili nelle vie aeree, ma non nel tessuto dei polmoni (Figura 3).

Figura 4, SLIT con flagellin promosso protezione e aumentato la sopravvivenza contro la polmonite pneumococcica acuta.

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Figura 1: Cinetica di profilo trascrizionale dei polmoni dopo immunoterapia sublinguale con flagellina. Otto a 10 settimane di età topi BALB / c (n = 4) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina per via sublinguale sotto anestesia. I polmoni sono stati raccolti in diversi momenti e posti in conservante acido nucleico. Estrazione di RNA totale è stato eseguito e cDNA è stato sintetizzato. livelli di mRNA sono stati valutati mediante real time PCR usando primer specifici elencati in Tabl1 e quantificazione relativa è stata eseguita secondo il metodo ΔCt utilizzando i livelli ACTB mRNA per la normalizzazione. I risultati sono mostrati come volte maggiore rispetto al gruppo trattato con soluzione salina come mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p <0.05) calcolati in base al test di Mann-Whitney. I risultati sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti.

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Profilo trascrizionale Figura 2 polmoni durante la polmonite pneumococcica dopo immunoterapia sublinguale con flagellina. Otto a 10 settimane i topi BALB / c (n = 4 per il gruppo di controllo e n = 7 per il gruppo trattato) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina da via sublinguale sotto anestesia. 2 ore più tardi topi sono stati sfidati per via intranasale con la dose letale minima (MLD) causando 100% di mortalità di un isolato clinico di S. pneumoniae sierotipo 1 E1585, corrispondente a 4x10 5 CFU / 50 microlitri. I polmoni sono stati raccolti 24 ore dopo la sfida e conservati in conservante acido nucleico finché sono stati eseguiti estrazione di RNA e cDNA sintesi. Real time PCR è stata effettuata (vedi elenco in fondo Tabella 1) e relativa quantificazione è stata eseguita secondo il metodo ΔCt utilizzando i livelli ACTB mRNA per la normalizzazione. I risultati sono mostrati come volte maggiore rispetto al gruppo trattato con soluzione salina come mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p <0.05) calcolati in base al test di Mann-Whitney.

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Figura 3 Analisi dei polimorfonucleati neutrofili (PMN) reclutamento nel tessuto e le vie respiratorie polmoni dopo SLIT. Eight di10 settimane topi BALB / c (n = 4) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina per via sublinguale sotto anestesia. 2 ore più tardi topi sono stati sfidati per via intranasale con la MLD di S. pneumoniae sierotipo 1 E1585. 24 ore dopo la sfida, BAL è stata eseguita e polmoni sono stati elaborati per l'analisi FACS. PMN sono stati identificati come cellule CD11b Ly6G alta / alta / CD11c negativi e basato sul profilo FCS-SSC. I risultati sono espressi come percentuale di PMN rispetto di numero di cellule totali in BAL o polmoni. Barre rappresentano mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p <0.05) calcolati secondo senso unico test di Mann-Whitney.

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Figura 4 SLIT con flagellin protegge i topi contro la polmonite pneumococcica acuta. S. pneumoniae sierotipo 1 E1585. La sopravvivenza è stata valutata su base giornaliera. Le curve di Kaplan-Meier sono stati confrontati in base Log-rank (Mantel-Cox) test. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p <0,05) .Results sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti.

Nome Sequenza 5'-3 ' PCR lunghezza del prodotto (bp)
mB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
mB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
mIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

Tabella 1 Lista Primer utilizzati per real time PCR. Sequenze di primer specifiche utilizzate per l'analisi qPCR. Avanti e indietro primer per il mouse ACTB, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa e CXCL1 sono presentati come sequenze 5'-3 'e la durata prevista del prodotto è indicato in paia di basi (bp).

Discussione

Somministrazione sublinguale di agenti terapeutici è stato dimostrato come un mezzo utile per modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio. Il vantaggio principale della SLIT per il trattamento delle malattie respiratorie è che non comporta la consegna diretta dei composti nei polmoni o le narici, essendo più sicuro di trattamenti basati sulla somministrazione intranasale 31.

Immunoterapia sublinguale può essere utilizzato per modulare la risposta immunitaria in modi diversi, sia per l'induzione di risposte normative che possono migliorare i sintomi di infiammazione allergica e asma 32 o per indurre l'attivazione transitoria dei meccanismi immunitari innati per trattare le infezioni polmonari acute come mostrato qui.

Il modello di topo presentato in questo video è un metodo conveniente per lo screening di composti diversi, come agenti terapeutici per SLIT.

Questo modello animale offre un utile mezzo per determinare l'impattodella SLIT nella risposta immunitaria dei polmoni e in altri organi (ad es., linfonodi drenanti o siti mucose distali) che non può essere imitato con l'uso di modelli in vitro. Anche se ci sono diversi documenti che descrivono i risultati ottenuti con l'immunoterapia sublinguale, non sono stati resi ancora disponibili metodi dettagliati per le procedure di somministrazione sublinguale. Inoltre, il modello può essere utilizzato per la valutazione dei vaccini sublinguali inibitori a conferire protezione sistemica e locale nel tratto respiratorio.

Come mostrato nel video allegato, la somministrazione sublinguale di composti è una procedura semplice che può essere facilmente eseguita senza la necessità di una formazione. In genere, una persona abile nella manipolazione degli animali richiede 1 ora per eseguire SLIT in un gruppo di 10 topi utilizzando anestetici iniettabili come descritto in questo protocollo. Se sfida pneumococco viene eseguita come pure, 90 min aggiuntivo sarà richiesto per prepararesospensione batterica ed effettuare intranasale sfida degli animali.

I protocolli FACS qui presentati consentono comoda caratterizzazione dell'impatto della SLIT nel sito locale di somministrazione, linfonodi, nonché i loro effetti sulla dinamica delle cellule dei polmoni.

Analisi separata dei contenuti e del polmone broncoalveolare parenchima è importante per discriminare residente immunitario delle vie respiratorie "e infiltrazione tipi di cellule da quelle che rimangono all'interno del tessuto. L'analisi del contenuto BAL consente lo studio del fatturato macrofagi alveolari nonché le dinamiche di cellule assunzione negli spazi alveolari indotte da trattamenti diversi, ad esempio., PMN, eosinofili, monociti. BAL può essere utilizzato anche per valutare la presenza di citochine e chemochine secrete da Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) o il rilevamento di anticorpi IgA secreti ottenuta dopo la vaccinazione sublinguale. Studio del tessuto dei polmonipermetterà la caratterizzazione di altri tipi di cellule, le cellule dendritiche in stile classico, le cellule T e le cellule B.

Preparazione dei campioni BAL e linfonodi per l'analisi FACS è semplice. Dopo la raccolta del campione, normalmente 60 minuti sono necessari per completare il protocollo di colorazione per 10-20 campioni. Al contrario, l'isolamento di cellule da polmoni o tessuto sublinguale richiede più tempo in quanto è necessaria la digestione della matrice extracellulare. L'assorbimento dell'agente terapeutico consegnato da via sublinguale può essere affrontato il monitoraggio di molecole modo fluorescente o marcati radioattivamente utilizzando sistemi di imaging in vivo.

Immunoterapia sublinguale è un metodo interessante per indurre efficacemente risposte immunitarie nel tratto respiratorio e sistemica che può essere usato per trattare o prevenire patologie respiratorie. Delucidazione dei meccanismi che determinano l'attivazione vs tolleranza della risposta immunitaria nel tratto respiratorio dopo SLIT is cruciale per permettere progettazione razionale di nuove strategie terapeutiche che possono essere usati da soli o in combinazione con trattamenti contro patologie respiratorie diverse.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Jean-Claude Sirard del Centro per l'Infezione e l'Immunità di Lille, Istituto Pasteur de Lille-Francia, per aver gentilmente fornito la flagellina purificata e la Dr.ssa Teresa Camou, Direttore del Laboratorio Nazionale di Riferimento, Ministero della Salute dell'Uruguay per aver gentilmente fornito il ceppo pneumococcico.

Gli autori desiderano esprimere il loro riconoscimento al Sig. Diego Acosta e al Sig. Ignacio Turel di BichoFeo Producciones-Uruguay per il loro impegno e il duro lavoro durante l'intera produzione ed edizione del video.

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni PR_FCE_2009_1_2783 e BE_POS_2010_1_2544 dall'Agenzia Nazionale per la Ricerca e l'Innovazione, ANII dall'Uruguay, dal Programma per lo Sviluppo delle Scienze di Base, dal PEDECIBA dell'Uruguay e dalla Commissione Settoriale per la Ricerca Scientifica, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di ketamina (50 mg/ml)Pharma Service, Uruguay
Soluzione di xilacino (2 %)Portinco S.A., Uruguay
Siringa sterile da 1 mlModern, Uruguay
Sterile Ago da 27 GModern, Uruguay
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Siero fetale bovinoATCC302020
Soluzione di penicillina/streptomicinaSIGMAP4333
PBS sterile senza Ca2+/Mg2+PAAH21002
Collagenasi di tipo ILife Technologies/Gibco17100017
desossiribonucleasi I (DNAsi-I)SIGMAD4513
DispasiLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 ratto coniugato anti topo IgG2b anti CD11bBD550993Clone M1/70
APC criceto coniugato anti topo IgG1 anti CD11cBD550261Clone HL3 
APC-Cy7 coniugato ratto anti topo IgG2a anti Ly6GBD560600Clone 1A8
Soluzione salina sterileLaboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay
Tryptic Soy AgarBD Difco, France236950
Sangue di pecora defibratoBiokey, Uruguay
Piastre di Petri steriliGreiner633180
p10 PipettaGilsonF144802
p20 PipettaEppendorf3120000097
p200 PipettaGilsonF123601
p200 PipettaCappC200
p200 PipettaEppendorf3120000054
p1000 PipettaEppendorf3120000062
Puntali con filtro sterile p10Greiner771288
Punte filtranti sterili p200Greiner739288
Punte filtranti sterili p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Pinze a punta fine in acciaio inossidabile SIGMAZ168785/Z168777Pinze per
tessuti per medicazioneSIGMAF4392Lunghezza 8 pollici
Pinze per micro-dissezioneSIGMAF4017Dritto 
Pinza per microdissezioneSIGMAF4142 curvo
Forbici MayoSIGMAZ265993 
BisturiSAKIRA MEDICAL
Punzone per biopsia sterile & Oslash; 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079DTubo
sterile da 1,5 mlTubo Deltalab200400P
Tubo sterile da 15 mlGreiner188271
Sterile Tubo da 50 mlGreiner227261
Pipette sierologiche sterili da 5 mlGreiner606160
Pipette sierologiche sterili da 10 mlGreiner607160
Pipette sierologiche sterili 25 mlGreiner760180
Cabina di sicurezza biologica, classe IIThermo Scientificserie 1300, tipo A2
Micro-Isolatore CremaglieraRAIR  IsoSystem 76144WSuper  Topo  1800 AllerZone 
Microcentrifuga refrigerataEppendorfLegend Micro 21R
MicrocentrifugaHeraeusBiofuge-pico
CentrifugaThermo ScientificSorval ST40R
CO2 Incubatore Modello Thermo Scientific  3111
Pipette pasteur sterili a punta sottilePipetteDeltalab D210022
Piastra sterile a 24 pozzettiDeltalab
Life TechnologiesContatore automatico di celle T10282
- CountessLife TechnologiesC10227 
Countess Cell Counting Chamber Vetrini LifeTechnologiesC10312
Provette per citometria a flussoBD343675
Citometro a flusso - FACS Canto-IIBD
Strumento PCR in tempo reale - Rotor Gene Q o ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Reagente TrizolLife Technologies15596-026Molecolare Grado di biologia
DNAse-ILife Technologies18068-015Grado di biologia molecolare
DNAse-I Buffer 10XLife Technologies18068015Grado di biologia molecolare
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Grado di biologia molecolare
Acqua ultrapuraLife Technologies10977
RNAse di grado diLife Technologies100000840Primer
esameri casualiTechnologiesN8080127
tampone M-MLV-RTTechnologies18057-018enzima di biologia molecolare
di grado M-MLV-RT LifeTechnologies28025-021
Kit di PCR verde QuantiTect Syber diQiagen204143Primer specifici per il grado di biologia molecolare
 Grado di biologia molecolareTechnologies
curve e diritte con diametro 5 mm pasteur sterili 200007 Greiner 662160 Soluzione blu di tripano  biologia molecolare per di grado di biologia molecolare Life di grado di biologia molecolare Life grado di biologia molecolare Life

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