In questo articolo mostriamo un metodo per preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica, utilizzando una soluzione fisiologica convenzionale senza particolari modifiche per il taglio (come l'aggiunta di saccarosio) e senza perfusione intracardica dell'animale prima della preparazione della fetta.
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Articolo metodologico
Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di fettine cerebrali acute. Questa procedura è un elemento critico per elettrofisiologici esperimenti di patch-clamp che determina in larga misura la qualità dei risultati. E 'stato dimostrato che omettendo la fase di raffreddamento durante la procedura di taglio è utile nell'ottenere fette e cellule sane, soprattutto quando si tratta di strutture cerebrali altamente mielinizzate da animali adulti. Anche se il meccanismo preciso con cui temperatura elevata per mantenere salute neurale può essere ipotizzato solo dopo, è ovvio che, quando possibile, la temperatura in cui viene eseguito il taglio dovrebbe essere vicino a condizioni fisiologiche per evitare artefatti relativi alla temperatura. Un altro importante vantaggio di questo metodo è la semplicità del procedimento e quindi il tempo di preparazione breve. Nel metodo illustrato topi adulti sono usati ma lo stesso procedimento può essere applicato con i topi più giovani e ratti. Inoltre, le seguenti cl di patchesperimento amplificatore viene eseguita su fettine cerebellari orizzontali, ma lo stesso procedimento può essere utilizzato anche in altri piani, nonché altre aree posteriori del cervello.
Introduzione
Lo scopo del metodo presentato è quello di ottenere fettine cerebrali acute alta qualità per esperimenti elettrofisiologici in vitro, specialmente quando si usano anche vecchi animali adulti o.
Il metodo di taglio cerebrale acuto, come descritto da Skrede e Westgaard 1 in due frasi eleganti, è diventato uno dei fondamenti della moderna ricerca neuroscientifica ed è impiegato in innumerevoli varianti in tutto il mondo. La qualità delle fette si riflette nel numero di neuroni per fetta vivente, il periodo di tempo durante il quale le cellule mantengono le loro proprietà elettrofisiologiche e morfologiche nonché l'integrità del tessuto. Inoltre, la durata massima delle registrazioni stabili dipende dalla qualità delle fette. Così, lungo i decenni, il metodo affettatura originale è stato ulteriormente sviluppato da gruppi di ricerca individuali che permettono di migliorare il recupero fetta dopo il taglio 2-10, spesso complesse modificazioni della composizione di taglio osoluzioni di recupero r (come l'aggiunta di ascorbato, tiourea o H 2 O 2) e intra-cardiaca pre-perfusione dell'animale con soluzioni fisiologiche raffreddate.
Come è stato recentemente dimostrato 11, temperatura fisiologica durante l'affettatura sembra essere più vantaggioso di raffreddamento per la salute neuronale; il miglioramento è più evidente quando si lavora con adulti (2-8 mesi) roditori. Evitare sbalzi di temperatura drammatici evita artefatti dovuti a processi dipendenti dalla temperatura nelle cellule, come la plasticità 13 e ioni canali cinetica 13,14. Tali cambiamenti potrebbero influenzare potenziale di membrana e di segnalazione intracellulare di calcio, soglia di picco e picco di forma.
Il metodo "a caldo" fetta acuta preparazione qui presentata è una procedura generale per l'ottenimento di fettine di cervello acuto di alta qualità da qualsiasi regione del cervello, tra cui il cervelletto, la corteccia e l'ippocampo, nuclei del tronco cerebrale 16 </ Sup> e il bulbo olfattivo, sia in ratti e topi.
In particolare, la procedura di affettatura temperatura fisiologica richiede che la lama di taglio vibra quasi perfettamente orizzontale ed è senza difetti strutturali. Tale precisione potrebbe non essere raggiungibile con i modelli affettatrice anziani; in tali casi, si consiglia di eseguire la preparazione fetta in condizioni di gelo-freddo come la bassa temperatura sembra rendere il tessuto più resistente ai danni meccanici, anche a costo di aberrazioni metaboliche.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali della Hebrew University and Use Committee.
1. Preparare le soluzioni e strumenti per affettare
- Preparare 1 L di soluzione fisiologica standard (SPS) contenente gli ioni descritte nella Tabella 1.
- Preparare una soluzione madre contenente i sali a 10 volte la concentrazione finale in anticipo in una bottiglia di vetro riempita con memorizzazione 1000 ml di acqua deionizzata (conduttanza 0,055 mS / cm). Aggiungere sali (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, e MgSO 4), e mescolare fino a completa dissoluzione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Effettuare la soluzione finale SPS il giorno dell'esperimento. Aggiungere 100 ml della soluzione madre a 700 ml di acqua purificata, sciogliere il glucosio (3,6 g) e NaHCO3 (2,18 g) con ancoretta magnetica e quindi aggiungere acqua purificata fino a 1 L.
- Equilibrare i solutiil da dare gas con il 95% O 2/5% di CO 2 per ~ 20 min. Dopo questo, aggiungere 2 ml di 1 M CaCl 2 soluzione.
- Montare i seguenti strumenti (Figura 1).
- Preparare grandi forbici o altro strumento per la decapitazione, piccole forbici chirurgiche per l'apertura del cranio, pinza punta fine per il sollevamento del cranio per esporre il cervello, bisturi con lama per sezionare la parte desiderata del cervello da affettare e una piccola spatola per la manipolazione della parti del cervello sezionato.
- Inoltre, preparare piccoli pezzi di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso dal cervello, due piccoli piatti di Petri per il cervello per essere sezionati in due bicchieri di vetro 500 ml al contenimento di acqua purificata e riscaldata SPS, e colla cianoacrilato per incollare il cervello al fase di taglio.
- Preparare una piccola spazzola per la manipolazione delle fette durante l'affettatura e una bocca larga pipetta Pasteur di vetro per spostare le fette dal bagno affettare al cha recuperomber. Disinfettare gli strumenti per prevenire la crescita di batteri nei bagni fetta caldi. Inoltre, usare i guanti di laboratorio puliti.
- Preparare una camera di recupero fetta sommersa come descritto da Gibb e Edwards 15. Continuamente gas la SPS in esso con il 95% O 2/5% di CO 2 e mantenerlo a 36 ° C. Assicurarsi che la gasazione non si traduca in piccole bolle intrappolate nel bagno che potrebbero danneggiare le fette.
- Caldo ~ 300 ml di SPS a 36 ° C su una piastra riscaldante con agitatore magnetico o in un bagno d'acqua. Se viene usata una piastra di riscaldamento, aver cura di evitare che la soluzione dal surriscaldamento, che può provocare la precipitazione di ioni. Nel caso in cui accade, caldi SPS freschi, invece di raffreddamento del vecchio.
- Portare ~ 500 ml di acqua purificata a bollire con un bollitore elettrico e, in un bicchiere, unire 300 ml di esso con acqua fredda per ottenere acqua leggermente più calda rispetto alla temperatura di taglio. Utilizzare questa riscaldato acqua purificata durante la decapitazione e utilizzare il remaizio del acqua bollita in seguito per mantenere la temperatura fisiologica del bagno affettatura.
- Anestetizzare il mouse iniettando 0,1 ml di pentobarbital (60 mg / ml) per via intraperitoneale. Dopo qualche minuto verificare che l'animale non risponde a forti punta o coda pizzichi per accertare la mancanza di sensibilità.
2. Dissezione del cervello
- Decapitare il mouse rapidamente tagliando il collo con le grandi forbici vicino alla parte posteriore del cranio, e lasciare che la testa cadere nel bicchiere con acqua purificata riscaldata per lavare via il sangue in eccesso.
- Esporre il foro occipitale nel cranio sotto i muscoli del collo e la pelle, eventualmente rimuovere più del collo con le piccole forbici.
- Tirare la pelle sulla parte superiore del cranio per poter vedere chiaramente le suture cranio per guidare l'apertura del cranio.
- Tagliare il cranio aperto inserendo l'estremità inferiore delle piccole forbici attraverso il foro occipitale e subito li voltandosi versola parte laterale. Tagliare delicatamente lungo il bordo laterale del parietale fino ad una posizione dietro gli occhi e la sutura fronto; quindi, ruotare verso il centro del cranio e tagliare attraverso la linea mediana verso l'altro lato del cranio (vedi linea verde tratteggiata nella Figura 2A).
- Utilizzando pinze punta fine, sollevare il cranio da un angolo fronto-parietale e tirarlo in diagonale su e lateralmente per esporre il cervello (vedi freccia gialla tratteggiata nella Figura 2A). Assicurarsi che il cranio non è collegata a un osso o pelle della testa, in modo che il cervello rimarrà in posizione quando il cranio è sollevato. Nel caso in cui il cervello si sta muovendo con il cranio, utilizzare le piccole forbici per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello.
- Quando il cervello è esposto, non consentono al cervello di essere asciutta. Quindi, eseguire i passi successivi, mantenendo il cranio e il cervello in una capsula di Petri riempita con riscaldato, gasati SPS.
- Staccare la parte del cervello usata per l'eXperiment dal resto del cervello utilizzando un bisturi e una spatola. In caso di utilizzo del cervelletto, staccare dal prosencefalo da un unico taglio attraverso il mesencefalo e ponte (lungo le linee rosse nelle figure 2B-D) e spostarlo in una piccola scatola di Petri che contiene fresco, gasati SPS.
- Rimuovere il tronco cerebrale per formare una base diritta e larga per incollare il cervello a taglio fase quando affetta cervelletto nel piano orizzontale. Brevemente posizionare il cervelletto su un pezzo di carta da filtro umida in modo che il lato che è stato tagliato dal prosencefalo sia rivolta verso il basso.
- Tagliare il tronco con un bisturi per formare la base (come indicato con la linea blu nella Figura 2B), e restituire il cervelletto al SPS. Quando sono necessari altri piani di taglio, tagliare il blocco di cervelletto di conseguenza (linee blu nelle Figure 2C e D).
3. Affettare il cervello
- Preparare la fase di taglio per accertare che sia dry, prima di applicare una piccola goccia di colla al centro del palco.
- Sollevare il blocco cervello dal SPS con una spatola con la corretta posizione normale e rimuovere il liquido in eccesso dal cervello utilizzando piccoli pezzi di carta da filtro. Poi, con un unico movimento, far scorrere il cervello dalla spatola sulla goccia di colla sulla scena.
- Per evitare che il cervello da essiccazione e la colla di corsa sui lati del tessuto, applicare alcune gocce di SPS con una pipetta Pasteur e posizionare la fase di taglio nella camera di affettatura. Allineare il blocco cervello in modo che le regioni di interesse (ad esempio, corteccia cerebellare) si trovano ad affrontare la lama e saranno così sottoposti a minor pressione meccanica prima di essere affettato.
- Tagliare ogni fetta secondo le istruzioni del produttore mentre costantemente gassazione SPS nella camera di taglio e mantenendo la temperatura a 34-37 ° C. Mantenere la temperatura della camera di taglio in questa gamma riempiendo il external camera del affettatrice con riscaldata acqua purificata e sostituendo l'acqua ogni volta che la temperatura scende troppo bassa.
NOTA: I parametri affettatrici devono essere trovati sperimentalmente per ogni tipo di tessuto e di neuroni che sono in fase di esame. Nel caso del Campden SMZ 700 con lame in ceramica e cellule Golgi cerebellari, utilizzare 0,75 millimetri ampiezza di vibrazione a 65 Hz e velocità di avanzamento pari a 0,05 mm / sec; per i neuroni nucleari cerebellari maggiore ampiezza e frequenza (1 mm e 90 Hz, rispettivamente) e la velocità di avanzamento lento (0,01-0,02 mm / sec) sono raccomandati. Per entrambi Golgi e neuroni cerebellari nucleari, spessore di strato deve essere di 300 micron. - Durante il taglio, non consentono le fette di ripiegare su se stessi. Per prevenire questo sostenendoli delicatamente con una spazzola morbida, preferibilmente toccando la fetta solo in regioni che non sono di interesse per l'esperimento. Fare attenzione per evitare che il pennello di toccare la lama vibratome; soprattutto nel caso delle lame di ceramica, anche un leggero contattopuò danneggiare la lama.
- Spostare ogni fetta dalla camera di taglio per un recupero / azienda da camera utilizzando una bocca larga, fuoco lucido vetro pipetta Pasteur.
- Lasciare le fette riposare nella camera per almeno 1 ora prima di iniziare l'esperimento. Questo permette di degradazione del danneggiato o morire tessuti e cellule e quindi si traduce in una superficie fetta detergente. Durante la prima ora, mantenere la temperatura del SPS nella camera nell'intervallo 34-36 ° C; in modo che le fette non sono toccati da bolle d'aria che possono danneggiare le fette o farli galleggiare.
4. Esperimento
- Dopo 1 ora, lasciare che la temperatura della camera di recupero raffreddare a RT (17-25 ° C).
NOTA: Questo potrebbe prolungare il periodo di tempo durante il quale le fette possono essere usate rallentando la crescita di batteri e metabolismo cellulare. Questo periodo dipende dalla regione del cervello e del tipo di cellule. Per esempio, alcuni tipi di cellule del Golgi possono essere giudicati sani a fette8 ore dopo il taglio, mentre altri tipi di durare solo 6 ore. - Dopo 1 ora è passato dal taglio, utilizzare le fette di vari esperimenti di elettrofisiologia.
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Risultati
Fette preparate nel modo descritto possono essere utilizzati per vari esperimenti elettrofisiologici e optogenetic. Nella Figura 3A e 3C, vi mostriamo un esempio rappresentativo di una fetta cerebellare orizzontale e una fetta coronale cerebrale corticale, rispettivamente, visto sotto interferenza differenziale (DIC) ottiche. Nella fetta cerebellare, diversi tipi di neuroni cerebellari sono facilmente riconoscibili per la loro forma e la posizione delle cellule del corpo, permettendo di...
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Discussione
Abbiamo dimostrato un metodo per preparare fettine cerebrali acute da topi nel fisiologica anziché temperatura ghiacciata.
E 'stato dimostrato 11 che la qualità di fette ottenuti in condizioni calde è superiore rispetto a quelli preparati con freddo, a condizione che la lama affettatrice ha vibrazione verticale minima. Affettare a temperatura fisiologica può impedire artefatti fisiologici causati dalla bassa temperatura, come quelli legati ai cambiamenti nei processi metabolic...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere il contributo significativo del Dr. Shiwei Huang (Australian National University) nella convalida del metodo. Inoltre, vorremmo ringraziare la signora Kasia Pietrajtis per gli utili commenti riguardanti le cellule di Golgi e il signor Vitaly Lerner per i dati sperimentali sulla corteccia. Questo lavoro è stato sostenuto da PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC e ISF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentrazione: 60 mg/ml in soluzione fisiologica. |
| Forbici grandi | FST | 14001-16 | Per la decapitazione si possono usare qualsiasi forbice di grandi dimensioni o una ghigliottina con bordi sufficientemente affilati |
| Forbici per iride | Prestige medical | 48,148 | È possibile utilizzare qualsiasi forbice a punta fine, a condizione che le lame delle forbici non siano più lunghe di 1,5– 2 cm |
| Pinza a punta fine | FST | 11254-20 | |
| Bisturi | FST | 91003-12 | |
| Lama per bisturi #11 | FST | 10011-00 | |
| Spatola piccola | Pescatore | 2350 | |
| Carta | È possibile utilizzare qualsiasi marca di laboratorio. | ||
| Piastre di Petri | Duroplan | Z231509-1 | |
| Bicchieri di vetro | Pipetta SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur | Foglia d'acero Marca | 14672-029 | |
| Super colla | Affettatrice LOCTITE | 4091361/1 | |
| Campden | 7000-smz | ||
| Lama per affettare in ceramica | Campden | 7550-1-C | |
| Riscaldatore/agitatore | Per riscaldare l'SPS per la procedura | ||
| Bollitore | Per riscaldare l'acqua per il controllo della temperatura | ||
| Camera di recupero fette + unità di riscaldamento | Warner strumenti | BSC-HT + Possono | essere utilizzati anche modelli BSC-BUW autocostruiti. |
| Termometro | Per il monitoraggio della temperatura SPS durante la dissezione e l'affettatura |
Riferimenti
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