Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Sommario

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS ^G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Abstract

Qui descriviamo un metodo per indurre condizionatamente la trasformazione delle cellule epiteliali mediante l'uso^{del sistema di} espressione^{1 T2}/UAS KalTA4-ER inducibile al 4-idrossitamoxifene (4-OHT) nelle larve di zebrafish e la successiva imaging dal vivo dell'interazione delle cellule immunitarie innate con le cellule della pelle che esprimono HRAS^G12V. Il sistema KalTA4-ER^T2/UAS è sia inducibile che reversibile, il che ci consente di indurre la trasformazione cellulare con una precisa risoluzione temporale/spaziale in vivo. Questo ci offre un'opportunità unica per immaginare dal vivo come le singole cellule preneoplastiche interagiscono con i tessuti ospiti non appena emergono, quindi seguono la loro progressione e regressione. Recenti studi sulle larve di zebrafish hanno dimostrato una funzione trofica dell'immunità innata nelle prime fasi della tumorigenesi^2,3. Il nostro sistema inducibile ci permetterebbe di visualizzare dal vivo l'inizio della trasformazione cellulare e la successiva risposta dell'ospite, il che potrebbe portare a importanti intuizioni sui meccanismi alla base della regolazione delle risposte infiammatorie trofiche oncogeniche. Discutiamo anche di come si potrebbe adattare il nostro protocollo per ottenere il controllo temporale e spaziale dell'espressione genica ectopica in qualsiasi tessuto di interesse.

Introduzione

La crescita eccessiva di una progenie di cellule preneoplastiche all'interno di un foglio epiteliale altrimenti normale dipende fortemente l'interazione con il suo microambiente. L'interazione con il tessuto ospite è probabile che sia il principale determinante se una cellula preneoplastiche è in grado di stabilire una nicchia clonale di sviluppare ulteriormente in un cancro soffiato completa. Nonostante la sua importanza nello sviluppo, questa fase iniziale di progressione del cancro è inaccessibile in sistemi modello più comunemente utilizzati, in vivo.

Il pesce zebra, Danio rerio, è un organismo modello consolidato per studi di imaging dal vivo a causa della sua trasparenza durante lo sviluppo, la possibilità di manipolazione genetica, e l'accessibilità per i farmaci solubili in acqua. Recenti studi utilizzando un modello zebrafish larvale, overexpressing l'oncogene umano HRAS ^G12V per trasformare cellule epiteliali, hanno mostrato che cellula ospite segnali derivati, in particolare H ₂ O _{2 determinano}il reclutamento di cellule immunitarie innate. È interessante notare che i reclutati cellule immunitarie, neutrofili e macrofagi, hanno mostrato di avere un ruolo trofico nel sostenere la proliferazione delle cellule preneoplastiche ^2,3.

Per comprendere primi eventi di innesco e la progressione tumorale nonché il contributo di una risposta infiammatoria, bisogna poter un'immagine questi eventi dal punto di tempo prima poi. Pertanto è necessario controllare trasformazioni cellulari in modo specifico temporale e tissutale. Utilizziamo il sistema / UAS Gal4 che è stato adattato con successo da Drosophila ⁴ esprimere condizionale oncogene umano HRAS ^G12V sotto il controllo del promotore specifico pelle cheratina 4 (krt4) ^5. La versione modificata del trascrizionale attivatore GAL4, cioè KalTA4 ^6, consente l'espressione di HRAS ^G12V sotto il controllo del Upstream Attivazione Sequence (UAS). Per indurre l'espressione condizionale attivatore trascrizionale, KalTA4 è stata fusa al-ligando dominio mutante del recettore degli estrogeni α umani (ER ^{T2) 7,} che si lega specificamente a 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) ^1. In assenza di 4-OHT ER ^T2 è vincolato nel citoplasma da proteine ​​da shock termico. Dopo 4-OHT impegnare la heat-shock proteine ​​dissociano, permettendo una traslocazione nucleare del KalTA4-ER ^T2 e successiva attivazione dei UAS controllate gene di interesse ⁸ (Figura 1C, b). Poiché questo sistema di espressione dipende dalla presenza di 4-OHT, l'espressione KalTA4 controllata di un gene di interesse è reversibile. In contrasto con il sistema Cre-ER ^T2 / Lox, che porta ad un evento di ricombinazione irreversibile, l'induzione di attivazione trascrizionale da KalTA4-ER ^T2 è reversibile mediante aggiunta o la rimozione di 4-OHT.

Il seguente protocollo allo ws una trasformazione condizionale delle cellule della pelle in larve di zebrafish e un successivo monitoraggio delle interazioni con le cellule immunitarie innate di espressione della proteina fluorescente. Le metodologie di base utilizzate in questo protocollo sono simili ad alcune tecniche comunemente utilizzate all'interno della comunità zebrafish ^9-13.

La generazione e l'uso combinatoria delle linee transgeniche con la microiniezione di costrutti transgenici permette un approccio transitorio per trasformare solo singole cellule in modo mosaico. La permeabilità all'ossigeno della pelle zebrafish embrionale e larvale aumenta la possibilità di time-lapse studi di imaging dal vivo di microscopia ad alta risoluzione da ore a giorni. Inoltre, la sua accessibilità ai farmaci idrosolubili consentirà futuri studi meccanicistici e il monitoraggio delle cellule eventi biologici in vivo che potrebbero portare a una migliore comprensione delle prime fasi di sviluppo del cancro.

_content "> Questo protocollo può essere adattato per eseguire l'espressione genica condizionale in qualsiasi tessuto di interesse nelle larve zebrafish, in maniera mosaico. Si può anche ottimizzare l'impostazione per vivere immagine profondi tessuti diversi skin microscopio.

Protocollo

Le seguenti procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con gli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986.

1. Preparazione di DNA plasmidico per microiniezione

1. Purificare il plasmide pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP con un plasmide DNA kit di purificazione commerciale secondo le istruzioni del produttore e diluire il DNA plasmide di una finale concentrazione della soluzione di 100 ng / ml.
2. Linearizzare la trasposasi contenente pT3TS plasmide / Tol2 ¹⁴ da BamHI restrizione digestione, seguendo il protocollo del produttore. Questo passaggio può essere esteso durante la notte. Precipitare il DNA linearizzato da una estrazione con fenolo / cloroformio, seguendo il protocollo standard.
3. In vitro trascrivere il mRNA trasposasi dal plasmide linearizzato con un kit di trascrizione commerciale per grandi quantità di RNA ricoperto secondo le istruzioni del produttore, diluire e un'aliquota diuna finale concentrazione della soluzione di 100 ng / ml in acqua priva di nucleasi. Garantire la qualità del RNA purificato con un nativo 1-2% TAE (Tris 40 mM, 20 mm di acido acetico, 1 mM EDTA) gel elettroforesi (80-120 V). Conservare l'RNA a -80 ° C.

2. microiniezione di DNA plasmidi per Transient espressione genica

1. Preparare una piastra di iniezione agarosio tenere le uova fecondate durante l'iniezione. Versare liquido 3% agarosio in una capsula di Petri 90 mm. Lasciare raffreddare agarosio a 40-50 ° C e aggiungere lo stampo microiniezione forma incuneato TU-1 sopra l'agarosio liquido. Dopo l'indurimento a temperatura ambiente, lasciare riposare agarosio a 4 ° C per 30 minuti prima di rimuovere lo stampo. Stampi Conservare microiniezione a 4 ° C e il riutilizzo.
2. Preparare una aliquota della soluzione per l'iniezione. Effettuare le seguenti operazioni sul ghiaccio. Dispensare 1 ml di plasmide DNA (concentrazione finale di 10 ng / ml), 2 ml di trasposasi mRNA (concentrazione finale 20 ng / ml), 2ml di 10 mg / ml Rodamina B isotiocianato-Destrano, 2 ml di soluzione di 5x Danieau (290 mM NaCl, KCl 3,5 mM, 2 mM MgSO _4, 3 mM Ca (NO _{3) 2,} 25 mM HEPES, pH 7,6) ad una volume finale di 10 ml in acqua priva di nucleasi.
3. Preparare aghi da capillari di vetro borosilicato di 1 mm di diametro contenenti un filamento conduttore interno tirando il capillare in direzioni opposte con una micropipetta estrattore. Utilizzare il seguente programma: riscaldare 530, tirare 200, la velocità e il tempo di 80 150.
4. Riempire un ago con 2 ml di soluzione iniettabile (tenuti in ghiaccio). Evitare bolle ritirando attentamente la punta microloader rilasciando la soluzione nel capillare. Rompere con attenzione la punta dell'ago con una pinza.
5. Regolare la dimensione della goccia con una pompa pneumatica pico. Misurare il diametro goccia / volume (V = 4/3 πr ³⁾ e regolare la dimensione della goccia con un micrometro oculare sotto uno stereoscopio in dimetilpolisilossano. Consigliamo100 micron, corrispondente a 0,5 nl. Questo assicura concentrazioni uniformi e riproducibili per ogni embrione iniettato. Titolare la concentrazione iniettato e regolare per ogni costrutto e plasmide preparazione.
6. Posizionare gli zigoti (Figura 1A) ottenuti da un incrocio di Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 ¹⁵ con Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg ¹⁶ negli stampi della piastra iniezione mediante l'uso di un pastette 3 ml. Nel frattempo, mantenere la punta dell'ago pre preparato iniettabile in dimetilpolisilossano per evitare la soluzione da essiccazione e coagulazione.
7. Iniettare il calo predosata (100 micron corrispondente a 0,5 nl) sotto uno stereoscopio attraverso il corion nel blastodisco ^17, prima della prima fenditura (Figura 1A). L'iniezione in fase unicellulare aumenta il potenziale di una distribuzione uniforme del DNA plasmide e RNA nella massa cellulare sviluppo e la possibilità di trasmissione germinale. Èda notare che l'espressione di costrutti più spesso tende ad essere mosaico.

3. condizionale Trasformazione della pelle delle cellule del 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)

1. Trasferire gli embrioni iniettati nella soluzione 0.3x Danieau e tenerli a 28,5 ° C in un incubatore. Rimuovere uova non fecondate dal piatto in fase sfera ^17. Il co-iniettato Rodamina B isotiocianato-Destrano può essere utilizzato come controllo iniezione sotto uno stereoscopio fluorescente.
2. Embrioni schermo a 24 HPF (ore dopo la fecondazione) per l'espressione cardiaca di eGFP. Continuare a sollevare CMLC: eGFP embrioni di zebrafish positivi fino 72 HPF. Monitorare attentamente la qualità dell'acqua (0.3x Danieau).
3. Rimuovere il corion di quegli embrioni che non sono nati con una pinza a 72 HPF. Attizzare cautela il corion con 1 pinza e tirare a parte utilizzando l'altro. Selezionare embrioni per lysC: espressione DsRed2 utilizzando uno stereoscopio fluorescente.
4. Aggiungere 10 ml di 10 mMmagazzino di (Z) -4-Hydroxytamoxifen a 20 ml di soluzione 0.3x Danieau (concentrazione finale di 5 mM). Utilizzare l'induzione soluzione di 4-OHT per un piatto standard di Petri (90 mm) su un lotto di 40-60 embrioni.
5. Trasferire gli embrioni in una nuova capsula Petri contenente 20 ml di fresco induzione soluzione. 4-OHT deve essere immagazzinato e manipolato al buio. I primi segni di espressione possono essere rilevati 2 ore di inizio induzione posta. L'induzione-passo può essere esteso durante la notte, tenendo presente che cellula ospite iniziale: interazioni delle cellule preneoplastiche può già avvenire poche ore dopo il trattamento.

4. Montaggio e Immagini dal vivo di Zebrafish larve

1. Preparare una capsula di Petri 60 millimetri introducendo un foro con un diametro di 18-20 mm. Utilizzare grasso al silicone per alto vuoto per coprire e sigillare il foro sul fondo esterno della piastra di Petri con un vetro di copertura 25 mm (Figura 1B).
2. Preparare 1% a basso punto di fusione (LMP) agarosio. Mantenere una provetta da 1,5 mlLMP di agarosio a 37 ° C su una piastra riscaldante.
3. Preselezione Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) larve di cellule della pelle verde fluorescente e di espressione delle cellule DsRed2 positivo innata immune, sotto uno stereoscopio fluorescente. Anestetizzare larve mediante aggiunta di 1 ml di 0,4% tricaine ¹⁸ alla soluzione di induzione 20 ml.
4. Trasferire le larve prescelto con un pastette nel agarosio LMP liquido. Lasciate che le larve affondare nel LMP agarosio e trasferirli sul vetro di copertura (Figura 1B). Orientare gli embrioni sotto uno stereoscopio. Le larve deve essere collocato direttamente sul vetro per ridurre la distanza di lavoro (fino a 6 larve).
5. Coprire il agarosio LMP con la soluzione contenente tricaine induzione dopo l'indurimento (Figura 1B freccia).
6. Immagine le larve incorporato utilizzando un fluorescente invertita, laser-scanning o disco rotante microscopio confocale. Utilizzare un 40X o 63Xobiettiva di obiettivi con distanze di lavoro abilitazione fuoco attraverso l'intero larve.

Risultati

Zigoti di un incrocio tra Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 e Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg stati raccolti 10-15 minuti dopo la fecondazione (Figura 1A) per ottenere 1 embrioni cellule stadio. Dopo l'iniezione gli embrioni sono state sollevate fino a 3 dpf, prima di induzione con 4 OHT e montaggio per l'imaging dal vivo (Figura 1B). 2-6 hr alberino induzione montati gli embrioni sono stati collocati sia sotto un microscopio a fluorescenza invertito (Figura 2A) o un microscopio invertito confocale (Figura 2B-C) e ripreso per 2-3 ore con intervalli di 1,5 min. Cellule superficiali preneoplastiche possono essere identificati dai loro morfologia più arrotondata rispetto ai cheratinociti normali, nonché l'emissione fluorescente verde della membrana localizzata eGFP-HRAS ^G12V. Aree di immagini sono stati selezionati per la co-localizzazione delle cellule cutanee preneoplastiche e cellule immunitarie innate (figura 2A punta di freccia). A causa della mig veloceprocesso razione dei neutrofili sono stati scelti gli intervalli time-lapse di essere tra 1-1,5 min con dimensioni di fase Z dello stack di 0,7-1,7 micron per ottenere proiezioni intensità massima (Figura 2, Video 1). Vi è una vasta gamma di comportamenti che possono essere osservati mentre l'imaging dal vivo: neutrofili migrano accanto e sotto le cellule preneoplastiche (Figura 2C, video 1), formano contatti diretti alle cellule (Figura 2B e C), rimuovere i resti di cellule preneoplastiche che subiscono apoptosi (Video 1), o attivamente fagocitare parti di cellule preneoplastiche (non mostrati). Per catturare l'intero spettro di interazioni, si consiglia di seguire i loro comportamenti per time-lapse immagini dal vivo.

Figura 1: Schema per la trasformazione delle cellule della pelle condizionale in larve di zebrafish. (A) L'immagine di uno zigote di Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) zebrafish a 10 minuti dopo la fecondazione (MPF). L'uovo fecondato è circondato dal corion (freccia). Il sito per l'iniezione è la blastodisco (asterisco), formata da torrenti citoplasmatici del tuorlo (freccia) che definisce il polo animale dell'embrione. (B) Montaggio di larve di zebrafish. 60 millimetri piastra di Petri con un 18-20 mm foro (freccia) che è sigillato da un vetro di copertura 25 millimetri. Le larve zebrafish sono immobilizzato e montato sul vetro di copertura da 1% agarosio LMP. Soluzione 0.3x Danieau (freccia) contenente 5 mM 4-OHT viene utilizzato per coprire l'agarosio LMP. (C) 4-OHT trasformazioni di cellule cutanee superficiali. (A) trasversale profilo sezione schematica della pelle larvale indotto. La pelle embrionale e larvale è composto da due strati di cellule epiteliali, uno strato di cellule superficiali ed uno strato di cellule basali cheratinociti che sono collegati alla membrana basale sottostante (BM). (B) espressione transiente sistema to indurre un clone di cellule preneoplastiche tra le cellule superficiali della cute. KalTA4-ER ^T2 è espresso esclusivamente nello strato più esterno della pelle guidato dal promotore krt4 (giallo). Espressione Mosaico di KalTA4-ER ^T2 attiva UAS (blu) eGFP-HRAS espressione ^G12V controllata in cellule superficiali, portando ad un clone di cellule preneoplastiche (verde). (D) Schema del sistema di espressione transiente. (A) cassette Tol2 del pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP vettore di espressione usata transitoriamente (b) induzione condizionale dell'espressione attivatore trascrizionale.. KalTA4 è fuso al-ligando dominio mutante del recettore estrogeno umano α (ER ^T2), che si lega specificamente a 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT). In assenza di 4-OHT ER ^T2 è vincolato nel citoplasma da proteine ​​da shock termico (Hsp90). Al 4-OHT vincolante Hsp90 dissocia, permettendo una traslocazione nucleare di KalTA4-ER^T2 e successiva attivazione degli UAS controllati espressione eGFP-HRAS ^G12V. Scala bar A = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 2: Immagini dal vivo di interazione delle cellule immunitarie preneoplastiche e innata. (AC) Le immagini di un 4 DPF Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embrione, che è stato iniettato con pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP e trasposasi mRNA in uno stadio di cellule. Le immagini sono state scattate dopo 6 ore di induzione a 4-OHT (A) Vista laterale della regione tailfin a 6 ore dopo il trattamento, mostrando macchie di eGFP-HRAS ^G12V esprimono cellule della pelle (freccia), e lysC:. DsRed2 + neutrofili (freccia). (BC) Immagini rappresentative taken da un filmato confocale time-lapse, mostrando neutrofili (rosso) interazioni con le cellule della pelle eGFP-HRAS ^G12V esprimono (verde). (B) Una cellula preneoplastiche forma una breve proroga filopodial con il contatto con neutrofili (freccia). (C) neutrofili (rosso) è in stretto contatto con un clone di cellule della pelle preneoplastiche (verde). Bar Scala in A = 100 micron; B / C = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Video 1 : Time-lapse immagini dal vivo di interazione delle cellule immunitarie preneoplastiche e innata. Time-lapse di un 4 DPF Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embrione, iniettato con pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP e trasposasi mRNA in uno stadio di cellule. Confocale filmato time-lapse 6-9 hoUrs dopo 4-OHT induzione mostrando lysC: DsRed2 + neutrofili (rosso) interazioni con le cellule della pelle eGFP-HRAS ^G12V esprimono (verde). I neutrofili migrano accanto e sotto le cellule preneoplastiche e rimuovere i resti di una cellula preneoplastiche che subisce l'apoptosi. Intervalli Time-lapse da 1,5 min oltre 3 ore con dimensioni di passo Z dello stack di 1.3 micron.

Discussione

Durante l'embriogenesi e sviluppo larvale, la pelle zebrafish embrione è composto da due strati epiteliali, lo strato superficiale chiamato periderm e uno strato di cheratinociti basali che sono attaccati alla membrana basale sottostante ¹⁹ (Figura 1C, a). Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice per indurre condizionale trasformazione preneoplastiche cellule nello strato superficiale della pelle di larve di zebrafish, e permette per la successiva analisi interazione con le cellule immunitarie innate di immagini dal vivo. Le metodologie di base nel nostro protocollo seguono tecniche di zebrafish consolidate ^9-13, e il nostro protocollo possono essere facilmente adattati e modificati.

Il promotore krt4 ⁵ qui utilizzato spinge espressione ^T2 KalTA4-ER specificamente nello strato più esterno della pelle (Figura 1C, b). Tuttavia, l'modulare MultiSite Gatewayclonazione strategia utilizzata per generare la krt4: KalTA4-ER ^T2 costrutto (Figura 1D, a), prevede la possibilità di clonare qualsiasi promotore di interesse davanti KalTA4-ER ^T2 in un unico passaggio clonazione. Un adattamento del metodo presentato qui è quindi possibile per la maggior parte dei tessuti durante l'embriogenesi e stadi larvali. La disponibilità di sequenze promotore è presente il fattore limitante. Inoltre, quasi ogni gene di interesse clonato dietro un UAS può essere condizionale sovraespresso a diversi stadi di sviluppo mediante la espressione KalTA4-ER ^T2 spaziale e controllata temporalmente. Pertanto, il nostro protocollo può essere adattato per eseguire l'espressione genica condizionale in qualsiasi tessuto di interesse nelle larve zebrafish, in maniera mosaico. Si può anche ottimizzare l'impostazione per vivere immagine tessuti più profondi, come il fegato o del pancreas microscopio.

Abbiamo descritto una sola applicazione che utilizza il protocollo cheRé, allo stesso modo, si può iperespressione altri modulatori infiammazione utilizzare questo protocollo per studiare la regolazione delle risposte infiammatorie, come si può facilmente neutrofili immagine dal vivo e cambiamenti comportamentali macrofagi seguenti l'induzione e l'arresto nella espressione di un modulatore infiammatorio candidato. Inoltre, il protocollo adatto sarebbe anche utile per coloro che vogliono seguire il movimento delle cellule e il cambiamento del comportamento durante le diverse fasi della morfogenesi dei tessuti e la formazione di organi e, infine, l'immagine dal vivo l'interazione delle interazioni cellule immunitarie innate con altre linee cellulari specifici che può essere mirata dal sistema di espressione ^T2 / UAS KalTA4-ER inducibile.

Abbiamo usato il vettore pDestTol2CG dal Tol2kit zebrafish ^{20 - 23} che contiene un cmlc2: eGFP-pA cassetta (figura 1D, a) che consente la successiva selezione degli embrioni da verdi fluorescenti cuori positivi come selection marcatore ²⁰ che semplifica il processo di screening F0. Un inserimento stabile del trasposone affiancato gene di interesse nel genoma è facilitato dalla co-iniezione del DNA plasmidico insieme trasposasi mRNA. La preparazione di DNA plasmidico e l'mRNA trasposasi per microiniezione segue protocolli standard. Tuttavia, una riuscita integrazione del costrutto nel genoma dipende dalla trasposizione-based Tol2 ^14. Ciò evidenzia la particolare attenzione da pagare per lavorare sul ghiaccio in condizioni sterili per evitare contaminazioni e degradazioni da RNasi e DNasi. Microiniezione in una delle cellule di embrioni stadio è una tecnica robusta e consolidata per il guadagno e la perdita di studi di funzionalità in ^9,10 zebrafish. Anche se una persona ben addestrato può facilmente iniettare nel tuorlo di oltre 1.000 embrioni in 1 ora, l'iniezione nel blastodisco (Figura 1A, asterisco) richiede più esperienza e formazione. Critical durante questa procedura is la manipolazione dell'ago. L'ago deve essere molto sottile per penetrare la cella senza danni e deve pertanto essere rotto solo sulla sua punta estrema. È importante controllare periodicamente e misurare la dimensione della goccia durante l'iniezione di garantire un'iniezione uniforme in ogni embrione. Ben curate, l'ago può essere usato per ruotare l'embrione. Questo è spesso necessario per trovare il blastodisco e l'angolo di penetrazione ottimale.

La concentrazione di DNA e mRNA trasposasi utilizzato per l'iniezione quasi certamente influenza l'efficienza di espressione. Dosi più elevate possono portare ad un aumento della percentuale di cellule che esprimono il transgene ma con maggiori concentrazioni di DNA (> 50 ng / ml) e trasposasi mRNA (> 100 ng / ml), anche la possibilità di effetti tossici tra embrioni iniettati si pone. Noi preferiamo l'uso di 10 ng / ml DNA e 20 ng / ml trasposasi mRNA iniettabile, che corrisponde a 50 pg di DNA plasmidico e 100 pg di RNA per emb iniettatoryo. 100% degli embrioni iniettati con queste concentrazioni si sviluppano normalmente, e tra il 40-70% mostra eGFP-HRAS espressione ^G12V, dopo induzione 4-OHT, a seconda dell'efficienza iniezione nella singola cella. Tra embrioni positivi vengono normalmente troviamo circa il 30% che ha 1-10 cloni, 40% che ha 10-50 cloni e 30% con più di 50 cloni. Grazie ai nostri obiettivi di ricerca, privilegiamo l'uso di embrioni con un minor numero di cloni che esprimono eGFP-HRAS ^G12V. Selezioniamo embrioni con 10-50 cloni per i nostri esperimenti transitori. Per la generazione di pesci transgenici fondatore, si consiglia di selezionare solo gli embrioni sia con il marcatore cardiaco positivo eGFP e un gran numero di eGFP-HRAS ^G12V cloni positivi nelle loro epidermide.

(Z) -4-Hydroxytamoxifen subisce un cis-trans (EZ) interconversione quando esposto alla luce ^24. Si è constatato che l'isomero cis (E) è 100x meno anti-estrogenica rispetto al suo omologo trans ^25,26. Exposure alla luce deve quindi essere evitato. La soluzione madre 4-OHT disciolto in etanolo può essere conservato a -20 ° C al buio per un periodo di tempo lungo. Si consiglia l'uso di una scatola per proteggere le capsule di Petri dalla luce durante l'induzione del gene bersaglio all'interno dell'incubatrice e trasporti. Anche se l'area di imaging è molto piccolo e l'esposizione di 4-OHT alla luce UV è ridotta al minimo, un continuo scambio di soluzione induzione ogni 2 ore, mentre l'imaging in periodi di tempo più lunghi si raccomanda di mantenere i livelli massimi di espressione. 4-OHT permeabilizes efficace attraverso il corion e gli strati più esterni della pelle durante l'embriogenesi zebrafish, quindi può indurre l'espressione genica molto rapidamente. Possiamo facilmente osservare emissione eGFP dopo 2 ore di induzione ed è stato riferito che i primi segni di espressione target-gene possono essere osservati dopo 1 ora e plateau dopo 3 ore di trattamento ^8. Le differenze possono essere dovute al diverso promotore utilizzato nel nostro studio. Come è stato previously ha riferito che il 4-OHT trattamento dipende dalla dose ^8,27, abbiamo scelto di utilizzare la più alta concentrazione segnalato 5 micron di raggiungere livelli di espressione robusti e riproducibili nel nostro approccio transitoria. Questo dovrebbe garantire che tutte le cellule che trasportano il transgene saranno indurre l'espressione del gene bersaglio.

Si deve tenere conto che l'approccio transitorio qui presentato potrebbe portare a diversi livelli di espressione per la possibilità di eventi multipli e casuali inserimento genoma. Inoltre, l'uso del mRNA trasposasi in background transgenico Tol2 di Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 può portare a possibili trasposizioni del transgene UAS che potrebbe provocare silenziamento genico o interruzione. Tuttavia, poiché il metodo qui presentato rappresenta un approccio transitorio, la pre-selezione di embrioni successive a iniezione è obbligatoria. Molti laboratori hanno scoperto che le sequenze SUP tendono ad essere messa a tacere nella prole transgenica, quindi inproietta il pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP costruire in Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embrioni potrebbe non essere efficiente come l'iniezione di un UAS costrutto in Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ) embrioni. L'uso della scuderia linea transgenica Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) attraversato con Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 consentirà un monitoraggio preciso dei / off sulla cinetica del tempo-dose dipendente l'attivazione del gene 4-OHT .

Un punto critico durante il montaggio delle larve è il trasferimento nella agarosio LMP e sul vetro di copertura (Figura 1B). C'è solo un breve lasso di tempo per il liquido temperatura agarosio LMP che consente un trasferimento sicuro e l'orientamento delle larve preselezionato senza danneggiare il pesce da uno shock termico o indurimento del gel. Le larve deve essere orientato direttamente sul vetro di copertura per ridurre la distanza di lavoro per la successiva analy microscopicasis. Poiché questo può essere un fattore limitante durante microscopia scelta degli obiettivi appropriati è obbligatoria. Una volta montato, la larva può essere mantenuta da ore a giorni.

La condizionalità del sistema modello presentato qui permette per la trasformazione ripetuto da 4-OHT attivazione del transgene. Il sistema di espressione dipende dalla presenza di 4-OHT e quindi espressione KalTA4 controllata di un gene di interesse è reversibile (Figura 1D, b). In contrasto con il sistema Cre-ER ^T2 / Lox, che facilita un evento irreversibile ricombinazione genomica ^28, KalTA4-ER ^T2 / UAS può essere attivato e disattivato dopo l'aggiunta o la rimozione di 4-OHT e questo potenziale di induzione ripetuta è un vantaggio la tecnica sul sistema ^T2 / Lox Cre-ER. Tuttavia, la necessità di livelli costanti di 4-OHT è una limitazione se l'esperimento deve essere prolungata da giorni a settimane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(Z)-4-idrossitamoxifene	Sigma Aldrich	H7904	diluire in etanolo e conservare al buio a -20  ° C
20X Obiettivo	Zeiss		20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Obiettivo	Zeiss		40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Obiettivo	Zeiss		63X/1.4 Olio Ph3 ∞/0.17
BamHI	New England Biolabs	R0136S
Microscopio confocale	Zeiss		LSM 510 META
Cover vetro	VWR	631-0171	Diametro 25 mm
Dimetilpolisilossano	Sigma Aldrich	DMPSV
Dow Corning grasso siliconico ad alto vuoto	Sigma Aldrich	MKBL4135V
Estrattore per micropipette P-97 fiammeggiante/marrone	Sutter Instruments Co.	Programma P-97	: calore 530, trazione 200, velocità 80 e tempo 150
Stereoscopio fluorescente	Leica		M205 FA
Kwik-Fill Capillari in vetro brosilicato	World Precision Instruments	1B100F-4
Stampo per microiniezione TU-1	Adaptive Science Tools	TU-1
Punta per microloader	Eppendorf	930001007
Microscopio	Zeiss		Axiovert 200
mMESSAGGIO mMACHINE Kit	Ambion	AM1348
Acqua senza nucleasi	Invitrogen	AM9937
Pompa pico pneumatica	World Precision Instruments	PV820
Pompa pico pneumatica	Warner Instruments	PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2:eGFP			Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/Università di Edimburgo
QIAprep Spin Miniprep Kit	Quiagen	27106
Isotiocianato di rodamina B-destrano	Sigma Aldrich	R8881	10 mg/μ l in acqua
Stereoscopio	Leica		M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg			BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006			PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222	Sigma Aldrich	A5040
Agarosio ultrapuro	Invitrogen	16500-100
Agarosio a basso punto di fusione ultrapuro	Invitrogen	16520-050
Fenolo ultrapuro : Cloroformio : Alcool isoamilico	Invitrogen	15593-031	25:24:1, v/v