L'isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Sommario

I modelli di proteinopatia del lievito sono strumenti preziosi per valutare la tossicità e l'aggregazione delle proteine implicate nella malattia. Qui, presentiamo i metodi per lo screening delle librerie di varianti Hsp104 per i soppressori di tossicità. Questo protocollo potrebbe essere adattato per lo screening di qualsiasi libreria proteica per soppressori di tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

Abstract

Molti disturbi del misfolding proteico possono essere modellati nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine come TDP-43 e FUS, implicate nella sclerosi laterale amiotrofica, e α-sinucleina, implicata nella malattia di Parkinson, sono tossiche e formano aggregati citoplasmatici nel lievito. Queste caratteristiche ricapitolano le patologie proteiche osservate nei pazienti con questi disturbi. Pertanto, il lievito è una piattaforma ideale per isolare i soppressori di tossicità da librerie di varianti proteiche. Siamo interessati all'applicazione delle disaggregasi proteiche per eliminare i conformeri proteici tossici mal ripiegati. In particolare, stiamo ingegnerizzando Hsp104, una proteina esamerica AAA+ dal lievito che è in grado di solubilizzare sia gli aggregati disordinati che l'amiloide e di riportare le proteine alle loro conformazioni native. Sebbene Hsp104 sia altamente conservato negli eucarioti e negli eubatteri, non ha alcun omologo metazoo noto. Hsp104 ha solo una capacità limitata di eliminare gli aggregati disordinati e le fibre amiloidi implicate nelle malattie umane. Pertanto, miriamo a ingegnerizzare varianti di Hsp104 per invertire il misfolding proteico implicato nelle malattie neurodegenerative. Abbiamo sviluppato metodi per lo screening di ampie librerie di varianti di Hsp104 per la soppressione della proteotossicità nel lievito. Poiché i lieviti sono inclini alla soppressione spontanea aspecifica della tossicità, è stato sviluppato un processo di screening in due fasi per eliminare i falsi positivi. Utilizzando questi metodi, abbiamo identificato una serie di varianti potenziate di Hsp104 che sopprimono potentemente la tossicità e l'aggregazione di TDP-43, FUS e α-sinucleina. Qui, descriviamo questo protocollo ottimizzato, che potrebbe essere adattato a librerie di screening costruite utilizzando qualsiasi spina dorsale proteica per la soppressione della tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

Introduzione

Lievito proteinopathy modelli sono stati sviluppati per i disordini di proteine ​​misfolding tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia (PD) ^1-3 di Parkinson. L'espressione delle proteine ​​TDP-43 e FUS, che misfold nei pazienti con SLA, sono tossici e mislocalize a formare aggregati citoplasmatici in lievito ^1,2. Analogamente, l'espressione di α-sinucleina (α-syn), che è implicato nel PD, è tossico e mislocalizes formare aggregati citoplasmatici in lievito ^3. Queste caratteristiche ricapitolano fenotipi in pazienti con questi disturbi ^4,5. Così, i modelli di lievito forniscono una piattaforma utile per lo screening di proteine ​​o piccole molecole che impediscono o invertire questi fenotipi ^2,6-13. Ci interessa lo sviluppo di proteine ​​che sono in grado di invertire aggregazione e tossicità dovuta al TDP-43, FUS, e α-syn. Ci concentriamo su Hsp104, un AAA + proteine ​​da lievito che è l'unica in grado di disaggregare proteine ​​sia fraggregati amorfi OM e amiloide nel lievito, eppure non ha l'omologo umano ^14,15. Hsp104 è finemente sintonizzato per disaggregare i prioni di lievito endogene e ha solo limitata capacità di disaggregare substrati implicati nelle malattie neurodegenerative umane, che non ha mai incontra ordinariamente ^16,17. Così, ci proponiamo di progettare versioni avanzate di Hsp104 in grado di disaggregare efficacemente questi substrati umani. A tale scopo, costruiamo grandi biblioteche di Hsp104 varianti mediante PCR soggetto a errori; queste librerie possono essere sottoposti a screening utilizzando i modelli di lievito proteinopathy ^17. Abbiamo adottato un approccio dominio mirato alla costruzione di screening e biblioteche, come Hsp104 è molto grande ^17. Inizialmente concentrati sul dominio centrale (MD) di Hsp104 ^17, anche se gli approcci simili possono essere impiegati per lo screening altri domini. Questi modelli consentono lo screening per l'attività disaggregase direttamente, al contrario di tecniche alternative come la visualizzazione di superficie, che è riposoricted da utilizzare per il monitoraggio vincolante ^18.

Il nostro protocollo si basa su due fasi di screening (Figura 1). In primo luogo, vengono selezionati varianti Hsp104 che sopprimono la tossicità del substrato malattia in lievito. Per fare ciò, il Hsp104 varianti e le malattie associate substrato sono cotransformed in lieviti Δ Hsp104. Ci avvaliamo di lievito Hsp104 Δ per esplorare Hsp104 sequenza spazio in assenza di wild-type (WT) Hsp104 ^17. È importante sottolineare che l'eliminazione di Hsp104 non influisce α-syn, FUS, o TDP-43 della tossicità in lievito, e l'espressione di Hsp104 ^WT fornisce il minimo soccorso ^1,13,17. Il lievito viene poi placcato sulla indurre media per indurre l'espressione di entrambe le proteine. Lievito ospitare varianti Hsp104 che sopprimono la tossicità della crescita substrato conferiscono associata a malattia della colonia. Queste varianti sono state selezionate per ulteriori analisi, mentre le colonie mantenendo le varianti che non sopprimono la tossicità die. Tuttavia,falsi positivi sono un problema sostanziale in questa schermata. Espressione di TDP-43, FUS, e α-syn sono altamente tossici, che crea una forte pressione selettiva per la comparsa di soppressori genetiche spontanee di tossicità correlato alla variante Hsp104 espressi. Così, abbiamo utilizzato uno schermo secondario che è anche relativamente ad alto throughput per eliminare questi soppressori di tossicità non specifici ^17. In questa schermata secondaria, lieviti selezionati sono trattati con 5-Fluorootic Acid (5-FOA) per contrastare selezione per il plasmide Hsp104 ^19. I ceppi sono poi valutati per substrato (TDP-43, FUS o α-syn) tossicità tramite individuazione test per garantire che la tossicità del substrato viene ripristinata dopo la perdita del plasmide Hsp104. Così, lievito in cui tossicità è ripristinato in questa schermata secondaria visualizzata presumibilmente originariamente soppressione tossicità dovuta alla presenza della variante Hsp104. Questi lieviti sono designati come "hit" e il plasmide Hsp104 dovrebbe quindi essererecuperato e sequenziato per identificare le mutazioni nel gene Hsp104 ¹⁷ (Figura 1). Tutti i colpi devono poi essere riconfermati costruendo la mutazione indipendente utilizzando mutagenesi sito-diretta e poi ripetere il test per la soppressione tossicità. Le potenziali applicazioni di questo protocollo sono ampi. Usando questi metodi, librerie di qualsiasi tipo di proteina potrebbero essere sottoposti a screening per le varianti che sopprimono tossicità di qualsiasi proteina substrato che è tossica in lievito.

Protocollo

1. Biblioteca Generation

1. Per costruire librerie di Hsp104 utilizzando soggetto a errori PCR specifico del dominio, prima amplificare il dominio di interesse con un errore DNA polimerasi inclini ^20.
2. Purificare il prodotto di PCR mediante estrazione gel.
3. Eseguire un passo estensione megaprimer utilizzando un protocollo standard di mutagenesi sito-diretta: unire 50 ng modello plasmide, 250 ng megaprimer, 200 mM dNTP, e ad alta fedeltà polimerasi DNA in tampone PCR, e portare a 50 ml volume totale di acqua di grado PCR ²⁰ . Eseguire un programma standard di PCR.
   NOTA: primer specifici usati varieranno in base alla particolare regione del gene che deve essere amplificato.
   1. A seguito di PCR, digerire il DNA dei genitori modello con 1 ml Dpn I restriction enzyme per 2 ore a 37 ° C.
4. Trasforma la libreria di elettroporazione o altri mezzi a ultracompetent E. coli e purificarlo da miniprep.
   NOTA: generazione Bibliotecavariabile in base sostanzialmente sugli obiettivi di un dato esperimento. Hsp104 è una grande proteina, quindi non è pratico di randomizzare l'intero gene, che è per questo che utilizziamo errore specifico del dominio incline PCR. Inoltre, la struttura di Hsp104 rimane poco compresa, rendendo la progettazione di librerie diretti impegnativi ^21. Le librerie possono essere costruiti utilizzando approcci dirette o casuali per mutagenesi, con l'unica limitazione è che il plasmide ossatura modello deve contenere il gene URA3 per consentire 5-FOA contatore scelta su supporti destrosio.

2. Trasformazione della Biblioteca Hsp104

1. Integrare il substrato associata a malattia in lievito Hsp104 W303aΔ con un acetato di litio standard di / PEG protocollo di trasformazione ^22. Selezionare singole colonie e lo screening per la tossicità per isolare un ceppo con elevata tossicità della malattia substrato ²³ associati.
   NOTA: Utilizzare un ceppo integrato e isolaTé una singola colonia per garantire la parità di espressione in tutte le cellule. Clone substrato malattia in un plasmide permette l'integrazione del gene sotto qualsiasi marcatore diverso uracile (usiamo istidina) e la libreria Hsp104 nel plasmide pAG416GAL (marcatore uracile) ^24. Per consentire 5-FOA counterselection, assicurarsi che la libreria è espresso da un plasmide con il marcatore uracile. Altri ceppi di lievito possono anche essere impiegati. Abbiamo notato un simile fenotipo soppressione di tossicità utilizzando W303a e BY4741 ceppi di lievito in entrambi gli sfondi Hsp104 WT e Δ (MEJ e JS, osservazioni non pubblicate).
2. Trasforma la libreria Hsp104 in questo ceppo utilizzando lo stesso acetato di litio / PEG protocollo di trasformazione ^22. Scale la trasformazione appropriato per mantenere la sequenza spazio della biblioteca e di preservare la dimensione biblioteca predetto.
3. Piatto il composto trasformazione su noninducing, piastre selettive (ad esempio, SD-His-Ura) con un numero sufficiente di piastre aassicurare la crescita di un gran numero di colonie. Utilizzare grandi piastre di Petri (150 mm) per ridurre al minimo il numero di piatti necessari. Recupero trasformanti che utilizzano piastre permette l'efficienza di trasformazione da valutare.
4. Trasforma Hsp104 ^WT e controlli negativi vettoriali in parallelo.

3. Screening per la repressione del proteotoxicity

1. Lavare le colonie al largo delle piastre con raffinosio integrato dei media di abbandono (ad esempio SRaff-His-Ura). Utilizzare una pipetta sierologica e applicatori in legno sterili per allentare le colonie dalle piastre. Trasferire i lavaggi liquido in una provetta da 50 ml e agitare accuratamente per separare eventuali grumi di cellule. Diluire a una cultura un po 'nuvoloso, OD ₆₀₀ ~ 0.025.
   NOTA: Qui serve raffinosio per alleviare le cellule della repressione di glucosio-mediata di induzione, adescamento in tal modo le cellule per l'induzione galattosio-mediata.
2. Far crescere la coltura diluita durante la notte nei mezzi di abbandono raffinosio con agitazione a 30 ° C. Far crescere la Hsp104 ^WT e controlli vettoriali in parallelo.
3. La mattina seguente, piatto una serie di concentrazioni su galattosio individuale (ad esempio SGal-His-Ura) piastre (1 ml a 2 ml cultura concentrate in 400 ml di volume totale). Placcatura una vasta gamma di concentrazioni garantirà che un piatto avrà singole colonie. La concentrazione effettiva richiesta dipende dalla tossicità del substrato patologia di interesse.
4. Normalizza il vettore e culture Hsp104 ^WT al diametro esterno ₆₀₀ della biblioteca e piastra volumi uguali di confrontare la crescita della biblioteca rispetto ai controlli.
5. Per valutare selezione rigore, piatto biblioteca in glucosio (repressione) dei media. Incubare le piastre per 2-3 giorni a 30 ° C, fino a quando le colonie appaiono (Figura 2). Valutare le colonie risultanti e confrontare ai controlli.
   NOTA: Spesso entrambe le colonie grandi e piccole si ottengono, ma nessuna correlazione tra le dimensioni delle colonie e di agireivity si osserva. Schermo questi potenziali colpi utilizzando una tecnica di selezione contatore 5-FOA (Fase 4) per ridurre al minimo i falsi positivi riportati al sequenziamento.

4. 5-FOA Counterselection e Spotting per eliminare i falsi positivi

1. Streak le singole colonie in duplice copia su supporto matrimoniale e letto singolo caduta di tensione (ad esempio, SD-suo-Ura e SD-I suoi piatti) e crescere una notte a 30 ° C. Ripetere con controlli vettoriali e Hsp104 ^WT. Placcatura su SD-His prima 5-FOA aumenta l'efficienza della fase 5-FOA aumentando la probabilità che le cellule avranno perso il plasmide Hsp104 quando vengono piastrate su 5-FOA.
2. Per evitare che le piastre si secchi, avvolgere le piastre in parafilm suoi Ura-SD-e conservare a 4 ° C durante l'esecuzione dello schermo 5-FOA. Queste piastre saranno eventualmente utilizzati per il sequenziamento.
3. Streak le colonie dalla SD-I suoi piatti a singole colonie su piastre 5-FOA (YPD supporti + 1 g / L 5-FOA) e incubare per 1-2 giorni a 30 &# 186; C fino singole colonie appaiono. Qui, 5-FOA viene convertito in un prodotto tossico (5-fluorodeossiuridina) in cellule che contengono il gene URA3. Pertanto, eventuali cellule ancora ospitano il plasmide Hsp104 moriranno.
4. Streak le singole colonie dalle piastre 5-FOA in duplicato su SD-Ura e SD-I suoi piatti. Test 3 colonie per ogni hit per aumentare la probabilità che almeno una colonia per ogni colpo avrà perso il plasmide Hsp104. Incubare per 1-2 giorni a 30 ° C. Le colonie che hanno perso il plasmide Hsp104 si svilupperà su SD-I suoi piatti, ma non piatti SD-Ura.
5. Far crescere le tensioni che hanno perso i plasmidi Hsp104 per individuare saggi. Crescere i ceppi di saturazione in raffinosio abbandono dei media (ad esempio SRaff-His) in 96 Deepwell 2 piastre ml notte a 30 ° C con agitazione. Assicurati di includere i ceppi di controllo 5-FOA trattati.
6. Preparare piastre per individuare test. Utilizzando una pipetta multicanale, un'aliquota raffinosio 200 microlitri mezzi di abbandono (ad esempio SRaff-His) perpozzetto di una piastra da 96 pozzetti, riservando colonne 1 e 7 per le culture pulito. Aliquotare 250 ml di ciascuno dei 16 culture saturi nelle colonne 1 e 7 della piastra.
7. Serialmente diluire le culture 5 volte in ogni colonna della piastra, mescolando accuratamente con una pipetta multicanale. Rimuovere 50 ml di coltura diluita dalle colonne 6 e 12 per garantire il volume finale di ciascun pozzetto a 200 microlitri. Questo è essenziale per garantire anche spotting.
8. Utilizzando uno strumento replicatore 96-bullone (Frogger), individuare le culture in duplicato su SD-Sue e-SGal suoi piatti. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 giorni.
9. Seleziona per sequenziamento ceppi che presentano tossicità sui SGal-sue piastre simile a quella dei controlli. Eliminare positivi come falsi ceppi che non sono tossici come i controlli. 5-FOA è anche spesso tossici propria, così scartare ceppi che presentano un difetto di crescita su SD-sue piastre o che mostrano sostanzialmente maggiore tossicità rispetto al substrato malattie sola ( Figura 3).

5. Il sequenziamento del Hsp104 Varianti di Colony PCR

1. Raschiare ~ 10 microlitri lievito dalle piastre SD-His-Ura in NaOH 3 ml 20 mM in tubi strip PCR e lisare le cellule di gelo-disgelo. Porre i tubi striscia in un congelatore -80 ° C per 10 min o in azoto liquido, poi incubare a 99 ° C in un termociclatore per 10 min. Diluire i ceppi a 100 ml con acqua di grado PCR.
2. Preparare le reazioni PCR: 5 ml modello PCR, 0,5 microlitri 100 mM di ciascun primer, 0,5 ml 10mM dNTP, 0,25 ml polimerasi del DNA in tampone PCR, e portare a 25 ml volume totale di acqua di grado PCR. Primer design per amplificare la regione randomizzato più di circa 100 bp su entrambe le estremità. Minimizzare la dimensione della regione amplificata per aumentare la probabilità di successo di amplificazione. Eseguire un programma standard di PCR.
3. Analizzare i campioni mediante elettroforesi su gel di agarosio per confermare l'amplificazione di un prodotto di PCR del siz appropriatae. Ripetere PCR se nessun prodotto è presente.
   NOTA: il fallimento PCR è in genere a causa di troppo lievito utilizzato nella fase 5.1.
4. Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA. Rimuovere primer PCR sia mediante PCR di depurazione o uso di un prodotto di PCR pulizia reattivo come esonucleasi I e gamberetti fosfatasi alcalina (ExoSAP-IT) per degradare DNA a singolo filamento. Questo reagente degrada enzimaticamente primer non incorporati e dNTP, consentendo un throughput più elevato.
5. Sequenziare i prodotti di PCR. Assicurati di analizzare a fondo cromatogrammi sequenziamento di mutazioni. Le mutazioni possono essere osservati come una miscela di due nucleotidi in un determinato sito (figura 4), ​​come lievito spesso porto più plasmidi.

Risultati

Abbiamo costruito una libreria di varianti Hsp104 randomizzati nel dominio centrale e proiettato per la soppressione di TDP-43 tossicità. La biblioteca è stata trasformata e placcato su glucosio e galattosio piastre (Figura 2) per valutare la severità dello schermo. Singole colonie sono stati selezionati e ceppi sono stati selezionati contatore utilizzando 5-FOA per eliminare il plasmide Hsp104. Questi ceppi sono stati poi valutati per confermare che la tossicità era dovuta al TDP-43 da solo, senza le v...

Discussione

Qui vi presentiamo il nostro approccio per isolare le varianti Hsp104 potenziati che sopprimono la tossicità di substrati associate alla malattia che utilizzano modelli di lievito proteinopathy. Usando questo approccio, grandi librerie di varianti possono essere proiettati in alta velocità, con l'unica limitazione è il numero di varianti che passano schermo secondario 5-FOA. Per eseguire le operazioni descritte in 96 formati bene, abbiamo regolarmente dello schermo fino a 200 colpi alla volta nella fase 5-FOA nel co...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
piastre di Petri da 150 mm	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Piastre	Eppendorf	0030 502.302
96 strumento replicatore audace	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200