I meccanismi che portano allo sviluppo di iperplasia intimale (IH) e il fallimento del trapianto vena sono ancora poco conosciuti. Questo studio descrive un sistema ex vivo di perfusione vene umane sotto flusso e pressione controllata. Inoltre l'efficienza di rinforzo maglia esterna per limitare lo sviluppo di IH è stata valutata.
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Articolo metodologico
Procedura per la safena umane Veins Ex Vivo Perfusione e rinforzo esterno
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pilastro di terapie contemporanee per esteso arteriopatia obliterante è venosa bypass. Tuttavia, la sua durata è minacciato da iperplasia intimale (IH), che alla fine porta a occlusione nave e fallimento del trapianto. Forze meccaniche, particolarmente basso shear stress e la tensione alto muro, si pensa di avviare e sostenere questi cambiamenti molecolari e cellulari, ma il loro contributo esatto resta da dipanare. Per valutare in modo selettivo il ruolo di pressione e sollecitazione di taglio sulla biologia di IH, un ex vivo sistema di perfusione (EVPS) è stato creato per perfusione segmenti di vene safene umani sotto il regime arteriosa (stress elevato shear e alta pressione). Ulteriori innovazioni tecniche hanno permesso di perfusione simultanea di due segmenti della stessa vena, uno armato con una rete esterna. Le vene sono state raccolte utilizzando una tecnica no-touch e immediatamente trasferiti al laboratorio per il montaggio in EVPS. Un segmento del isol appenaated vena non è stato perfuso (controllo, giorno 0). Gli altri due segmenti sono stati perfusi per un massimo di 7 giorni, un essere completamente al riparo con un 4 mm (diametro) della maglia esterno. La pressione, velocità del flusso, e la frequenza cardiaca sono stati costantemente monitorati e adeguati per simulare le condizioni emodinamiche prevalenti nell'arteria femorale. Al termine della perfusione, vene sono stati smontati e utilizzati per l'analisi istologica e molecolare. In ex vivo, condizioni di perfusione ad alta pressione (arteriosa, medio = 100 mm Hg) è sufficiente a generare IH e il rimodellamento delle vene umane. Queste alterazioni sono ridotti in presenza di una rete di poliestere esterno.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nei paesi occidentali 1. Nonostante i progressi compiuti nei trattamenti endovascolari, la chirurgia di bypass rimane il fondamento delle terapie contemporanee, così oltre mezzo milione di innesti di vena vengono eseguite ogni anno negli Stati Uniti. Tuttavia, nonostante decenni di ricerca, 30-60% dei minori innesti estremità vena falliscono entro i primi anni a causa di iperplasia intimale (IH) 2. Forze meccaniche, particolarmente basso sforzo di taglio (SS) e la tensione alto muro, sono fondamentali nel l'avvio e lo sviluppo di questa risposta iperplastica 3,4. Per risolvere questo problema, un ex vivo vene sistema di perfusione (EVPS) è stato generato per studiare, in condizioni strettamente controllate emodinamiche (pressione e lo stress di taglio), il comportamento di safene umane. In questo studio, dopo l'inserimento nella circolazione arteriosa simile, ad alta pressione (media = 100 mm Hg) era sufficiente per stimolare prolifrazione e la migrazione delle cellule muscolari lisce nello strato intimale (IH) 5.
Studi mammiferi hanno suggerito l'uso del rinforzo esterno come un metodo efficace per sostenere la "vena arterializzato" e contrastare l'emodinamica acuta cambia la vena facce, una volta impiantato in un ambiente arteriosa. La maglia ha impedito sovra-distensione, aumento dello stress di taglio, e ridotta tensione di parete e di conseguenza IH 6-10. Tuttavia, i meccanismi alla base e la sua applicabilità alle vene umane per migliorare bypass pervietà non sono stati completamente caratterizzati. I nostri EVPS è stato utilizzato per confrontare, in condizioni che mimano le alterazioni vena volti, una volta inserito in un regime arteriosa (stress e pressione alta di taglio), il comportamento di safene umane in assenza e presenza di una rete tubolare in poliestere macroporosa esterno. Impedendo rimodellamento patologico e IH, la rete ha fornito prove della sua potenziale efficacia clinica 11 .
Questo studio 1) introduce un modello di ex vivo safene umane perfusione sotto pressione controllata e sforzo di taglio 2) dimostra che in poliestere maglia macro-poroso esterno riduce IH e fornisce informazioni fondamentali per la sua potenziale applicazione clinica.
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Protocollo
Il Comitato Etico dell'Università di Losanna ha approvato gli esperimenti, che sono in conformità con i principi enunciati nella Dichiarazione di Helsinki del 1975, riveduta nel 1983 per l'uso di tessuti umani.
1. umano Grande vena safena Harvest
- Ottenere segmenti eccedenti di non varicose safene umane da pazienti sottoposti a chirurgia degli arti inferiori di bypass per ischemia. In sala operatoria, disinfettare tutta la gamba con una soluzione di iodio e drappeggio al paziente di esporre la gamba dall'inguine al piede.
- Eseguire un'incisione mediana dall'inguine al ginocchio (lasciando la parte della pelle interrotto).
- Raccogliere la vena grande safena con un peduncolo di circostante (tecnica no-touch) del tessuto. Sicuro rami laterali delle vene con 4-0 cravatte di seta. Memorizzare immediatamente un minimo di 9 cm segmento avanzo lungo della grande safena, con un diametro esterno di 2,5-4 mm a 4 ° C in RPMI-1640 Glutamax medio, integrato con siero di vitello fetale 12,5% e portarlo al laboratorio.
2 EVPS design
- Montare l'apparecchiatura generale mostrato in Figura 1. Autoclave tutte le apparecchiature e mantenere tutti i componenti in condizioni sterili. Inoltre, assicurarsi che il sistema è impermeabile e non perde sostanze chimiche nel mezzo. Utilizzare polimetacrilato di metile (PMMA-GS) per la copertina. Acciaio (X5 Cr Ni 18 10) e plastica poliossimetilene (POM) come supporto vena.
- Progettare la camera di perfusione alla geometria desiderata per consentire il posizionamento della vena e la sua connessione. Assicurarsi che la profondità (o raggio se si utilizza la costruzione cilindrica) è almeno 2,5 cm in modo che permette la flessione minima e dilatazione del vaso con una copertura costante da parte del terreno di coltura (Figura 1). Tenuta è una questione importante ed è il motivo rettangolare costruzione PMMA-GS viene utilizzato.
- Progettare il sostegno vena al geometr desideratoy. Per evitare piegatura vena o sopra distensione, consentire la regolazione della lunghezza spingendo o tirando (vite non può essere usato per questo scopo, come la vena potrebbe essere attorcigliato insieme con la vite).
NOTA: Un tondino di acciaio pieno collegati da 2 pezzi scorrevoli a forma di L che supportano i cilindri 2 vena (5 mm di diametro per adattarsi nave) e la vena (Figura 1B e Figura 2) è qui utilizzato. - Progettare colonna di pressione, in modo tale che la "pressione di riposo" applicato al sistema è: p = 0-10 = hx ρ xg, dove p = pressione (N / m 2, Pa) h = altezza della colonna di liquido (m) ρ = densità del liquido (kg / m 3) e g = costante gravitazionale (9,81 m / sec 2). Condotti di collegamento Progettazione quattro, dall'alto verso il basso: per applicare la pressione, per il deflusso (dalla vena), l'afflusso (alla vena) e per consentire medie cambiamento.
- Preparare il terreno. Sulla base di studi precedenti 5,11-14, scegliere RPMI-1640, integrato con Glutamax, 12,5Siero di vitello fetale%, e soluzione antibiotica-antimicotica 1% (10.000 U / ml di penicillina G, oltre a 10 mg / ml di streptomicina solfato, più 25 mg / ml di amfotericina B, oltre a 0,5 mg / ml: gentamicina). Lo sforzo di taglio (SS) è data da SS = 4 μQ / π * r 3 Q è la portata (ml / sec), r il raggio (cm) del segmento di vena, e μ è la viscosità del mezzo di perfusione.
- Modulare SS regolando la viscosità mediante aggiunta di 70 kDa destrano. Misurare la viscosità con un viscosimetro. Qui, aggiungere 8% 70 kDa destrano per impostare SS a 9-15 dyn / cm 2.
- Impostare la pompa ingranaggi per indurre un segnale cardioide pulsatile di 60 impulsi / min e ampiezza costante generando un flusso unidirezionale di 150 ± 15 ml / min, indipendentemente dalla pressione applicata nel sistema e controllato da un computer. Assicurarsi che il software di guida integra l'acquisizione costante e il monitoraggio delle pressioni, velocità di flusso, frequenza del polso, e il segnale. Se lo si desidera, utilizzare una seconda pompa (non synchronized) per produrre un non-laminare, turbolento.
3. EVPS Assembly (Figura 1)
- Prima di iniziare, assicurarsi che tutta l'attrezzatura è sterile. Eseguire le seguenti operazioni sotto asepsi in una cappa a flusso laminare.
- Posizionare la vena in una capsula di Petri riempite con terreno. Utilizzare una lama chirurgica e dividere la vena in 3 segmenti uguali.
- Sciacquare immediatamente un segmento in PBS. Dividere il segmento in 3 parti, fissare uno in formalina per morfometria. Congelare gli altri due per la trascrizione quantitativa (RT-PCR) e di proteine (Western Blot) analisi. Considerare questi segmenti come controllo, vena non perfuso.
- Utilizzare i 2 segmenti rimanenti per perfusione.
- Iniettare molto delicatamente medio nella vena e determinare la normale direzione del flusso; in presenza di valvole vena è invertita.
- Tenuta le vene è della massima importanza per il successo sperimentale. Controllare eventuali perdite attraverso collaterali. Fissare eventuali perdite con 6-0 punti di sutura in seta.
- Collegare il segmento vena tra i due cilindri metallici, un'estremità alla volta (2.3, figura 1). Fissare i cilindri con Ethibon 3-0 intorno alle rientranze (Figure 1A e B).
- Posizionare l'intero segmento venoso nella camera di perfusione in precedenza occupato dal mezzo. Ripetere la stessa procedura per il secondo segmento.
NOTA: La mancata sigillare adeguatamente la vena al cilindro sarà una fonte di perdita, richiede reintervento, e aumentare significativamente il rischio di infezione e fallimento sperimentale.
- Posizionare l'intero segmento venoso nella camera di perfusione in precedenza occupato dal mezzo. Ripetere la stessa procedura per il secondo segmento.
- Per rinforzare (mesh) il secondo segmento, rilasciare i due cilindri (con la vena allegato) dai pezzi a forma di L (2.3 e Figura 1).
- Sii gentile e non toccare la vena con qualsiasi strumento. Far scorrere la maglia prima sul cilindro poi sulla vena. A spintoni push / pull otterrà la maglia sulla vena.
- Una volta che la rete copre l'intera superficie della vena fissare il jvena acketed ai cilindri con Ethibon 3-0.
- Rimontare il composto vena / cilindro al supporto a forma di L e trasferirlo alla camera di perfusione, precedentemente occupato dal mezzo.
- Collegare ogni cilindro metallico (in-e deflusso) di un Y-splitter utilizzando tubi al silicone perossido-trattato con un diametro interno di 3,2 mm.
- Collegare lo splitter deflusso di un secondo partitore a Y utilizzando lo stesso tipo di tubazione. Da questo Y-splitter, utilizzare un tubo per misurare la pressione di perfusione attraverso entrambe le navi. Collegare l'altra posteriore alla colonna per formare un sistema ad anello chiuso (Figura 2).
- All'interno l'incubatore, utilizzare un tubo lungo (lunghezza di un metro) per collegare la colonna di pressione alla testa della pompa.
- Completa il set up collegando la testa della pompa per l'afflusso Y-splitter con un altro tubo lunga durata (Figura 1).
4. Vene Perfusione
- Dopo l'assemblea EVPS è stato completed, riempire la colonna con supporto (rimanere al di sotto del condotto di scarico vena per consentire la ricarica). Aggiungere più media nella colonna fino a quando il sistema è pieno. Spostare tutto il sistema in incubatore mantenuto a 37 ± 0,1 ° C con un pH mantenuto costante a 7.40 ± 0.01 (utilizzando un algoritmo di CO 2 / pH sulla base dell'equazione di Henderson-Hasselbach).
- Portare la testa della pompa ad ingranaggi all'esterno dell'incubatrice e collegarlo all'unità pompa ad ingranaggi. Avvitare le aste per fissare il gruppo.
- Accendere la pompa di alimentazione, assicurarsi che sia attivato il software di guida e lasciare 5 minuti a media e devono essere distribuiti equamente in ogni vano.
- Per monitorare la pressione, utilizzare un monitoraggio linea arteriosa. Collegate l'uscita di pressione EVPS (corrisponde al catetere arterioso) al trasduttore di pressione collegato al computer.
- Assicurarsi che il tubo è interamente occupata dal mezzo e non contiene bolle. De-bolla il sistema cultura attraverso la "li arteriosane tubo "(Figura 2). Prestare attenzione al display e cercare un segnale cardioide pulsatile di 60 impulsi / min di ampiezza costante. A questo punto, la pressione media è compresa tra 0-10 mm Hg. Se la pressione è <0 e la colonna si svuota progressivamente cercare una perdita (collaterale della vena o tenuta inadeguata tra la vena e il tubo).
- Impostare la pressione minima a 6 mm Hg per un test venoso o 90 mm Hg per un test arteriosa. In queste condizioni, un iniettore aria si applica la pressione necessaria alla colonna e sistema.
- Cambiare il mezzo ogni 2 giorni utilizzando il tubo collegato alla colonna di pressione. Per evitare danni cambiamento di pressione, aprire il tappo della colonna prima.
5 Completamento della perfusione
- Dopo 3 o 7 giorni di perfusione: prendere i EVPS fuori dell'incubatore e smontare le vene. Eliminare il prossimale 5 mm e vena distale estremità collegata alle apparecchiature. Tagliare un centrale, rin spessore di 5 mmgs del segmento rimanente e fissare in formalina (morfometria). Congelare i frammenti rimanenti e ridurre in polvere per ulteriori analisi molecolari.
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Risultati
Il EVPS fornisce un prezioso strumento per valutare autonomamente le forze emodinamiche sulla vena safena umana innesta rimodellamento e IH.
La Figura 1 mostra la camera di perfusione e il supporto vena. Nelle figure 1A e B, il supporto vena prima (Figura 1A) e dopo (Figura 1B) assemblaggio, rispettivamente è raffigurato. È composto (dalla parte superiore alla parte inferiore) di 1 tubo di acciaio inox piano...
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Discussione
Questo studio rivela un ex vivo sistema di perfusione venosa (EVPS) per eseguire studi approfonditi emodinamiche nelle vene umane. Questo sistema permette safene perfusione sotto parametri emodinamici definiti in assenza di fattori infiammatori e di crescita aggravanti rilasciati dalle cellule circolanti in vivo. Pertanto, esso fornisce una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti coinvolti nel controllo della IH in vene umane innesti 5,11,12,15.
Perturba...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del SNF [31003A-138528], la Octav e la Botnar Fondazione Marcella, la Fondazione Novartis e la Muschamp Fondazione Emma. Ringraziamo Martine Lambelet, e Jean-Christophe Stehle per la loro assistenza tecnica eccellente.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| Penicillina/Streptomicina/Fungizone | Bioconcept | 4-02F00-H | |
| Destrano da Leuconostoc spp. 500 g | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Tampone PBS CHUV pH 7,1-7,3 1 L | Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG | 100 0 324 00 | |
| Mezzo di inclusione per criosezione - Tissue-Tek OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Tubo in silicone (perossido) L/S 16 (96400-16 ) - 7,5 m | Idex Health & Scienza GMBH | MF0037ST | |
| splitter a Y | Idex Salute & Science GMBH | Raccordo | |
| 35 mm Piastra di coltura | Sigma-Aldrich | CLS430165-100EA | |
| Tubo Falcon da 15 ml | BD Bioscence | 352096 | |
| Tubo Falcon da 50 ml | BD Bioscence | 352098 | |
| Pompa a ingranaggi - Reglo-Z | Idex Health & Scienza GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| Testa della pompa | Idex Salute & Scienza GMBH | MI0008 | |
| Kit di monitoraggio TRANSPAC IV | icumedical | 011-0J736-01 | |
| Siringhe da 20 ml | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson& Johnson | EH7346H | |
| Mesh ProVena 6-8mm | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl: Perfusione in soluzione di cloruro di sodio 0,9% (100 ml) | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S Standard Drive | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| Scheda di acquisizione | National Instruments | PCI-6024 E | |
| Flussimetro modulo | Transonic Systems Inc. | Rubinetto TS410 e T402 | |
| con filtro | BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex | Milian | SE2M229I04 |
Riferimenti
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