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Articolo metodologico

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

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DOI:

10.3791/52114

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5 novembre 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

In questo articolo

Sommario

PAD4 è un enzima responsabile della conversione della peptidil-arginina in peptidil-citrullina. La disregolazione di PAD4 è stata implicata in numerose malattie umane. Viene descritto un saggio PAD4 basato sulla fluorescenza facile e compatibile ad alto rendimento.

Abstract

Le modifiche post-traduzionali possono portare a stati funzionali proteici alterati aumentando le variazioni covalenti sulle catene laterali di molti substrati proteici. Le code istoniche rappresentano uno dei tratti più pesantemente modificati all'interno di tutte le proteine umane. È stato dimostrato che la peptidil-arginina deiminasi 4 (PAD4) converte i residui di arginina nel residuo di citrullina non geneticamente codificato. Pochi saggi descritti fino ad oggi sono stati operativamente facili con una sensibilità soddisfacente. Pertanto, la mancanza di dosaggi adeguati ha probabilmente contribuito all'assenza di potenti inibitori non covalenti di PAD4. In questo articolo viene descritto un nuovo test basato sulla fluorescenza che consente il monitoraggio dell'attività di PAD4. Un analogo del substrato pro-fluorescente è stato progettato per collegare l'attività enzimatica di PAD4 alla liberazione della fluorescenza dopo l'aggiunta della proteasi tripsina. È stato dimostrato che il test è compatibile con le condizioni di screening ad alto rendimento e ha un forte rapporto segnale/rumore. Inoltre, il saggio può essere eseguito anche con lisati cellulari grezzi contenenti PAD4 sovraespresso.

Introduzione

Un gran numero di proteine ​​di mammifero sono fortemente modificato dall'azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine ​​del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine ​​1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine ​​può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell'espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine ​​umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti 4. Istoni sono una famiglia di proteine ​​strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) 5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination 8.

Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. 9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine ​​cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l'unico membro di questa famiglia di proteine ​​note per essere localizzato all'interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare 11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete 14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l'attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine ​​istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l'incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche 15,16.

Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l'espressione aberrante di PAD4 è associato con l'insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e 17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide 18. Analogamente, l'attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell'ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei 19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l'oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina 22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico 17,24,25. Come una prova di principio studio, l'esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l'apoptosi e arresto del ciclo cellulare 26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi 27. Piuttosto notevole, l'inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l'uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate.

L'uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti 28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina 27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l'attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica 31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test 32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina 33, e coppia l'attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo 34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare 32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l'attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.

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Protocollo

1. PAD4 Trasformazione, Espressione e purificazione

  1. Per PAD4 trasformazione, trasformare il plasmide contenente pGEX PAD4 GST fusione in chimicamente competente E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule per l'espressione di proteine ​​utilizzando la seguente procedura. Preparare chimicamente competente (cloruro di calcio) E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule secondo protocolli standard.
    1. Scongelare 50 ml di preparato in precedenza BL21 chimicamente competente (DE3) celle su ghiaccio e mescolare con 1 ml di plasmide pGEX contenente gene PAD4 in una provetta da 5 ml. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min, agitando delicatamente ogni 2 min.
    2. Heat Shock cellule collocando la miscela in un bagno d'acqua a 42 ° per 40 sec. Porre immediatamente la miscela di cellule-plasmide indietro su ghiaccio per 2 minuti per permettere alle cellule di recuperare. Aggiungere 1 ml di brodo LB sterile al composto e mettere in ghiaccio per 1 min.
    3. Incubare il calore cellule scioccato a 37 ° C, agitazione a 250 rpm per 1hr. Pipettare 75 ml di cellule trasformate su una piastra di agar ampicillina resistenti e incubare a 37 ° C per 15 h. Piastra Conservare a 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Raccogliere 1 colonia di (DE3) cellule BL21 dalla piastra di agar ampicillina e posto in 5 ml di LB contenente ampicillina 1x. Posto in incubatrice e agitare O / N a 37 ° C.
    2. Trasferire i 5 ml di LB (avviamento) in 1 L di sterile LB contenente ampicillina triidrato 1x (MW 403,45 g / mol). Posizionare la crescita in un incubatore agitazione 37 ° C. Monitorare l'OD 600 della crescita. Quando la crescita raggiunge un diametro esterno 600 di 0,3, muovere la crescita in 16 ° C agitazione incubatore.
    3. Dopo aver raggiunto un OD 600 di 0,6, induce le cellule con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Consentono alle cellule siano scossi per 15 ore a 16 ° C.
    4. Celle di raccolta per centrifugazione a 4000 xg per 20 minuti a 0 ° C. Eliminare il surnatante e conservare pellet a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificazione
    1. Risospendere il pellet contenente il PAD4 espresso in BL21 (DE3) cellule in tampone 50 mM NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119.98 g / mol), imidazolo 10 mM (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fluoruro phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Dopo sonicazione, centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Eliminare il surnatante e riporlo. Batch il surnatante con il glutatione (GSH) agarosio per 30 minuti a RT.
    3. Scolare il surnatante dal GST perline / colonna per gravità. Lavare perline con 4 x 25 ml di 1x PBS (tampone fosfato, pH = 8.0) a temperatura ambiente.
    4. Eluire PAD4 con 2 x 10 ml di tampone di eluizione, Tris 50 mM (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutatione (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concentrato PAD4 con 100k MW cut-oprovette da centrifuga ff e centrifugare a 4000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Aliquota di proteine ​​in 200 volumi in microlitri 1,0 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C.

2. Preparare soluzioni madre di buffer

  1. Pesare il cloruro di sodio (NaCl, MW 58.44 g / mol) e preparare una soluzione 2 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  2. Pesare Tris (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparare una soluzione 2 M, pH = 8,0. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  3. Pesare diidrato cloruro di calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) e preparare una soluzione 500 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  4. Pesare Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparare una soluzione 200 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C.
  5. Pesare ditiotreitolo (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparare una soluzione 1 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C.
  6. Preparareuna soluzione allo 0,5% di Triton X-100.
  7. Pesare etilendiamminotetraacetico (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparare una soluzione 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  8. Pesare Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- metilcumarina cloridrato (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparare una soluzione 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO).

3. PAD4 test a 37 ° C

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2 e 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20° C. Questo sarà soluzione D.
  5. Ottenere una piastra a 96 pozzetti e designare un numero di pozzi per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4).
  6. Pipettare 160 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 160 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Incubare per 15 minuti a 37 ° C.
  7. Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare a 37 ° C per 45 min.
  8. Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l'altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipetta 10 ml di soluzione di D. Incubare per 10 min a 37 ° C.
  9. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

4. PAD4 test a temperatura ambiente

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione di 50 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 50 micron sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di Na 100 mMCl, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione D.
  5. Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzetti per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4).
  6. Pipettare 25 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT.
  7. Pipettare 25 ml di soluzione C in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  8. Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l'altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipette 10 ml della soluzione D. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  9. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

5. PAD4 Andamento temporale saggi a 37 ° C e RT

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C.
  4. Ottenere 2 piastre a 96 pozzetti e pipetta 160 ml di soluzione di B in # quantità di pozzi (# di pozzi dipenderà da quanti punti di tempo).
  5. Incubare una piastra a 96 pozzetti a 37 ° C. Incubare l'altra piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente.
  6. Semeette 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti in entrambe le piastre a 96 pozzetti e subito Pipettare 10 ml di Soluzione C nelle t = 0 min pozzi. Continuare ad aggiungere 10 ml di soluzione C in punti temporali specifici prima di aver spento tutti i pozzetti.
  7. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

6. PAD4 Inibizione test a temperatura ambiente

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 83 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 83 mM sarà Soluzione A.
  2. Pesare Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparare una soluzione madre a 100 micron. Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thè sarà Soluzione D.
  5. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà Soluzione E.
  6. Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzi per i controlli (non PAD4), pozzi di prova (+ PAD4), e pozzi di inibizione (PAD4 + Cl-ammidinici).
  7. Pipettare 25 ml di soluzione C in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di D nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT.
  8. Pipettare 10 ml di soluzione B nei pozzetti di inibizione e incubare per 20 minuti a Rte.
  9. Pipettare 15 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  10. Pipettare 10 ml di soluzione E a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  11. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

7. greggio lisato Assaya RT

  1. Dopo la raccolta delle cellule dal PAD4 1 L di crescita, risospendere le cellule in 10 ml di 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0.
  2. Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Concentrare il surnatante limpido per la metà del volume mediante centrifugazione a 4000 rpm a 4 ° C con 100k MW provette di cut-off.
  3. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 250 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 250 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  4. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, e 2 TCEP mM (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  5. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C.
  6. Ottenere una piastra da 384 pozzetti nero e designmangiato pozzetti per i controlli (senza lisato cellulare) e le fonti di prova (+ lisato cellulare).
  7. Pipettare 100 ml di soluzione B in tutti i pozzetti e le pipette 60 ml di lisato cellulare nei pozzetti di prova. Incubare per 20 minuti a RT.
  8. Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  9. Pipettare 10 ml di soluzione C a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  10. Ottenere una fluorescenza lettura sul lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

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Risultati

Inizialmente, è stato dimostrato che ZRcoum può riferire sull'attività di PAD4 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Wells sono stati incubati con il substrato ZRcoum e in presenza / assenza di PAD4. Dopo un periodo di incubazione di 45 min a 37 ° C, la fluorescenza è stata misurata con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Come previsto, i livelli di fluorescenza sono rimasti bassi come fluoroforo entro ZRcoum (o il citrullinato ZRcoum)<...

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Discussione

In questo articolo, è stato sviluppato con successo un test basato sulla fluorescenza che monitora l'attività di PAD4. Il test ha dimostrato di essere incredibilmente robusto in una serie di condizioni ad alto rendimento ed è anche compatibile con i lisati a cellule intere37.

L'affinità tra le proteine istoniche e i filamenti di DNA che le circondano si allenta a causa della neutralizzazione della carica positiva sulla catena laterale dell'arginina dopo citrullinazione. Si è ipotizz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto Start-up della Lehigh University. Ringraziamo il Dr. Walter Fast per aver fornito il plasmide GST-PAD4 per l'espressione proteica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LB Brodo, Miller (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KG<a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicillina Triidrato (Bianco sporco in polvere), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
Isopropiltiagalattonsi (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
Tutti i sali tampone Fisher ScientificPuò acquistare da Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; and so on.
Protino Glutatione (GSH) agarosioMachery-Nagel745500.10Negozio a 4 ° C; http://www.mn-net.com/
Cloroammidina Cayman Chemical 10599Conservare a -20 gradi C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon Piastre MicroWell (96 e 384)Acquisto da Corning; Software per
Tecan Tecan Infinite 200 / Tecan i-controlwww.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com
< lettore di micropiastre Sigma-Aldrich

Riferimenti

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