Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) utilizzando reagenti privi di prodotti animali in conformità con le attuali linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).
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Articolo metodologico
Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) derivate da membrane amnioiche a termine o pre-termine hanno attirato l'attenzione di ricercatori e medici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa. La ragione di questo interesse è l'evidenza che queste cellule hanno un'elevata capacità di differenziazione multipotente, bassa immunogenicità e funzioni antinfiammatorie. Queste proprietà hanno spinto i ricercatori a studiare il potenziale degli hAEC da utilizzare per trattare una varietà di malattie e disturbi in studi preclinici sugli animali con molto successo.
hAEC hanno trovato ampia applicazione per il trattamento di una serie di malattie e disturbi. Le potenziali applicazioni cliniche degli hAEC includono il trattamento dell'ictus, della sclerosi multipla, delle malattie epatiche, del diabete e delle malattie polmonari croniche e acute. Il passaggio dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici richiede uno standard più elevato di controllo della qualità e sicurezza per i prodotti di terapia cellulare. Per considerazioni sulla sicurezza e sul controllo della qualità, è preferibile che i protocolli di isolamento cellulare utilizzino reagenti privi di prodotti di origine animale.
Abbiamo sviluppato protocolli per consentire ai ricercatori di isolare, crioconservare e coltivare hAEC utilizzando reagenti privi di prodotti animali. Il vantaggio di questo metodo è che queste cellule possono essere isolate, caratterizzate, crioconservate e coltivate senza il rischio di veicolare agenti patogeni animali potenzialmente dannosi per l'uomo, mantenendo al contempo rese cellulari, vitalità e potenziale di crescita adeguati. Per i ricercatori che passano dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici, queste metodologie accelereranno notevolmente l'approvazione normativa, ridurranno i rischi e miglioreranno la qualità della loro popolazione di cellule terapeutiche.
Introduzione
Le cellule derivate da fonti perinatali, come la placenta, membrane placentari, cordone ombelicale e liquido amniotico hanno attirato l'attenzione dei ricercatori e clinici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa 1,2. La ragione di questo interesse è che questi tipi di cellule tutti possiedono un certo grado di plasticità e immunomodulatorie capacità 3, proprietà che sono fondamentali per loro potenziali applicazioni terapeutiche.
hAECs sono una popolazione eterogenea epiteliale che può derivare dal termine o pre-termine membrana amniotica 4, fornendo una abbondante fonte potenziale di materiale cellulare rigenerativa. Le proprietà che rendono hAECs accattivanti come terapia cellulare comprendono la multipotenza, bassa immunogenicità, e le proprietà anti-infiammatorie. hAECs sono stati trovati per essere altamente multipotenti sia in vitro che in vivo, in grado di differenziarsi in linee mesodermici (cardiomyocytes, miociti, osteociti, adipociti), lignaggi endodermici (cellule pancreatiche, cellule epatiche, cellule polmonari) e lignaggi ectodermiche (capelli, pelle, cellule neurali e astrociti) 5-10.
Rassicurante, nonostante le loro hAECs multipotenza non sembrano né formare tumori o promuovere lo sviluppo del tumore in vivo. Inoltre, hAECs sono immuni privilegiata, esprimendo bassi livelli di classe II antigeni leucociti umani (HLA) 8. La struttura, probabilmente alla base la capacità di eludere rigetto immunitario dopo il trapianto allogenico e xenogenica, come dimostrato in studi che utilizzano scimmie immunitarie competenti, conigli, cavie, topi e maiali 11-13. hAECs visualizzare potenti immunomodulante proprietà immunosoppressive e quindi offrono notevoli vantaggi pratici per le potenziali applicazioni cliniche nella terapia delle malattie autoimmuni. hAECs si ritiene di esercitare le funzioni di immunomodulatori sia sul sistema immunitario innato e adattativo. Sue dei meccanismi proposti, è attraverso la secrezione di fattori immunomodulante 14.
Le attuali applicazioni di hAECs in modelli di malattia degli animali pre-clinici comprendono il trattamento di ictus, sclerosi multipla, malattia del fegato, diabete e malattie polmonari croniche e acute. I ricercatori hanno mostrato interesse ad utilizzare hAECs per il trattamento di post-ictus infiammazione del cervello a causa delle loro proprietà uniche. Ci sono prove che hAECs può attraversare la barriera emato-encefalica, dove possono innestare, sopravvivere fino a 60 giorni, differenziarsi in neuroni, diminuire l'infiammazione e promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato del sistema nervoso centrale in modelli animali di malattie neurologiche 15.
hAECs offrono la possibilità di individuare e invertire molteplici percorsi patologici che contribuiscono allo sviluppo e la progressione della sclerosi multipla. Ad esempio, i risultati di studi su animali pre-clinici suggeriscono che hAECs fortemente immunosoppressiva epuò potenzialmente indurre tolleranza immunitaria periferica e invertire risposte infiammatorie in corso. hAECs hanno anche dimostrato di avere la capacità di differenziarsi in cellule neurali in vivo e migliorare neurorigenerazione endogena attraverso la secrezione di una vasta gamma di fattori neurotrofici 16.
Cellule epiteliali umane e roditori amniotiche hanno già dimostrato la loro efficacia terapeutica per il trattamento della malattia epatica in modelli animali. In un modello di tetracloruro di carbonio induzione danni delle malattie del fegato, il trapianto haec portare ad attecchimento di hAECs vitali nel fegato, accompagnato con una ridotta epatociti apoptosi, e diminuito l'infiammazione epatica e fibrosi 17.
hAECs può essere stimolato da fattori pancreatiche espresse compreso insulina e glucosio trasportatori. Diversi studi hanno indagato la possibilità di hAECs per ripristinare i livelli di glucosio nel sangue in topi diabetici 18. Nei topi che ricevehAECs, sia di peso e di glucosio nel sangue i livelli del corpo animale è sceso a livelli normali dopo l'iniezione di cellule. Questi studi presentano un caso forte per l'uso di hAECs per il trattamento del diabete mellito.
hAECs hanno un ruolo provata nella prevenzione e riparazione di sperimentale danno polmonare acuto e cronico in modelli neonatali 19 adulti e. Questi studi hanno trovato che hAECs differenziano in vitro in cellule epiteliali polmonari funzionale che esprimono più proteine polmonari associate, tra cui la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), il canale ionico che è mutato in pazienti affetti da fibrosi cistica 20. Inoltre, quando hAECs vengono consegnati l'adulto ferito e polmonare neonatale, che esercitano i loro effetti riparatori tramite la modulazione delle cellule immunitarie dell'ospite, riducendo il reclutamento dei leucociti polmonare, tra cui neutrofili, macrofagi e linfociti 21-23.
Data la loro abbondanza,record di sicurezza, e le applicazioni cliniche collaudate per più malattie, studi clinici utilizzando hAECs è inevitabile. Con l'obiettivo di accelerare la traduzione di terapie HAEC in sperimentazioni cliniche, abbiamo sviluppato metodi per isolare, criopreservare e hAECs cultura in un modo adatto per la sperimentazione clinica, utilizzando reagenti senza prodotti di origine animale in conformità alle buone pratiche di fabbricazione (cGMP) le linee guida .
Abbiamo basato questo protocollo un protocollo precedentemente pubblicato che stavamo usando con successo per isolare hAECs utilizzando reagenti di origine animale 6. Abbiamo modificato il protocollo originale di sostituire i prodotti di origine animale con reagenti privi di prodotti animali, e la successiva ottimizzazione è stata eseguita per ottimizzare il rendimento delle cellule, la vitalità e purezza. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo che rispettare le norme regolamentari per la produzione di celle per test clinici sull'uomo.
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Protocollo
NOTA: placenta dovrebbe essere raccolto da gravidanze sane Singleton, con una preferenza per tagli cesarei elettivi termine. Scritto, consenso informato deve essere dato per la raccolta dei loro placenta. Il tuo comitati etici di ricerca umani dovrebbero approvazione tutta la linea e l'utilizzo di tessuti umani.
1. Isolamento di cellule epiteliali Amnion
- Posizionare la placenta su una superficie sterile all'interno di una cappa di sicurezza biologica di classe II.
- Utilizzando matasse sterili soluzione salina bilanciata (HBSS), lavare il più sangue possibile dalla superficie della placenta e le membrane.
- Con la placenta disposto con il cordone ombelicale rivolto verso l'alto, separare meccanicamente il bordo esterno delle membrane amnion e corion.
- Una volta separati, striscia manualmente la membrana amniotica dalla membrana corion della placenta, lavorando intorno al bordo della membrana, verso il cordone ombelicale.
NOTA: Essere Careful per rimuovere eventuali pezzi di contaminanti membrana chorion dalla membrana amniotica. - Usando forbici sterili, tagliare la membrana amniotica 2 cm circa dalla base del cordone ombelicale e posto in un contenitore sigillato 500 ml contenente 250 ml HBSS.
- Lavare accuratamente agitando la bottiglia sigillata contenente la membrana amniotica.
- Rimuovere la membrana amniotica dal contenitore di raccolta con pinza sterile, e posto in una capsula di Petri 15 cm.
- Tagliare la membrana amniotica in pezzi lunghi circa 5 cm (se tenuto in verticale con le pinze), scartando i pezzi sanguinosi o strappati.
- Mettere in un contenitore sigillato da 500 ml e lavare con 250 ml HBSS circa 3-5 volte o fino a quando la membrana amniotica diventa traslucida con niente sangue contaminante.
NOTA: Qualsiasi sangue presente può ridurre l'efficienza della enzimatica soluzione di analisi. - Trasferire tutti i pezzi di membrana amniotica in un recipiente contenente 50 ml della soluzione enzimatica digerire, avendo cura diridurre al minimo riporto di HBSS.
- Incubare i pezzi amnion in enzimatica digeriscono soluzione in un bagno d'acqua o camera calda a 37 ° C per 15 minuti con agitazione per rimuovere il sangue residuo.
- Togliere i pezzi di membrana amnion dalla enzimatica digerire soluzione in un nuovo contenitore sterile.
- Aggiungere 100 ml di soluzione enzimatica fresco digerire alla membrana amniotica e incubare a 37 ° C per 60 minuti in un bagno d'acqua o una stanza calda con agitando delicatamente (prima digestione).
- Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana.
NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. - Aggiungere 100 ml di enzimatica fresco digeriscono soluzione ai pezzi di membrana amnios e incubare 60 minuti in un bagno di acqua o camera calda a 37 ° C con un leggero scuotimento (seconda digestione).
- Passare il suspensi cellulareon dal punto 1.14 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole.
NOTA: In questa fase le cellule possono essere lasciati in ghiaccio fino cellule dal secondo digest sono nella stessa fase di lavorazione. - Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana.
NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. - Passare la sospensione cellulare dal punto 1.18 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con un 1 ml pipette per ottenere una sospensione di cellule singole.
- Cellule piscina dal due digest o in alternativa mantenere digest cellule separate fino a dopo il conteggio delle cellule.
NOTA: Questo impedisce la miscelazione di cellule viabilità potenzialmente bassi con cellule di alta redditività. - Aggiungere HBSS ad un volume finale di 10-20 ml ed eseguire la conta delle cellule utilizzando trypan blu per misurare la vitalità.
- Confermare il fenotipo delle cellule epiteliali mediante citometria a flusso. Make up adeguati cocktail di anticorpi con anti-EpCAM-PE (diluizione 1: 2) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) e anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS.
- Risospendere un sottoinsieme di cellule da uno o entrambi i digest del cocktail di anticorpi ad una concentrazione di 25 x 10 6 cellule / ml.
- Per la citometria a flusso, macchia 1 x 10 6 cellule con un cocktail di anticorpi contenenti controlli isotipici (ad es. Controllo-PE IgG 1 isotipo + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Mantenere ~ 1 x 10 6 cellule senza macchia per citofluorimetro set-up.
- Incubare cellule anticorpococktail a 4 ° C per 60 min.
- Lavare le cellule 3x in HBSS e risospendere tra i 5 ei 10 milioni di cellule per ml di citometria a flusso.
- Eseguire citometria di flusso e risultati di nota. La purezza del campione isolato cella (la percentuale di EpCAM positive e CD90 / CD105 cellule negative) dovrebbe essere rispettivamente 90-95% e <1%.
- Mettere da parte un adeguato numero di cellule per test di criteri di controllo della qualità o di rilascio appropriate come determinato dall'applicazione finale.
NOTA: Questo può includere malattia / di screening virale, o altro di sicurezza o criteri biologici. - Per le cellule rimanenti, seguire il protocollo di crioconservazione, o in alternativa, inserire direttamente nella cultura (diretta alla cultura passo 3.6).
2. Crioconservazione di hAECs
- Determinare numero di cellulare e la vitalità con citometria a flusso di dati o di conteggio manuale con trypan esclusione blu.
- Centrifugare a 700 xg per 5 min.
- Cell Risospenderes tra 1-10000000 cellule per ml in animali crioconservazione multimediale gratuito prodotto.
- Pipettare un volume adeguato di cellule in vials crioconservazione O-anelli e posto in un apparato velocità di congelamento controllato dove avviene il raffreddamento a circa 1 ° C / min fino a -80 ° C si ottiene.
- Trasferire fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
3. scongelamento e Cultura Cyropreserved hAECs
- Rimuovere le fiale di crioconservazione di azoto liquido e disporli sul ghiaccio.
NOTA: solo per il trasferimento - procedere rapidamente alla fase successiva. - Scongelare le fiale crioconservazione rapidamente a 37 ° C fino a che solo una piccola parte (~ 5 mm x 5 mm) del ghiaccio rimane.
NOTA: È importante che la soluzione cella non riscalda per ridurre gli effetti tossici di DMSO nei media crioconservazione. - Diluire mezzi crioconservazione 10 volte con il freddo (~ 4 ° C), i media senza siero, goccia a goccia in un formato adatto aggiuntod tubo o contenitore.
- Centrifugare a 700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere in mezzo privo di siero, ad una concentrazione di circa 1 milione di cellule per ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu. Previsto vitalità post-scongelamento sarà 5-10% in meno rispetto redditività pre-crioconservazione.
- Cellule piastra su standard di coltura cellulare trattati e plastico, o in alternativa utilizzare collagene di tipo I per le superfici di cultura cappotto.
- Per tipo I rivestimento collagene seguire il protocollo di seguito
- Preparare l'acido tipo solubile I collagene dalla placenta umana (15 mg di collagene con 25 ml di acqua deionizzata e 50 ml di acido acetico glaciale).
- Coprire bicchiere con Parafilm e agitazione moderata a 37 ° C fino a filamenti di collagene sono sciolte.
- Soluzione filtro collagene sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron.
- Diluire il collagene magazzino 01:10 filtrata con acqua deionizzata. Questa azione diluito è la conce di lavoroSoluzione ntration per superfici di rivestimento in plastica e membrana.
- Collagene plastica cappotto, superfici di vetro e membrana per 2 ore a temperatura ambiente a 37 ° C, o O / N a 2-8 ° C.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita, e lasciarlo asciugare O / N.
- Risciacquare con acqua di grado colture di tessuti sterili o HBSS prima di introdurre cellule e mezzo.
- HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e consentono il collegamento a verificarsi per 72-96 ore.
- Dopo allegato, cambiare supporto con attenzione aspirare e sostituirli con un opportuno volume di mezzo privo di siero ogni 2-3 giorni.
- Cellule Passage che utilizzano il protocollo di seguito
- Mezzi di coltura cellulare Aspirare e lavare con il volume di 1x sterile HBSS
- Aggiungere il volume 1x enzimatica digerire soluzione e incubare per 5-15 minuti, o fino a quando le cellule sono osservati staccano dalla superficie di coltura cellulare.
- Raccogliere enzimatica digerire soluzione contenente le cellule, garantendo cells sono staccati dalla superficie coltura cellulare pipettando ripetutamente il enzimatica digerire soluzione contro la superficie di coltura cellulare
- Centrifugare a 700 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet di cellule in un volume adeguato di HBSS contenente 1 mg / inibitore enzimatico a base di soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole.
- Aggiungere mezzo privo di siero ad una concentrazione approssimativa di 1 milione di cellule / ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu.
- HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e continuare con i metodi di coltura standard.
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Risultati
Quando questa procedura è seguita correttamente, una resa media di 120 milioni di hAECs dovrebbe essere previsto, con un raggio di 80-160,000,000 cellule. Da queste rese, una redditività media di 83 ± 4% può essere previsto. La maggiore resa media e leggermente inferiore redditività nel metodo clinica possono essere dovuti all'attività tripsina superiore prodotto di origine animale, e forse anche a causa della mancanza di proteine del siero. Isolati hAECs hanno un profilo medio della superficie cellulare del 92% EpCAM...
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Discussione
Ci sono diversi parametri critici che possono avere un impatto significativo per il successo di questa metodologia. Conservazione della placenta o amnion fino a 3 ore prima isolamento di hAECs può essere desiderabile per scopi logistici o di programmazione, ma si raccomanda che il tessuto viene elaborata appena possibile. Se il tessuto deve essere memorizzato, si raccomanda di memorizzazione eseguito in seguito dissezione e lavaggio della membrana amnion. Amnion può essere immagazzinato in HBSS sterili contenenti antibi...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Programma di Supporto alle Infrastrutture Operative del Governo del Victoria.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit | |||
| Vassoio di strippaggio | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Pinza per medicazione Liberty, appuntita 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Forbici - Affilate/Smussate Dritte | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Guanti sterili in lattice | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Abbigliamento | |||
| Abbigliamento protettivo (camice) | U-line | S-15374-M | |
| Camici isolanti | U-line | S-15374-M | |
| Guanti sterili in lattice | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Mascherina per uso generico | Cardinal Health | AT7511 | |
| Cofani | Medline | CRI1001 | |
| Copriscarpe | U-line | S-7873W | |
| Media e reagenti | |||
| Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | senza calcio o magnesio |
| TrypZean (prodotto animale... tripsina ricombinante libera) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inibitore della tripsina di soia 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Reagente blu di tripano | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| Isotipo PE controllo | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| controllo dell'isotipo PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| controllo dell'isotipo APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagene di tipo VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Materiali di | |||
| Pipetta graduata da 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipetta graduata da 10 ml | BD/Falcon | 356551 | |
| Pipetta graduata da 5 ml | BD/Falcon | 356543 | |
| Provette Falcon da 50 ml | BD/Falcon | 352070 | |
| Provette Falcon da 15 ml | BD/Falcon | 352096 | |
| Piastre Petri da 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtri | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Puntali per pipette | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Puntali per pipette | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| Siringa da 20 ml | BD/Medical | 309661 | |
| Spatola in plastica | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Pesatrice in plastica | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Fiale criogeniche | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Armadio |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
