Articolo metodologico
Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.
Riportiamo qui un protocollo robusto ed efficiente per l'espressione di proteine fluorescenti dopo iniezione di mRNA in ovociti non fecondati dell'anfiosso cefalocordatato, Branchiostoma lanceolatum. Utilizziamo costrutti per mCherry ed eGFP a membrana e a bersaglio nucleare che sono stati modificati per adattarsi all'uso del codone dell'anfiosso e alle sequenze di consenso di Kozak. Descriviamo il tipo di aghi per iniezione da utilizzare, il protocollo di immobilizzazione per gli ovociti non fecondati e la configurazione generale dell'iniezione. Questa tecnica genera embrioni marcati in fluorescenza, in cui le dinamiche dei comportamenti cellulari durante lo sviluppo iniziale possono essere analizzate utilizzando le più recenti strategie di imaging in vivo. Lo sviluppo di una tecnica di microiniezione in questa specie di anfiosso consentirà analisi di imaging dal vivo dei comportamenti cellulari nell'embrione e manipolazioni specifiche del gene, tra cui la sovraespressione genica e il knockdown. Nel complesso, questo protocollo consoliderà ulteriormente l'anfiosso dei cordati basali come modello animale per affrontare questioni relative ai meccanismi dello sviluppo embrionale e, soprattutto, alla loro evoluzione.
Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare in tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto 1, o dall'introduzione specifica ne....
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1. Preparazione di strumenti e reagenti
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Il protocollo descritto sopra fornisce la base per la microiniezione di B. ovociti lanceolatum e quindi per l'introduzione nella sviluppare B. embrioni lanceolatum di mRNA che codificano proteine fluorescenti per l'imaging in vivo. Sebbene la tecnica è certamente robusto ed affidabile, il tasso di successo di iniezioni utilizzando questo protocollo rimane variabile (Tabella 1). La spiegazione molto probabile per questo fatto interessante è l'estrema variabi.......
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In questo articolo, presentiamo, per la prima volta, un protocollo dettagliato e riproducibile per l'iniezione di B. ovociti lanceolatum, che, dopo il B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, è quindi la terza specie anfiosso, per cui tale tecnica è stata descritta. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto comprende inoltre la descrizione di sistemi vettore adatto per la produzione di proteine fluorescenti in B. lanceolatum da mRNA inie.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da parte del "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" per la zootecnia. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, dalla sovvenzione dell'Unione Europea FP6 "Embryomics" e dalla concessione ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "di Jean-François Nicolas e Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho è finanziato da una borsa di studio di dottorato FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Le richieste di vettori qui descritte possono essere indirizzate direttamente agli autori.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Consumabili | |||
| 35 mm Piastre di Petri | Falcon | 353001 | trattata con coltura |
| (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μ m |
| Tubi Spin-X | Costar | 8160 | 0.22 μ m |
| Barattolo per aghi per capillari da 1,2 mm di diametro | WPI | E212 | |
| Pipette | lunghe 230 mm | ||
| Tubo di aspirazione | Dutscher | 75056 | |
| Capillari per aghi da iniezione | Sutter | BF 120-94-10 | Vetro borosilicato con filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lunghezza 10 mm |
| Reagents | |||
| Agarosio a basso punto di fusione | Sigma | A9414 | |
| Rosso fenolo | Sigma | 114537 | |
| Glicerolo | Sigma | G2025 | |
| Bromidrato di poli-L-lisina | Sigma | P9155 | |
| H2O, senza DNasi/RNasi | Gibco | 10977-035 | |
| mMessaggio mMachine SP6 Kit | di trascrizioneKit | di sintesi mRNA | AM1340 |
| Fenolo pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 cloroformio:alcool isoamilico | Sigma | C0549 | |
| 5:1 fenolo pH 4,7:cloroformio | Sigma | P1944 | |
| Reef Sali cristallini (200 kg) | Europrix | Sali commerciali | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Telescopio da dissezione fluorescente con ingrandimento 200X Leica | MZ16F | 25X oculari, filtri DSR e GFP2 | |
| Micromanipolatore | Marzhauzer | M-33 | |
| Iniettore | Picospritzer | modello II o III | |
| Estrattore per aghi | Sutter | P97 | Estrattore per aghi per filamenti riscaldanti |
| Pinze fini | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
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