Articolo metodologico

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

DOI:

10.3791/52058

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2 gennaio 2015

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1Abteilung Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive i metodi per la sintesi e l'etichettatura fluorescente di nanoparticelle (NP). Le NP sono stati applicati in esperimenti di pulse-chase di etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche. Manipolazione del sistema endo-lisosomiale dalle attività del patogeno intracellulare Salmonella enterica sono state seguite da imaging cellulare dal vivo e quantificato.

Abstract

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Nanoparticelle fluorescenti (NP) con proprietà ottiche e meccaniche chimiche desiderabile, sono strumenti promettenti per etichettare organelli intracellulari. Qui, si introduce un metodo che utilizza oro-BSA-rodamina PN per etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche e monitorare manipolazioni di accoglienza vie cellulari dal patogeno intracellulare Salmonella enterica. Le NP sono stati prontamente internalizzati dalle cellule HeLa e localizzate in tardo endosomi / lisosomi. Infezione da Salmonella indotto riassetto delle vescicole e accumulo di NP in strutture a membrana Salmonella- indotte. Abbiamo implementato il pacchetto software Imaris per analisi quantitative di immagini di microscopia confocale. Il numero di oggetti e la loro distribuzione dimensionale in cellule non infette erano distinte da quelle in cellule -infected Salmonella, indicando estremamente rimodellamento del sistema endo-lisosomiale by WT Salmonella.

Introduzione

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Nanoparticelle fluorescenti (NP), comprese le nanoparticelle di metallo, i punti quantici, nanoparticelle polimeriche, NP di silice, punti di carbonio, ecc, hanno attirato una notevole attenzione nel corso degli ultimi decenni 1,2. Rispetto ai tradizionali coloranti organici, NP fluorescenti mostrano chimiche, proprietà ottiche e meccaniche desiderabili, come forte intensità del segnale, resistenza photobleaching ed alta 3,4 biocompatibilità. Questi vantaggi loro il metodo di scelta per il rilevamento intracellulare e imaging cellulare dal vivo fanno. Inoltre, una varietà di elettroni NP-dense sono visibili mediante microscopia elettronica (EM), facilitando il loro utilizzo per l'analisi microscopica correlata, che consente combinazione di cellule vive di inseguimento con microscopio ottico (LM) e la risoluzione superiore a livello ultrastrutturale con EM 5. Ad esempio, NP oro sono stati da tempo utilizzati in modo efficiente come biosensori nelle cellule sensibili per la diagnosi vita così come nel campo della immuno-etichettatura 6. S recentiTUDI indicano che NP oro con forme e dimensioni diverse possono essere facilmente assorbimento da una grande varietà di linee cellulari e trasportare regolarmente attraverso la via endosomal, hanno quindi grande essere potenziale applicato per il monitoraggio del trasporto intracellulare di vescicole e l'etichettatura sistema endo-lisosomiale 7,8 .

Agenti patogeni microbici, come la Salmonella enterica, Shigella flexneri e Listeria monocytogenes, hanno sviluppato diversi meccanismi di invadere le cellule ospiti non fagocitiche 9. Dopo essere stato interiorizzato, gli agenti patogeni, sia localizzate nel citoplasma o sequestrati in compartimenti di membrana, interagiscono molto con i loro ambienti host e modulano questi per favorire la propria sopravvivenza 10. Ad esempio, Salmonella enterica risiede e replica all'interno di un vano phagosomal intracellulare definito il -contenenti vacuolo Salmonella (SCV) dopo l'infezione 11. Il SCV stagionaturatraffici verso l'apparato di Golgi, subendo continue interazioni con il percorso endocitica, e induce la formazione di estese strutture tubolari, come Salmonella filamenti -indotta (SIF), ordinamento tubuli nexin, Salmonella carrier secretoria indotta proteine ​​di membrana (3) SCAMP3 tubuli, etc . 12-14. Studiare come questi batteri patogeni manipolano percorsi host-cellule è fondamentale per la comprensione di malattie infettive.

Qui, NP gold-BSA-rodamina sono stati utilizzati come traccianti fluido per etichettare il cellulare sistema endo-lisosomiale di accoglienza, e l'umano patogeno gastrointestinale Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (Salmonella) è stato utilizzato come modello batterio per studiare le interazioni del patogeno con il ospiterà pathway endocitico. Intracellulari NP gold-BSA-rodamina nelle cellule e le cellule non infette infettate con WT Salmonella o ceppi mutanti sono stati ripresi da un microscopio confocale a scansione laser (CLSM).Poi software Imaris è stato utilizzato per quantificare la distribuzione di NP, che indica che l'infezione da Salmonella indotto estrema riassetto endosomi / lisosomi. Dopo la descrizione di questo metodo, gli esperimenti analoghi possono essere progettati per tenere traccia destino a lungo termine delle NP interiorizzato e per indagare l'influenza di varie sostanze esogene o fattori endogeni sulla via endocitica delle cellule eucariotiche.

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Protocollo

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1. Sintesi di 10 nm oro nanoparticelle (NP Oro) 15

  1. Preparare la soluzione A: aggiungere 2 ml di 1% acquosa di cloruro di oro in 160 ml Milli-Q, o doppio distillata, acqua.
  2. Preparare la soluzione B: aggiungere 8 ml 1% trisodico citrato x 2 H 2 O e 160 ml 1% di acido tannico in 32 ml Milli-Q, o doppio distillata, acqua.
  3. Riscaldare soluzione A e B a 60 ° C e mescolare agitando. Osservare immediatamente un colore blu scuro. Osservare il colore rosso dopo circa 15 min. Poi riscaldare fino a 95 ° C, 5 min mantenere e raffreddare la soluzione a RT.
  4. Aggiungere una goccia della sospensione NP su una griglia di carbonio rivestito e lasciare asciugare all'aria. Controllare la dimensione e la morfologia delle NP mediante microscopia elettronica a trasmissione.

2. Rivestimento di oro NP con BSA e etichettatura con Rhodamine N-hydroxysuccinimidyl Ester (NHS) 16

  1. Aggiungere 900 microlitri NP oro in una provetta Eppendorf da 1,5 ml, centrifugare a 15.000 xg per 30 min. Opzionale, preparare più tubi possono contemporaneamente.
  2. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 900 ml sterilizzato Milli-Q acqua e aggiungere 100 ml 2 mg / ml BSA / PBS, mescolare in un Vortex a 800 rpm per 30 min.
  3. Per rimuovere l'eccesso di BSA, centrifugare la preparazione a 15.000 xg per 60 min.
  4. Eliminare il surnatante, e ri-sospendere i NP oro BSA in 125 microlitri PBS, aggiungere 12,5 ml di 1 M di bicarbonato.
  5. Immediatamente prima dell'uso, preparare una soluzione di 10 mg / ml di rodamina NHS / DMSO, aggiungere 30 ml di soluzione rhodamine / DMSO NHS a 1 ml della sospensione oro-BSA NP. Incubare la reazione per 2 ore (o O / N) a RT 800 rpm durante la miscelazione, evitando l'esposizione alla luce.
  6. Purificare le NP d'oro-BSA-rhodamine tramite dialisi contro PBS a 4 ° C con 5 cambi tampone nel periodo di 36 - 48 ore.
  7. Per stabilizzare NP, aggiungere 10 ml di 200 mg / ml BSA / PBS in ogni 1 ml NP gold-BSA-rodamina. Per rimuovere la centrifuga gratuito o rilasciato BSA-rodamina, a 15,000 xg per 60 min. Risospendere il pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, misurare OD 520, e conservare a 4 ° C, evitando l'esposizione alla luce.
  8. Diluire le NP 10 volte con Milli-Q o acqua bidistillata, aggiungere una goccia su una griglia di carbonio rivestita, e lasciare asciugare all'aria. Controllare la dimensione e morfologia delle NP mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
    NOTA: Tutti i materiali utilizzati per la preparazione NP sono stati sterilizzati e l'operazione è stata condotta in una cappa di coltura cellulare o su una panchina accanto a una fiamma.

3. Cultura di cellule HeLa

  1. Cellule HeLa esprimenti stabilmente LAMP1-GFP sono coltivate in DMEM con 10% siero fetale di vitello (FCS) e coltivate a 37 ° C in atmosfera contenente il 5% di CO 2.
  2. Seme le cellule ad una densità di 50.000 per bene in un 8-pozzo vetrino camera (Ibidi) e incubare O / N.

4. Cultura di batteri

  1. Usa Salmonella enterica sierotipo Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) ceppo. Per confronto, utilizzare ceppi mutanti Δ SSAV difettosi nel SPI2-T3SS e Δ SIFA privi effettori chiave Sifa per SIF. Utilizzare ceppi ospitano plasmide pFPV25.1 per l'espressione costitutiva di una maggiore GFP.
    NOTA: ceppi batterici sono regolarmente coltivate in Luria-Bertani brodo (LB) con l'aggiunta di 50 mg / ml carbenicillina (WT) e LB con l'aggiunta di 50 mg / ml carbenicillina e / o 50 mg / ml kanamicina (Δ SSAV, Δ SIFA ) di richiesta per mantenere plasmidi.
  2. Inoculare una singola colonia di batteri in 3 ml LB con antibiotici appropriati e crescere O / N a 37 ° C, in condizioni che agitano per l'aerazione, quindi diluire 1:31 in fresco LB e continuare la crescita per 3,5 ore. A questo punto-punto, le culture raggiungono la fase log tardi e batteri sono altamente invasiva. A 'tamburo roller' è conveniente per incubare culture provetta con aerazione.

5. L'infezione di cellule HeLa daSalmonella e oro-BSA-Rodamina NP Pulse Chase-etichettatura (vedi Figura 1 per programma)

  1. Misurare OD 600 dei batteri sub-coltura e diluire a OD 600 = 0.2 in 1 ml di PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml), aggiungere quantità appropriate di batteri alle cellule HeLa in vetrini camera 8 pozzetti per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 100.
  2. Incubare per 30 minuti in incubatrice cellulare, lavare 3 volte con PBS per rimuovere i batteri non internalizzati (questo punto il tempo è stato impostato come 0 ore dopo l'infezione, o 0 hr pi). Aggiungere 300 ml di terreno di coltura fresco contenente 100 mg / ml di gentamicina e mantenere per 1 ora. Quindi sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente 10 ug / ml gentamicina per il resto del tempo di incubazione.
  3. Dopo l'incubazione con mezzo di coltura contenente 100 ug / ml gentamicina per 1 ora, il mezzo viene sostituito con mezzo di imaging (Eagles MEM senza FCS, L-glutammina, rosso fenolo e bicarbonato di sodio, con HEPES 30 mM, pH 7,4) containing 10 mg / ml di gentamicina. NP oro-BSA-rodamina vengono aggiunti alle cellule HeLa per ottenere una concentrazione finale di OD 520 = 0.1.
    NOTA: NP Gold-BSA-rodamina può anche essere aggiunto alle cellule prima dell'infezione, o in vari punti temporali pi
  4. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere il terreno, lavare 3 volte con PBS e aggiungere 300 ml di mezzo fresco contenente immagini 10% FCS e 10 ug / ml gentamicina per il resto del tempo di incubazione.
    NOTA: Durata di incubazione può variare a seconda della concentrazione di NP e linee cellulari utilizzate. Per macrofagi RAW264.7, abbiamo osservato che 30 min incubazione con NP ad una concentrazione di OD 520 = 0,05 consentito internalizzazione sufficiente.

6. Imaging

  1. Utilizzare un sistema di imaging confocale come un confocale a scansione laser (CLSM) o disco rotante (SD) microscopio con una camera umidificata ambiente per immagini ad alta risoluzione in diversi punti temporali.
  2. Accendere la temperatura control sistema e attendere che sia stabile. Ottimizzare le impostazioni di imaging come l'ingrandimento, velocità di scansione, la risoluzione, Z-stack ecc Utilizzare adeguate impostazioni di eccitazione / emissione per GFP e NP gold-BSA-rodamina. Per questo protocollo, utilizzare una velocità di scansione di 400 Hz, risoluzione di 512 x 512 pixel e formato Z-passo di 0,25 micron. Excite GFP e oro-BSA-rodamina utilizzando un laser Ar (488 nm) e un laser HeNe (543 nm), rispettivamente. Include un campo chiaro (BF) canale per osservare la forma delle cellule. Per gli altri sistemi di microscopia e condizioni di infezione, l'impostazione deve essere adeguato di conseguenza.
    NOTA: utilizzare lo stesso laser Ar come la sorgente luminosa del canale BF e il segnale è stato rilevato con un rilevatore fotomoltiplicatore (PMT).
  3. A indicata punti temporali pi, montare le diapositive camera 8 pozzetti contenenti cellule infettate sul palco microscopio e registrare le immagini.

7. Analisi di Immagini

  1. Utilizzare microscopia software di analisi dell'immagine (vedi Salmonella. Aprire i dati cliccando su 'Open' e scegliendo il file.
    NOTA: In alternativa, i pacchetti di software open source, come ImageJ o FIJI possono essere utilizzati per l'immagine analisi quantitative.
  2. Nella barra degli strumenti oggetti del click Surpass vista sull'icona figure-protocol-1 aggiungere un nuovo elemento di superficie. Clicca su figure-protocol-2 (Il Prossimo).
  3. Per analizzare una regione di interesse (ROI), selezionare un segmento ROI. In un area di visualizzazione, una sezione rettangolare, delimitata sovrapposto sull'immagine sta rappresentando il ROI. Immettere i valori nelle direzioni x corrispondente, Y e campi Z-, o cliccare direttamente sulle frecce nel rettangolo di anteprima per modificare le dimensioni e la posizione della ROI. Quindi fare clic su figure-protocol-3 = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Avanti).
  4. Come canale sorgente, selezionare Canale 3 (segnale per Gold-BSA-Rhodamine NP). Selezionare l'opzione liscio per impostare la morbidezza della superficie risultante. Definire un valore manualmente o accettare il valore generato automaticamente. Per Soglia, selezionare l'opzione Intensità Assoluto.
  5. Per la regolazione della soglia, selezionare l'opzione manuale e impostare un valore. Nell'area di visualizzazione, un'anteprima soglia superficie viene visualizzato in grigio.
  6. Sulla scheda Classificare Superfici superficie risultante può essere filtrato da vari criteri. Un filtro predefinito è 'il numero di voxel> 10', e altri filtri può essere inclusa, cliccando su 'Aggiungi'. Se un filtraggio non è necessario, quindi eliminare tutti i filtri facendo clic sul pulsante Elimina. Fare clic figure-protocol-4 (Il Prossimo).
  7. Per completare la creazione di superficie, cliccate su/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Fine). Nell'elenco Oggetto, ora deselezionare la casella per il volume prodotto e nuova superficie creata viene visualizzata nell'area di visualizzazione.
  8. Esportare le statistiche. Ora, nella vista superare i colori dei soggetti variano da porpora a rosso in base alla loro superficie. E il tavolo 'Numbers Superficie Totale' mostra le informazioni statistiche (ad esempio, il numero ID e l'area degli oggetti). Esportare tutte le statistiche di superficie 1 in un file Excel per click figure-protocol-5 (Save).

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Risultati

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NP d'oro sono stati generati attraverso un metodo consolidato attraverso la riduzione dell'acido cloroaurico per citrato e acido tannico. Come mostrato in Figura 2A, PN oro sintetizzati erano quasi-forma sferica con una dimensione di circa 10 nm. BSA-rivestimento e rodamina-etichettatura non hanno influenzato la loro morfologia e dimensione (Figura 2B).

E 'stato riportato che le NP d'oro possono essere facilmente assorbiti da varie cellule di mammiferi e fin...

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Discussione

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Il sistema endo-lisosomiale di cellule di mammiferi controlla importanti processi fisiologici, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, la trasduzione del segnale ormonale mediata, sorveglianza immunitaria, e l'antigene presentazione 17. Fino ad ora, una varietà di marcatori sono stati utilizzati per l'etichettatura dei pathway studi e monitoraggio endocitici. Ad esempio, le sonde LysoTracker sono sonde fluorescenti acidotropic sviluppati da Molecular Probes (Life Technologies, USA) per l'etichet...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft con la sovvenzione Z nell'ambito di Sonderforschungsbereich 944 'Fisiologia e dinamica dei microcompartimenti cellulari' e HE1964/18 nell'ambito del programma prioritario 1580.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro d'oroSigma-Aldrich520918
Acido tannicoSigma-Aldrich403040
Citrato trisodicoSigmaC8532
Albumina sierica bovinaSigmaA2153
NHS-RhodaminePierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamicinApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
vetrini da camera a 8 pozzettiIbidi80826coltura tissutale trattata, sterile
Software ImarisBitplane versione 7.6varie configurazioni disponibili

Riferimenti

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