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Articolo metodologico

Sintesi di Immunotargeted magneto-plasmonica nanocluster

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DOI:

10.3791/52090

⸱

22 agosto 2014

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e un forte vicino infrarosso (NIR) assorbanza. Il protocollo include anche anticorpi coniugazione alle nanoparticelle attraverso la porzione Fc per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico.

Abstract

Proprietà magnetiche e plasmoniche combinati in una singola nanoparticella forniscono una sinergia che è vantaggioso in un certo numero di applicazioni biomediche, tra cui aumento del contrasto in nuove modalità di imaging magnetomotrice, la cattura simultanea e il rilevamento delle cellule tumorali circolanti (CTC), e imaging molecolare multimodale combinato con la terapia fototermica delle cellule tumorali. Queste applicazioni hanno stimolato notevole interesse per lo sviluppo di protocolli per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con assorbanza ottica nel vicino infrarosso (NIR) regione e un forte momento magnetico. Qui, presentiamo un nuovo protocollo per la sintesi di tali nanoparticelle ibride che si basa su un metodo di microemulsione olio-in-acqua. La caratteristica unica del protocollo qui descritto è la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica di varie dimensioni dai blocchi principali che hanno anche caratteristiche magneto-plasmonici. Questo approccio produce nanoparticelle con elevata densità di funzionalità magnetici e plasmoniche che sono distribuiti in modo uniforme in tutto il volume di nanoparticelle. Le nanoparticelle ibride possono essere facilmente funzionalizzati collegando anticorpi attraverso la porzione Fc lasciando la porzione Fab che è responsabile per il legame disponibili per il targeting antigene.

Introduzione

Nanoparticelle ibride costituite da materiali diversi con diverse proprietà fisico-chimiche possono aprire nuove opportunità in applicazioni biomediche, tra cui l'imaging molecolare multimodale, l'erogazione della terapia e monitoraggio, nuovi screening e test diagnostici 1-3. La combinazione di proprietà plasmonici e magnetiche in una singola nanoparticella è di particolare interesse perché fornisce molto forti diffrazione della luce e di assorbimento sezioni associati risonanze plasmon e risposta ad un campo magnetico. Ad esempio, le nanoparticelle magneto-plasmonica sono stati usati per aumentare il contrasto in campo scuro imaging cellule marcate applicando un segnale di modulazione temporale tramite un elettromagnete esterno 3-5. Più di recente, un principio simile è stato applicato nello sviluppo di una nuova modalità di imaging - di imaging magneto-fotoacustica, dove nanoparticelle magneto-plasmonica consentono grandi miglioramenti in contrasto e segnale-fondo rattoio 6,7. È stato anche dimostrato che le nanoparticelle ibride possono essere usate per la cattura e la rilevazione di cellule tumorali circolanti nel sangue intero e in vivo 8,9 simultanea. Inoltre, le nanoparticelle magneto-plasmonica sono promettenti agenti Theranostic che possono essere utilizzati per l'imaging ottico e RM specifico molecolare combinato con la terapia fototermica delle cellule tumorali 10.

Diversi approcci sono stati esplorati per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica. Ad esempio, Yu et al. Decomposizione utilizzati e ossidazione di Fe (CO) 5 su nanoparticelle di oro per formare manubri come bifunzionali Au-Fe 3 O 4 nanoparticelle 11. Wang et al. Hanno sintetizzato oro rivestite di ferro ossido di nanoparticelle utilizzando il metodo di decomposizione termica 12. Alcuni altri approcci si basano su polimeri di rivestimento o di ammine molecole funzionali su nanoparticelle magnetiche di base seguita dalla deposizione di agguscio vecchio sulla superficie del polimero per creare l'ibrido particelle 7,13. Inoltre, le nanoparticelle di ossido di ferro sono state allegate alla nanotubi d'oro tramite interazioni elettrostatiche o una reazione chimica 14,15. Sebbene questi approcci producono nanostrutture magneto-plasmoniche, compromettono ad alcune proprietà misura della combinazione magneto-plasmonica come assorbanza ottica nella finestra vicino infrarosso (NIR) o un forte momento magnetico che sono entrambi altamente auspicabile in applicazioni biomediche. Ad esempio, manubri Au-Fe 3 O 4 nanoparticelle hanno un picco di risonanza plasmonica a 520 nm, che limita la loro utilità in vivo a causa della elevata torbidità tessuto in questo intervallo spettrale. Inoltre, le nanoparticelle magneto-plasmonica prodotti da protocolli attuali sono limitate a un solo 11 o pochi (meno di 10) 14,15 frazioni superparamagnetiche (ad esempio, nanoparticelle di ossido di ferro) che è significativamente inferiore potrebbe essere achieved in una nanostruttura densamente. Ad esempio, una densamente diametro 60 nm nanoparticelle sferiche può contenere dell'ordine di un migliaio di 6 nanoparticelle superparamagnetiche nm. Pertanto, non vi è spazio per migliorare le proprietà magnetiche delle nanoparticelle ibride un grande. Inoltre, alcuni dei protocolli precedentemente descritti sono relativamente complesse e richiedono un'attenta ottimizzazione per evitare l'aggregazione delle particelle durante la sintesi 14,15.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e una forte assorbanza NIR che affronta i principali limiti della tecnica attuale. La sintesi ha le sue origini nel metodo 16 olio-in-acqua microemulsione. Si basa su assemblaggio di nanoparticelle di una dimensione desiderata di una molto più piccole particelle primarie. Questo approccio è stato utilizzato con successo per la produzione di nanostrutture da un unico materiale come l'oro, ossido di ferro, e semiconduttori primary particelle 16. Abbiamo esteso alla sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica da, prima, rendendo le particelle fondamentali ossido di 6 nm di diametro shell oro / ferro e, quindi, l'assemblaggio delle particelle ibride primarie nella nanostruttura sferica finale. Montaggio particelle primarie in nanocluster non solo consente di migliorare le proprietà delle nanoparticelle costituenti, come ad esempio il raggiungimento di un momento magnetico più forte preservando le proprietà superparamagnetiche, ma si avvale anche delle interazioni tra i singoli nanoparticelle creando così nuove caratteristiche assenti dalle nanoparticelle costituenti, come forte assorbanza ottica nella finestra NIR. Questo protocollo produce nanoparticelle ibride ad alta densità di funzionalità magnetici e plasmoniche. Dopo particelle primarie vengono sintetizzati, il nostro metodo è essenzialmente una semplice reazione one-pot. La forza complessiva di risonanza plasmonica e momento magnetico sono determinati da una serie di particelle primarie e, therrima, può essere facilmente ottimizzato a seconda dell'applicazione. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una procedura per la coniugazione di anticorpi alle nanoparticelle ibride per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico. Gli anticorpi sono collegati attraverso la frazione Fc lasciando la porzione Fab che è responsabile per l'associazione disponibili per il targeting antigene.

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Protocollo

1. Strumentazioni e Cristalleria Preparazione

  1. Indossare attrezzature adeguate di protezione, vale a dire, un camice da laboratorio, guanti monouso e protezione per gli occhi.
  2. Collegare un pallone a fondo rotondo da un condensatore ed immergerlo in un bagno di olio di silicone con un monitoraggio della temperatura da un termometro. Inserire una fonte di calore (ad esempio, Piastra) sotto il bagno d'olio (Figura 1). Utilizzare un termometro in grado di misurare la temperatura superiore a 260 ° C.

Nanoparticelle 2 Sintesi di Hybrid Primaria magneto-plasmonica

  1. Fare magnetica core nanoparticelle
    1. Aggiungere 353,2 mg (1 mmol) di ferro (III) acetilacetonato, 1 ml (2 mmol) di acido oleico, 1 ml (2 mmol) Oleilamina, 1.292 g (5 mmol) 1,2-hexadecanediol, e 10 ml di fenil etere per un giro pallone -bottom.
    2. Lavorare l'impasto energicamente con un stir-bar e di calore magnetico di 250-260 ° C per 1 ora a riflusso. Quindi, attendere che la soluzione si raffreddifino a RT. Assicurarsi che la temperatura è sotto 260 ° C per evitare di ebollizione dell'etere fenile ed impedire uno scoppio della miscela di reazione dal pallone a fondo rotondo al condensatore.
      ATTENZIONE: La miscela di reazione è estremamente caldo e le sostanze chimiche può causare irritazione. Deve operare sotto una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale. Garantire una ventilazione adeguata per il bagno d'olio.
      NOTA: Il bagno d'olio viene mantenuto a temperatura di 250-260 ° C per 1 ora durante la sintesi delle nanoparticelle magnetiche. In linea di principio, un piatto di vetro Pyrex può essere utilizzato per questo scopo. Tuttavia, la temperatura massima continua di vetro Pyrex è ~ 260 ° C secondo le informazioni del fornitore. Pertanto, un contenitore di metallo fornisce una soluzione più sicura per la reazione in quanto può sopportare una temperatura più alta e durare più a lungo durante multiple.
  2. Deposizione di una conchiglia d'oro su nanoparticelle nucleo magnetico
    1. Aggiungere 411,5 mg (1,1 mmol) di oro acetate, 0,25 ml (0,75 mmol) di acido oleico, di 1,5 ml (3,0 mmol) Oleilamina, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadecanediol, e 15 ml di fenil etere per un pallone a fondo rotondo.
    2. Aggiungere 5 ml di sospensione di nanoparticelle magnetiche dal punto 2.1. Riscaldare la miscela di reazione a 180 ° C e mantenere sotto riflusso per 1 ora. Attendere che la soluzione si raffreddi a RT.
    3. Aggiungere 50 ml di etanolo per precipitare le nanoparticelle primarie ibridi seguita da centrifugazione a 3.250 × g per 15 min.
    4. Risospendere il precipitato in 25 ml di esano utilizzando un bagno sonicatore. Aggiungere 25 ml di etanolo per precipitare le nanoparticelle ibride primarie. Centrifugare a 3.250 xg per 15 min e risospendere il precipitato in esano. Ripetere questa operazione tre volte.
    5. Asciugare le nanoparticelle ibride primario precipitati in un essiccatore a vuoto O / N. Verificare che le particelle sono completamente asciutti.

Nanocluster 3 Hybrid magneto-plasmonici Sintesi e Dimensione Separazione

  1. Risospendere 5 mg di nanoparticelle ibride primarie secche in 1 ml di esano utilizzando un bagno sonicatore. Sonicare la sospensione di nanoparticelle fino a quando non precipitato visibile è presente.
  2. Aggiungere la soluzione dal punto 3,1-10 ml di soluzione acquosa di sodio dodecil solfato (2,8 mg / ml) in un flaconcino di vetro da 20 ml con tappi attaccati. Aggiungere la sospensione di nanoparticelle ibride primaria goccia a goccia per evitare la miscelazione delle due fasi prima del passaggio successivo.
  3. Sonicare la soluzione a due fasi in un bagno sonicatore per 2 ore, seguita da riscaldamento in un bagno d'acqua a 80 ° C per 10 min. Attendere che la soluzione si raffreddi a RT.
    1. Riempire acqua alla linea di livello operativo del bagno sonicazione. Centrare la fiala di vetro nel bagno di sonicazione. Una forma di emulsione immediatamente tra le due fasi. Agitare la soluzione a due fasi a mano dopo l'inizio della sonicazione; questo facilita la miscelazione tra la fase contenente nanoparticelle ibride primarie e la fase acquosa inferiore.
      NOTA: Tenere presente that il sonicatore si riscalda dopo 2 ore di funzionamento.
  4. Centrifugare la sospensione nanocluster ibrido a 100 xg per 30 min. Raccogliere sia il precipitato e il surnatante. Risospendere il precipitato in 0.1 mM sodio citrato in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 180 nm di diametro.
  5. Trasferire il surnatante dal punto 3.3 a un nuovo tubo conico.
  6. Centrifugare la sospensione dal punto 3.4 a 400 xg per 30 min. Raccogliere sia il precipitato e il surnatante. Risospendere il precipitato in 0.1 mM sodio citrato in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 130 nm di diametro.
  7. Trasferire il surnatante dal punto 3.5 a un nuovo tubo conico.
  8. Centrifugare la sospensione dal punto 3.6 a 1.500 xg per 30 min. Raccogliere il precipitato e risospendere in citrato di sodio 0,1 mM in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 90 nm di diametro.
  9. Aggiungere 300 _6; l sospensione nanocluster di un lettore di micropiastre a 96 pozzetti per misurare uno spettro di assorbimento UV-Vis-NIR. Goccia 10 microlitri di sospensione nanocluster sulla rete in rame di carbonio rivestite per l'imaging TEM.

4. Coniugazione di anticorpi monoclonali per nanocluster

  1. Preparare 100 microlitri soluzione di anticorpo monoclonale (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, ad esempio, anti-Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) anticorpi o anticorpi anti-Epidermal Growth Factor Receptor 1 (EGFR).
  2. Aggiungere la soluzione di anticorpi da passo 4,1-3,9 ml 4 HEPES mM, pH 7,2. Centrifugare la soluzione attraverso un filtro centrifugo 10 k MWCO a 3.250 xg per 20 min a 8 ° C. Risospendere l'anticorpo a 4 mM HEPES, pH 7,2, per un volume finale di 100 ul.
    NOTA: Questa fase viene effettuata per sostituire il supporto originale nella soluzione di anticorpi con HEPES.
  3. Aggiungere 10 ml di 100 mM Naio 4 a 100 ml di soluzione di anticorpi. Coprire il flaconcino per reazione con un alfoglio uminum a RT e mescolare per 30 minuti con un agitatore orbitale.
  4. Placare la reazione aggiungendo 500 ml di PBS 1x.
  5. Aggiungere 2 ml di soluzione di linker 46,5 mm (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) per la soluzione di anticorpi dal punto 4.4 e agitare per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Filtrare la soluzione con un filtro di centrifuga 10 k MWCO a 3.250 xg per 20 min a 8 ° C. Risospendere l'anticorpo in 1x PBS fino ad un volume finale di 100 ml che porta ad una concentrazione di anticorpo di ~ 1 mg / ml.
  7. Mescolare 100 ml di sospensione nanocluster a OD ~ 1,0 con 1 ml di anticorpi modificati dal punto 4.6 (1 mg / ml) per 120 minuti a temperatura ambiente.
  8. Aggiungere 10 ml di 10 -3 M 5 kDa tiolo PEG e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  9. Centrifugare la soluzione a 830 x g per 3 min. Eliminare il supernatante e risospendere il sedimento in 100 ml 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
  10. Misurare lo spettro di assorbimento dei nanocluster anticorpo-coniugato e confrontare tegli assorbanza spettro dei nanocluster nude. Aspettatevi un paio di nanometri spostamento verso il rosso dopo la coniugazione.
  11. Se le nanoparticelle aggregato come mostrato da un cambiamento significativo con un aumento OD nella regione rosso-NIR, aumentare la concentrazione di PEG tiolico per 5 x 10 -3 M. Inoltre, aumentare il tempo di incubazione con tioli PEG per 30 min e diminuire la velocità di centrifuga con incrementi di 200 XG.
  12. Per il cancro prova etichettatura delle cellule, aggiungere l'anticorpo nanoparticelle coniugate dal punto 4.9 a sospensione di cellule di cancro sia in media o PBS 1X (1 ml ~ 10 6 celle) e mescolare per 60 min.

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Risultati

Uno schema per la sintesi di nanocluster magneto-plasmonica immunotargeted è mostrato nella Figura 2. Innanzitutto, magnetici Fe 3 O 4 nanoparticelle di ossido di ferro sono sintetizzati con il metodo di decomposizione termica. Poi, un sottile circa 1 guscio d'oro nm è depositato sulle particelle di nucleo di ossido di ferro tramite decomposizione termica. Le nanoparticelle ibride primaria circa 6 nm servono come semi per creare nanocluster magneto-plasmonica util...

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Discussione

Passaggi critici di successo in sintesi di nanocluster magneto-plasmonica includono rendendo altamente monodisperse shell / ferro nanoparticelle di ossido di oro nucleo primario e dirigendo auto-assemblaggio delle particelle primarie in nanocluster. Un rapporto molare tra le particelle primarie e tensioattivi svolgono un ruolo importante nel determinare distribuzione dimensionale dei nanocluster. Non uniforme distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle primarie può causare la formazione di grandi aggregati duran...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R01 EB008101 e R01 CA103830.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pallone di ebollizione PYREX da 50 ml a fondo tondo con collo corto e giunto 24/40 [ST]Corning4320A-50Reazione di decomposizione termica
PYREX 41 x 300 mm Condensatore Allihn a 5 bulbi con giunti esterni/interni 24/40 [ST]Corning2480-300Reazione di decomposizione termica
Olio siliconicoFisherS159-500Bagno d'olio
Agitatore a piastra riscaldanteCorningPC-351Riscaldare il reattore con funzione di agitazione
TermometroThermoWorks221-092Misurare la temperatura
Acetilacetonato di ferro (III)FisherAC11913-0250Materiale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
Acido oleico 99%FisherA195-500Materiale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
Acetato d'oro (III)FisherAA3974206Materiale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
HexaneFisherH292-1Materiale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
Etere fenilico 99%FisherAC13060-0025Materiale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
1,2-Esadecanediolo 90%Sigma213748-50GMateriale per la sintesi
di nanoparticelle ibride primarieOleylamine 70%SigmaO7805-100GMateriale per la sintesi di nanoparticelle ibride primarie
Dodecil solfato di sodioFisherBP166-100Sintesi di cluster
Citrato di sodio diidratoSigmaW302600Sintesi di cluster
Anticorpo monoclonale anti-recettore EGFSigmaE2156Test di specificità della marcatura cellulare
Anti-HER2 monoclonale anticorpoSigmaAMAB90627Test di specificità della marcatura cellulare
Periodato di sodioSigma311448Regione Fc ossidato degli anticorpi
Ditioloaromatico PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014BLinker eterofunzionale per la coniugazione di anticorpi a nanocluster
Metossi-PEG-tiolo, 5 kCreative PEGworksPLS-604Passivare la superficie d'oro rimanente dopo la coniugazione degli anticorpi
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10MilliporeUFC801008Purificazione delle proteine
HEPESSigmaH3375Tampone
PBS, 1x soluzioneFisherBP2438-20Tampone
Spettroscopia UV-VisBioTek Synergy HTOttenere la centrifuga a spettro
Eppendorf5810RMicroscopio
e trasmissioneFEITECNAI G2 F20 X-TWINOttenere la morfologia delle nanostrutture
Microscopio verticaleLeicaDM6000Ottenere immagini in campo scuro
SonicatoreBranson1510Sonicazione
Film di carbonio 300 mesh grigliaEMSCF300-CuPiastra TEM per imaging
96 pozzettiPiastra di lettura UV-VisCorning09-761-145
elettronico a separazione a

Riferimenti

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