Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

Sommario

Abbiamo sviluppato un modello di lesione polmonare nel topo mediante iniezione intra-tracheale del batterio Pseudomonas aeruginosa. Questo modello imita il danno polmonare durante la polmonite ed è clinicamente rilevante.

Abstract

Per studiare danno polmonare acuto umana e la polmonite, è importante sviluppare modelli animali per simulare varie caratteristiche patologiche di questa malattia. Qui abbiamo sviluppato un modello di topo polmone lesioni da iniezione intra-tracheale di batteri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizzando questo modello, siamo stati in grado di mostrare l'infiammazione polmonare in fase precoce di lesioni. Inoltre, alveolare leakiness barriera epiteliale è stato osservato analizzando lavaggio broncoalveolare (BAL); e la morte delle cellule alveolari è stato osservato da Tunel test utilizzando il tessuto ottenuto da polmoni feriti. In una fase successiva dopo un trauma, abbiamo osservato proliferazione cellulare richiesto per il processo di riparazione. L'infortunio è stato risolto 7 giorni dalla apertura di P. aeruginosa iniezione. Questo modello riproduce il corso sequenziale di infiammazione polmonare, lesioni e di riparazione durante la polmonite. Questo modello animale clinicamente rilevante è adatto per studiare la patologia, il meccanismo di riparazione, fopo danno polmonare acuto, e può anche essere usato per testare potenziali agenti terapeutici per questa malattia.

Introduzione

I polmoni sono esposti agli agenti patogeni ambientali e sono suscettibili di infiammazione e lesioni ^1-3. In condizioni patologiche come la polmonite o sindrome da sofferenza respiratoria dell'adulto (ARDS), agenti patogeni e fattori infiammatori rilasciati dai leucociti inducono lesioni e la morte delle cellule alveolari ^1-3. E 'importante sviluppare modelli animali di danno polmonare acuto per facilitare lo studio della patologia del pregiudizio, nonché il meccanismo di riparazione.

Attualmente, la maggior parte delle persone usano iperossia e bleomicina topo indotto modelli danno polmonare ^4. Tuttavia, i meccanismi di iperossia causato lesioni non sono gli stessi come maggior parte delle lesioni polmonari comuni che si verificano durante polmonite o ARDS ^5. Bleomicina indotta lesione acuta è rara in un contesto clinico ^4. Qui riportiamo un polmone modello di lesione del mouse usando iniezione intra-tracheale di P. aeruginosa ^6,7. Questo modello è clinicamente rilevante, e imita il processes che accadono dopo la polmonite ^8.

Come un opportunista, agente patogeno nosocomiale di individui immunocompromessi, P. aeruginosa infetta in genere il tratto polmonare, delle vie urinarie, ustioni, ferite, e causa anche altre infezioni del sangue ^6. Il batterio rilascia virulenza fattore esotossina A, si moltiplicano e si scatenano risposte immunitarie ^6. Somministrazione intra-trachael di P. aeruginosa riflette la situazione di esposizione umana ai batteri che causano la polmonite e la patologia è probabile che sia diverso dal virus H1N1 dell'influenza polmonare indotta modello di lesione recentemente riportato ^9. Dal momento che P. aeruginosa è un patogeno opportunista, è relativamente sicuro da maneggiare rispetto ad alcuni dei patogeni più virulenti. Qui abbiamo usato iniezione intra-tracheale per amministrare i batteri, perché abbiamo osservato che questo metodo ha introdotto più batteri nella regione distale alveoli del polmone rispetto aalcune altre procedure come l'utilizzo di un catetere attraverso la bocca.

Rispetto ad altri modelli di danno polmonare acuto, il P. aeruginosa modello qui descritto è adatto per studiare danno polmonare indotta da batteri e infiammazione eccessiva. A differenza di altri modelli animali che utilizzano P. aeruginosa per indurre la sepsi ^10,11, qui si usa l'iniezione intra-tracheale di questi batteri di indurre localizzata danno polmonare acuto.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali e istituzionali biosicurezza Comitati della University of Illinois a Chicago.

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono Pseudomonas devono essere eseguite con il livello di biosicurezza 2 (BSL2) pratiche, che includono ma non sono limitate a: maschera, occhiali di protezione, abito o tuta, e due paia di guanti. Lavorare in sicurezza biologica certificata Gabinetto. Trattare gli strumenti in contatto con i batteri con candeggina o biossido di cloro disinfettante a base. Utilizzare una scatola sigillata per i campioni di trasporto.

1. P. aeruginosa cultura e di crescita

1. Negozio P. aeruginosa PA103 come uno stock batterica in un tappo a vite esageratamente a -80 ° C.
2. Posizionare la fiala in un rack in una scatola con etanolo al 70% bagnato asciugamani di carta e prendere al laboratorio livello di biosicurezza 2 (BSL2).
3. Streak i batteri su piastre di agar sangue di pecora e crescono a 37 ° C per ~ 15 ore in un incubatore.
4. In una cappa BSL2, graffiare i batteri dalla piastra con batteri loop e risospendere in 5 ml di PBS.
5. Conservare il titolo a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. Tuttavia, determinare il titolo ogni 2 settimane.
6. Serialmente diluire i batteri in PBS (di solito da 1:10 a 1:10 ^{4 7)} e piastra fuori la diluizione noto su piastre di agar sangue di pecora.
7. Incubare le piastre per ~ 15 ore. Contare le colonie e calcolare Colony Forming Unit (CFU) per determinare la concentrazione di batteri.
8. Risospendere le concentrazioni appropriate (~ 5 x 10 ³ UFC / ml) in 0,5 ml di PBS in 1,5 ml sterili cryovials con tappo a vite. Sigillare i cryovials e metterli in un rack esageratamente sul disinfettante salviette di carta a pieno carico in una scatola coperchio a scatto.
9. Trasportare la casella di stabulario BSL2. Una volta lì, aprire la scatola nell'armadio BSL2.

2. P. aeruginosa instillazione

1. Eseguire un intervento chirurgico di sopravvivenza in condizioni asettiche (guanti sterili, strumenti sterili, ed impiegare tecniche asettiche). Utilizzare un telino sterile per fornire un piano di lavoro per la (autoclave) gli strumenti chirurgici sterili. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore tallone caldo tra ogni instillazione tracheale procedura.
2. Pesare i topi prima di anestesia. Anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), in 0,1 - 0,2 ml di PBS per via intraperitoneale (ip). Determinare l'efficacia dell'anestetico dalla non rispondenza alle pinch punta. Usare una pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
3. Trattenere mouse su una scheda chirurgico in armadietto BSL2.
4. Identificare l'area per il taglio verso il basso. Radere questo settore e preparare la pelle con alternanza di alcol e tamponi povidone iodio 3 volte.
5. Trattare l'area di incisione con anestetico locale (lidocaina) poiché l'anestesia è sufficiente per un intervento chirurgico minore come un incisione cutanea per accedere alla trachea.
6. Fai una piccola incisione (circa 5 mm) sulla linea mediana del collo, e l'uso schietto forceps per spostare delicatamente il muscolo per l'accesso alla trachea. Esporre la trachea da dissezione chirurgica.
7. Disegna la soluzione di batteri in un 1 ml siringa monouso con ago 27 G. Per ogni mouse, somministrare 20-30 ml di batteri alla concentrazione adeguata (fino a 10 ⁵ CFU ogni mouse).
8. Inserire l'ago nella trachea. Iniettare la soluzione lentamente nel tracheale.
9. Assicurarsi che i rantoli di animali, che di solito indica che la soluzione ha raggiunto nei polmoni.
10. Chiudere la ferita con punti di sutura sterili (6-0 monofilamento) in condizioni asettiche.
11. Utilizzare 0,1 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea come post-operatoria analgesia per controllare il dolore postoperatorio.
12. Assicurarsi che il tempo richiesto dalla induzione di anestesia prima di incisione di chiusura è inferiore a 15 min.
13. Dopo l'iniezione, gettare siringhe e aghi in un apposito contenitore per rischio biologico taglienti.
14. Trattare gli strumenti chirurgici con disi a base di biossido di cloronfectant per 15 minuti, risciacquare e tornare al laboratorio per la sterilizzazione e il riutilizzo, se necessario.
15. La casa dei topi singolarmente in gabbie pulite in ambiente caldo.
16. Controllare sull'animale ogni 30 minuti fino a quando non riprende conoscenza e comincia a muoversi; e in seguito a intervalli di 12 h per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
17. Tenere i topi nella struttura BSL2 animali tutto l'esperimento. Assicurarsi che solo il tessuto contenute in scatola sigillata lasciano l'impianto BSL2 animali. Se i topi esprimono uno dei comportamenti moribondi (definito come distress respiratorio, letargia, incapacità di deambulare in risposta alla stimolazione dolce) in qualsiasi punto dello studio, i topi eutanasia da CO ₂ inalazione da una fonte in bottiglia seguita da dislocazione cervicale.
18. Euthanize il soggetto sperimentale per dissanguamento in anestesia.
    1. Raccogliere tessuto polmonare di topi eutanasia. Eseguire queste procedure in un cappuccio BSL2. Se necessario, trasferire il campione utilizzando tubi sigillati posti in una rack su disinfettanti carta assorbente pieno carico in una scatola coperchio a scatto per un ulteriore processo.

Risultati

Partendo 24-72 ore dopo P. iniezione aeruginosa, aumentata cellularità è stata osservata in sezioni polmonari (Figura 1A-D). Il polmone ha iniziato a recuperare da infortuni 96 ore dopo (Figura 1E). A 7 giorni dopo il P. aeruginosa, normale morfologia alveoli è stato in gran parte restaurato (Figura 1F). Tunnel di colorazione sezioni grazie polmonari preparati in 24 ore di post P. aeruginosa ha mostrato la morte cellulare nelle cellul...

Discussione

Il mouse polmone modello di lesioni Pseudomonas che descriviamo qui imita l'intero processo di infiammazione, danno polmonare, la riparazione e la risoluzione che si verificano a seguito di lesione polmonare acuta o polmonite. Ha vantaggi unici a confronto con diversi altri modelli di pregiudizio, in quanto è clinicamente rilevante e relativamente sicuro e facile da maneggiare.

La fase critica nella procedura è che l'iniezione della soluzione di batteri deve essere molto lenta. Se l&...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anestetico: ketamina, xilazina, lidocaina, buprenorfina			grado farmaceutico
Ago da 27 G		Fisher 1482648
Fisher		14823434	forbici da 1 ml
	scienza
fine Pinze	Strumenti
fine Sutura	Fisher	19-037-526
Calibro oculare, guanto, camice
		a base di biossido di cloro
			biosicurezza
agar per sangue di pecora	Fornitura Medex	HL-1160

Siringa Strumenti di di scienza Disinfettante per armadio di Piastre di Clidox