Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Sommario

In questo articolo mostriamo un metodo per preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica, utilizzando una soluzione fisiologica convenzionale senza particolari modifiche per il taglio (come l'aggiunta di saccarosio) e senza perfusione intracardica dell'animale prima della preparazione della fetta.

Abstract

Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di fettine cerebrali acute. Questa procedura è un elemento critico per elettrofisiologici esperimenti di patch-clamp che determina in larga misura la qualità dei risultati. E 'stato dimostrato che omettendo la fase di raffreddamento durante la procedura di taglio è utile nell'ottenere fette e cellule sane, soprattutto quando si tratta di strutture cerebrali altamente mielinizzate da animali adulti. Anche se il meccanismo preciso con cui temperatura elevata per mantenere salute neurale può essere ipotizzato solo dopo, è ovvio che, quando possibile, la temperatura in cui viene eseguito il taglio dovrebbe essere vicino a condizioni fisiologiche per evitare artefatti relativi alla temperatura. Un altro importante vantaggio di questo metodo è la semplicità del procedimento e quindi il tempo di preparazione breve. Nel metodo illustrato topi adulti sono usati ma lo stesso procedimento può essere applicato con i topi più giovani e ratti. Inoltre, le seguenti cl di patchesperimento amplificatore viene eseguita su fettine cerebellari orizzontali, ma lo stesso procedimento può essere utilizzato anche in altri piani, nonché altre aree posteriori del cervello.

Introduzione

Lo scopo del metodo presentato è quello di ottenere fettine cerebrali acute alta qualità per esperimenti elettrofisiologici in vitro, specialmente quando si usano anche vecchi animali adulti o.

Il metodo di taglio cerebrale acuto, come descritto da Skrede e Westgaard ¹ in due frasi eleganti, è diventato uno dei fondamenti della moderna ricerca neuroscientifica ed è impiegato in innumerevoli varianti in tutto il mondo. La qualità delle fette si riflette nel numero di neuroni per fetta vivente, il periodo di tempo durante il quale le cellule mantengono le loro proprietà elettrofisiologiche e morfologiche nonché l'int....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali della Hebrew University and Use Committee.

1. Preparare le soluzioni e strumenti per affettare

1. Preparare 1 L di soluzione fisiologica standard (SPS) contenente gli ioni descritte nella Tabella 1.
   1. Preparare una soluzione madre contenente i sali a 10 volte la concentrazione finale in anticipo in una bottiglia di vetro riempita con memorizzazione 1000 ml di acqua deionizzata (conduttanza 0,055 mS / cm). Aggiungere sali (NaCl, KCl, KH ₂ PO _4, e MgSO _4), e mescolare f....

Risultati

Fette preparate nel modo descritto possono essere utilizzati per vari esperimenti elettrofisiologici e optogenetic. Nella Figura 3A e 3C, vi mostriamo un esempio rappresentativo di una fetta cerebellare orizzontale e una fetta coronale cerebrale corticale, rispettivamente, visto sotto interferenza differenziale (DIC) ottiche. Nella fetta cerebellare, diversi tipi di neuroni cerebellari sono facilmente riconoscibili per la loro forma e la posizione delle cellule del corpo, permettendo di.......

Discussione

Abbiamo dimostrato un metodo per preparare fettine cerebrali acute da topi nel fisiologica anziché temperatura ghiacciata.

E 'stato dimostrato ¹¹ che la qualità di fette ottenuti in condizioni calde è superiore rispetto a quelli preparati con freddo, a condizione che la lama affettatrice ha vibrazione verticale minima. Affettare a temperatura fisiologica può impedire artefatti fisiologici causati dalla bassa temperatura, come quelli legati ai cambiamenti nei processi metabolic.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pentobarbital	CTS	170066	Concentrazione: 60 mg/ml in soluzione fisiologica.
Forbici grandi	FST	14001-16	Per la decapitazione si possono usare qualsiasi forbice di grandi dimensioni o una ghigliottina con bordi sufficientemente affilati
Forbici per iride	Prestige medical	48,148	È possibile utilizzare qualsiasi forbice a punta fine, a condizione che le lame delle forbici non siano più lunghe di 1,5– 2 cm
Pinza a punta fine	FST	11254-20
Bisturi	FST	91003-12
Lama per bisturi #11	FST	10011-00
Spatola piccola	Pescatore	2350
Carta			È possibile utilizzare qualsiasi marca di laboratorio.
Piastre di Petri	Duroplan	Z231509-1
Bicchieri di vetro	Pipetta SCHOT	10022846
Pasteur	Foglia d'acero Marca	14672-029
Super colla	Affettatrice LOCTITE	4091361/1
	Campden	7000-smz
Lama per affettare in ceramica	Campden	7550-1-C
Riscaldatore/agitatore			Per riscaldare l'SPS per la procedura
Bollitore			Per riscaldare l'acqua per il controllo della temperatura
Camera di recupero fette + unità di riscaldamento	Warner strumenti	BSC-HT +  Possono	essere utilizzati anche modelli BSC-BUW autocostruiti.
Termometro			Per il monitoraggio della temperatura SPS durante la dissezione e l'affettatura

da filtro magnetico elettrico