Visualizzazione non-litica Esocitosi di Cryptococcus neoformans Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Summary

Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.

Abstract

Molti aspetti l'infezione di macrofagi da Cryptococcus neoformans sono stati ampiamente studiati e ben definito. Tuttavia, una particolare interazione che non è chiaramente compreso è esocitosi non-litico. In questo processo, le cellule di lievito vengono rilasciati nello spazio extracellulare con un meccanismo poco compreso che lascia entrambi i macrofagi e Cn praticabile. Qui, descriviamo come seguire un gran numero di macrofagi infettati singolarmente per un periodo di 24 ore l'infezione mediante microscopia-tempo trascorso. Macrofagi infetti sono alloggiati in una camera di riscaldamento con un atmosfera di CO ₂ collegato ad un microscopio che fornisce le stesse condizioni di un incubatore di coltura cellulare. Microscopio digitale diretta in grado di fornire informazioni sulle interazioni dinamiche tra un host e agente patogeno che non è disponibile da immagini statiche. Essere in grado di visualizzare ogni cellula infettata può fornire indizi su come i macrofagi gestire infezioni fungine, e viceversa. Questa tecnica isa potente strumento per studiare le dinamiche che stanno dietro un fenomeno complesso.

Introduction

Le fasi di una infezione fungina tra le cellule criptococco e macrofagi sono ben documentati ^1-3. Dopo cellule di lievito vengono ingeriti dai macrofagi, una varietà di interazioni possono verificarsi: il macrofago può lisare rilasciando il suo carico fungina nello spazio extracellulare, o potrebbe controllare l'infezione mantenendo le cellule di lievito entro i confini della sua membrana cellulare ^4. Tuttavia, alcuni anni fa un nuovo risultato è stato descritto indipendentemente da due gruppi: esocitosi non-litico, un processo in cui un macrofago cancellata alcune o tutte le celle criptococco nell'ambiente circostante o una cellula vicina e sia host e patogeno rimangono vitali ^{5 -8.} Diversi studi hanno cercato di comprendere i meccanismi molecolari alla base di questa interazione, ma abbiamo ancora non hanno una conoscenza completa su ciò che guida questo fenomeno.

La capacità di catturare immagini in tempo reale e successivamente analizzare infettare piùEd macrofagi permette di rispondere a molte domande sulle proprietà fisiche circostanti esocitosi non-litica per quanto riguarda i tempi, la capacità spaziale, il cambiamento nella morfologia e anche lo stress di macrofagi nel corso di una infezione fungina. Permettendo alle cellule di essere ospitati in un ambiente che è paragonabile a quello di un incubatore, possiamo intravedere la natura dinamica delle interazioni cellulari di macrofagi-fungine. I ricercatori hanno usato questa tecnica per studiare vari elementi di questo processo. Il ruolo del phagosome in questo processo è stato reso evidente con colorazione fluorescente e actina agenti di blocco ^9, mentre un altro gruppo ha usato questo metodo per dimostrare che esocitosi non-litica è stata bloccata in cellule che hanno avuto la WASH nucleazione domini proteici cancellato ^10. L'effetto di segnalazione delle citochine è stata anche determinata mediante microscopia in tempo reale ^11. Questo processo non è limitato a C. neoformans come è stato osservato anche con Candida albicans, another patogeno fungino che ha la capacità di infettare i macrofagi ^12. Questi risultati sono esempi di come questo metodo può fornire una serie di informazioni in un'area che sappiamo così poco.

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato fatto in conformità con le normative e le linee guida dell'Istituto di studi sugli animali con Albert Einstein College of Medicine.

1. Crescita Condizioni di C. neoformans H99 (sierotipo A)

1. Grow individuale C. neoformans (Cn) colonie su piastre di agar Sabouraud.
2. Un giorno prima dell'esperimento, selezionare una colonia e inoculare 10 ml di brodo Sabouraud.
3. Lasciare cultura a crescere durante la notte a 37 ° C agitando a velocità di 250 rpm.

2 Isolamento e preparazione di primaria Bone macrofagi da C57 / BL6 Mice

1. Euthanize topi mettendo animale in una camera di CO ₂ fino a non respirare più. Come seconda misura, cervicale dislocare il collo prima di iniziare la dissezione. Sterilizzare tutto il corpo con il 70% di alcol etilico.
2. Rimuovere entrambi i femori e tibia e posto le ossa in DMEM sterile.
3. Rimuovere il tessuto in eccesso e muscolare con delicate asciuga fino ossa sono completamente puliti.
4. Posizionare le ossa intatte solo in una capsula di Petri contenente il 70% di alcol etilico e incubare per 3 minuti per uccidere i microrganismi associati. Togliere le ossa e posto in capsula di Petri con DMEM sterile.
5. Tagliare con cautela estremità delle ossa. Tenere osso su un tubo conico vuoto 50 ml posti su ghiaccio e lavare accuratamente 10 ml di DMEM freddo utilizzando un ago da 25 G con ogni osso.
   NOTA: Ogni topo produrrà 4 ossa (2 femori, tibie 2). Pertanto un mouse dovrebbe produrre circa 40 ml di sospensione cellulare.
6. Sospensione cellulare Centrifugare a temperatura ambiente per 10 min a 650 x g.
7. Durante questo centrifugazione, preparare e filtro sterilizzare midollo osseo macrofagi alimentazione dei media che consiste di DMEM supplementato con il 20% L929, siero di vitello fetale 10%, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutammina , 1% di aminoacidi non essenziali, 0,1% 2-mercaptoetanolo.
8. Risospendere il pellet risultante con 10 ml di alimentazione dei supporti. Passare suspens cellulariion attraverso un filtro 70 micron cella di interrompere grumi di cellule e rimuovere i detriti di grandi dimensioni.
9. Tavola 1 ml di sospensione cellulare in 10 ml di media alimentare in capsule di Petri che vengono specificati per l'uso coltura tissutale (per un totale di 10 piatti).
10. Consentono alle cellule di aderire a 37 ° C con 10% di CO _2. Aggiungere 5 ml di supporti di alimentazione fresca il giorno 3 Il giorno 7, completamente sostituire il supporto di alimentazione e macrofagi sono pronti per essere utilizzati.
11. Il giorno prima dell'esperimento, staccare macrofagi di targa togliendo mezzi di alimentazione e aggiungere 5 ml di una cellula dolce strippaggio reagente alla piastra.
12. Incubare per 5-10 min a 37 ° C e rimuovere macrofagi con dolce pipettaggio.
13. Cellule pellet per centrifugazione a 650 xg per 10 min.
14. Risospendere il pellet in 1 ml di alimentazione dei supporti. Usando una diluizione 1:20, calcolare la concentrazione di macrofagi pipettando 10 ml di sospensione cellulare su un emocitometro.
15. Utilizzo di 14 millimetri con fondo trasparente piastre di Petri, un piattoconcentrazione di 1 x 10 ⁵ macrofagi direttamente sul pozzo interno che contiene un massimo di 200 ml, quindi prendere precauzioni per non superare questo volume, come mostrato in Figura 4.
16. Consentire alle cellule di aderire alla piastra di Petri di vetro mettendo i piatti in un incubatore a 37 ° C per 1 ora.
17. Aggiungere 1-2 ml di alimentazione supporti integrati con LPS a 1 mg / ml e IFNg a 500 U / ml e permettono alle cellule di incubare una notte.

3 co-incubazione dei macrofagi murini primari e C. neoformans

1. Il giorno dell'esperimento, rimuovere 1 ml di cellule di coltura e lievito pellet pernottamento inoculate mediante centrifugazione per 5 min a 420 x g.
2. Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile per rimuovere il supporto e prodotti criptococco extracellulari come la glucuronoxylomannan polisaccaride (GXM) alla velocità e il tempo di cui sopra.
3. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS sterile e fare una diluizione 1: 100. Pipettare 10 ml di tegli diluizione su un emocitometro e contare le cellule. Aggiungi cellule di lievito in una MOI di 1: 5. Ad esempio, se ci sono 1 x 10 ⁵ macrofagi / bene, fare una sospensione cellulare di 5 x 10 ⁶ / ml di Cn e aggiungere 100 ml di questa soluzione per un importo complessivo di 5 x 10 ⁵ Cn.
4. Registrare il volume calcolato di sospensione cellulare criptococcica a 1 ml di mezzi di alimentazione con l'anticorpo monoclonale 18B7 ad una concentrazione di 10 mg / ml. Incubare sospensione cellulare a temperatura ambiente per 5 min.
5. Rimuovere i supporti di alimentazione dal fondo di vetro piatto di Petri e lavare 1 volta con PBS sterile. Aggiungere 100 ml di opsonizzati Cn direttamente al bene.
6. Consentono alle cellule di incubare per 2 ore a 37 ° C con il 10% di CO _2.
7. Dopo aver co-incubazione, controllare da microscopio che i macrofagi hanno interiorizzato Cn. Per essere considerati interiorizzato, le cellule criptococco dovrebbero chiaramente essere visto entro i confini del macrofago.
8. Lavare 3x Petri piatto con PBS sterile per rimuovere ogni e qualsiasi extracellular Cn.
9. Aggiungere 1-2 ml di alimentazione dei supporti, senza l'aggiunta di mAb 18B7, e impostare microscopio.

4. Visualizing non-litica Esocitosi in tempo reale Utilizzando Luce Microscopia Digitale

NOTA: Per eseguire questi esperimenti, un microscopio che viene fornito con una camera di incubazione allegato che include CO ₂ la consegna è richiesta una unità di riscaldamento.

1. Prima dell'esperimento, pre-riscaldare la camera di incubazione per almeno 30 min a 37 ° C. Assicurarsi che l'unità di CO ₂ legge 5% all'inizio dell'esperimento.
2. Luogo fondo di vetro piatto di Petri su piattaforma microscopio, coprire con CO ₂ coperchio, e chiudere tutte le porte per garantire l'assenza di fughe di calore.
3. Utilizzando l'obiettivo 10X con il microscopio a contrasto di fase, concentrarsi su una chiara campo di macrofagi infettati. Sulla base della sperimentazione, determinare l'obiettivo utilizzato da quanti macrofagi necessario studiare.
4. Impostare il software microscopio a take un'immagine ogni 4 minuti per un periodo di 24 ore.
5. Dopo 24 ore, l'esperimento avrà raggiunto il completamento e sarà stato raccolto un totale di 361 immagini. Esportare queste immagini come .jpegs a compressione 5%. Utilizzando software Image J, visualizzare le immagini come una pila di Visual a 5 fotogrammi al sec. Se il filmato deve essere visto per la pubblicazione o una presentazione, salvarla sia come avi o mov di file a seconda di quale formato funziona meglio per lo spettatore.

Results

Le immagini che questa tecnica produce possono essere analizzati in una varietà di modi per raccogliere informazioni che circonda ciò che accade dopo che le cellule sono fagocitati C. neoformans. Come si vede nella figura 1, ci sono circa 100 i macrofagi che sono o infetto o non infetto. Ognuno di questi macrofagi dà allo spettatore l'opportunità di studiare le interazioni ospite-patogeno su un livello molto microscopico. Come le figure 2 e 3 mostrano, ci sono ...

Discussion

Qui abbiamo descritto un metodo con cui le interazioni fungine-macrofagi possono essere registrati e analizzati in tempo reale per un periodo di 24 ore. Il nostro laboratorio ha utilizzato questo protocollo per studiare molti degli aspetti temporali della esocitosi non-litica e continuerà ad utilizzare la microscopia in tempo reale per accertare le componenti morfologiche che circondano questo processo.

Per questa tecnica per produrre risultati ottimali, particolare attenzione deve essere da...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Destrosio Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Brodo di destrosio	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Siero fetale per vitelli (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Aminoacidi non essenziali	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
Toxic 3003 Piastre di Petri per colture tissutali	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-CL
Mat-tek Piastre per colture con fondo in vetro	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Topo IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Anticorpo non commerciale prodotto nel nostro laboratorio
Axiovert 200M Microscopio con camera di incubazione	Zeiss