Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

Jerome E. Lee; Rui Yi

doi:10.3791/52095

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Articolo metodologico

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

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DOI:

10.3791/52095

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18 novembre 2014

Jerome E. Lee¹ , Rui Yi¹^,²

¹Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, ²Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

In questo articolo

Sommario

I microRNA (miRNA) sono una classe ampiamente conservata di molecole regolatorie. Qui descriviamo un metodo di clonazione dei miRNA che si basa su due potenti fasi di legatura seguite da un sequenziamento ad alto rendimento. Il nostro metodo consente un'accurata quantificazione dell'intero genoma dei miRNA.

Abstract

Mirna clonazione e high-throughput sequencing, chiamati miR-Seq, si trova solo come un approccio a livello di trascrittoma per quantificare miRNA con risoluzione di singolo nucleotide. Questa tecnica cattura miRNA collegando adattatori 3 'e 5' oligonucleotide alle molecole miRNA e permette la scoperta de novo miRNA. Accoppiamento con potenti piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, miR-Seq è stato determinante per lo studio della biologia miRNA. Tuttavia, distorsioni significative introdotte dal oligonucleotide passi legatura hanno impedito miR-Seq da essere impiegato come strumento di quantificazione accurata. Studi precedenti hanno dimostrato che i pregiudizi in attuali metodi di miR-Seq spesso portano a inesatte miRNA quantificazione di errori fino a 1.000 volte per alcuni miRNA ^1,2. Per risolvere questi pregiudizi impartite dalla RNA legatura, abbiamo sviluppato un piccolo metodo di legatura RNA che si traduce in efficienza legatura di oltre il 95% sia per la 3 'e 5' passi legatura. Benchmarking questo imdimostrato metodo di costruzione libreria utilizzando miRNA sintetici equimolare o differenziale misti, produce sempre legge i numeri con deviazione inferiore a due volte rispetto al valore atteso. Inoltre, questo metodo ad alta efficienza miR-Seq permette accurate genome-wide miRNA profiling dall importo totale di campioni in vivo di RNA ^2.

Introduzione

Metodologie basate High-throughput sequencing sono stati ampiamente applicati a molti campioni biologici negli ultimi anni notevolmente ampliando la nostra comprensione della complessità molecolare dei sistemi biologici ^3,4. Tuttavia, la preparazione di campioni di RNA per high-throughput sequencing conferisce spesso pregiudizi specifici inerenti alla metodologia utilizzata, che limitano la potenziale utilità di queste tecniche potenti. Questi pregiudizi metodo specifico sono stati ben documentati per la base di legatura-piccolo-RNA preparati biblioteca ^1,2,5,6. Questi pregiudizi in una modifica di 1000 volte in legge dei numeri per miRNA sintet....