Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.
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Articolo metodologico
Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema di co-coltura OP9/OP9-DL1 è diventato un metodo consolidato per derivare tipi differenziati di cellule del sangue da progenitori embrionali ed ematopoietici sia di origine murina che umana. Ora è utilizzato per affrontare una crescente varietà di complesse questioni genetiche, cellulari e molecolari relative all'emopoiesi ed è all'avanguardia degli sforzi per tradurre questi risultati di base in applicazioni terapeutiche. Le procedure sono semplici e producono regolarmente risultati solidi. Tuttavia, il successo della differenziazione ematopoietica in vitro richiede un'attenzione particolare ai dettagli del mantenimento dei reagenti e delle colture cellulari. Inoltre, il protocollo presenta passaggi sensibili alla tecnica che, sebbene non difficili, richiedono cura e pratica per essere padroneggiati. Qui ci concentriamo sulle procedure per la differenziazione dei linfociti T dalle cellule staminali embrionali di topo (mESC). Forniamo un protocollo dettagliato con discussioni sui passaggi e i parametri critici che consentono una differenziazione cellulare riproducibile e robusta in vitro. È nell'interesse del settore prendere in considerazione una più ampia adozione di questa tecnologia, in quanto ha il potenziale per ridurre l'uso di animali, abbassare i costi e abbreviare i tempi della sperimentazione di base e traslazionale.
Introduzione
È stato istituito un sistema di coltura cellulare in cui le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono differenziate in cellule T in vitro.1 Questo sistema sfrutta la capacità della segnalazione di Notch di guidare il differenziamento delle cellule T. 2 La linea cellulare OP9-DL1 è stata creata trasducendole cellule OP9 3 derivate dal midollo osseo con un ligando Notch, Delta-like 1 (DL1). 4 L'attivazione della cascata di segnalazione Notch in vitro facilita lo sviluppo delle cellule T escludendo altre linee cellulari. Con l'inclusione di citochine appropriate, questo sistema fornisce un "microambient....
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Protocollo
1 Preparazione della Cultura Media, Citochine e piatti gelatinizzato
- Preparare supporti cellule ES utilizzando Modifica Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio e piruvato di sodio. Aggiungere 20% ESC Qualificato Fetal Bovine Serum (FBS), 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% HEPES Buffer, 1% non-aminoacidi essenziali, gentamicina 0,1% (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 mM) β-mercaptoetanolo. Sterilizzare supporti cellule ES per filtrazione.
- Preparare supporti OP9 facendo 1 L di Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) da polvere secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20% di siero fetale bovino (FBS) e 1%....
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Risultati
Quando coltivate su MEF, in presenza di LIF, mESCs possono essere mantenuti in uno stato indifferenziato. In condizioni ideali, appaiono come colonie compatti di cellule circondate da un alone lucido in microscopia a contrasto di fase (Figura 1). Tali colture devono essere monitorati quotidianamente. In base alla confluenza delle cellule, i media possono essere cambiati o cellule possono essere divise. Limitrofe colonie Mesc non dovrebbero venire al punto di contatto uno con l'altro. Un normale, sana cu.......
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Discussione
Il sistema OP9-DL1 co-coltura è stata utilizzata per studiare il ruolo dei vari prodotti genici durante lo sviluppo di tipi di cellule del sangue da cellule staminali. 8,12,13 Ha anche dimostrato un modello efficace per studiare la funzione del gene DNA normativo durante il differenziamento cellulare. 9,14 Usando questo approccio come alternativa ai modelli interi mouse possono produrre un notevole risparmio di tempo e costi di esperimenti che affrontano molte questioni fondamentali in ematopoiesi........
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Joon Kim per l'assistenza esperta di citometria a flusso. La ricerca nei laboratori degli autori è supportata dal programma SCORE del National Institutes of Health (sovvenzione SC1-GM095402 a B.D.O) e dal Canadian Institutes of Health Research (a J.C.Z.P.). J.C.Z.P. è supportato da una cattedra di ricerca canadese in immunologia dello sviluppo. L'infrastruttura di ricerca biomedica dell'Hunter College è supportata in parte dal programma NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) tramite sovvenzioni MD007599. Ringraziamo inoltre il New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) per il suo sostegno all'avvio della ricerca sulle cellule staminali....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Cellule staminali qualificate FBS | Gemini | 100-125 | |
| Penicillina/Streptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanil L-glutammina | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES tampone | Millipore | TMS-003-C | |
| Aminoacidi non essenziali | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicina Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoetanolo (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Unità filtro | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μ m Membrana PES |
| Grado di coltura cellulare Acqua | Corning | 25-055-CM& | |
| alpha;-MEM | Tecnologie per la vita | 12000-022 | Polvere, ricostituita secondo le raccomandazioni del produttore |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | È richiesto il collaudo dei singoli lotti |
| Dimetilsolfossido | Sigma | D2650 | |
| Ligando umano ricombinante Flt-3 | R& D Systems | 308-FK | |
| Murina Ricombinante IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| acqua Utrapure con lo 0,1% di gelatina | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs trattati con mitomicina C | Millipore | PMEF-CF | Qualsiasi MEF ad arresto mitotico può essere utilizzato |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Filtro cellulare (40 μ m) | Fisher | 22363547 | |
| Piatto per coltura tissutale 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-pozzetto | BD Falcon | 353046 | |
| provette per microcentrifuga da 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Provette per centrifuga da 15 ml | BD Falcon | 352096 | |
| Provette da centrifuga da 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| polistirene da 5 ml a fondo tondo con tappo per filtro a celle | BD Falcon | 352235 | Provette per FACS |
| Celle ES R1 | Celle ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 | Le cellule possono essere ottenute dal Riken Laboratory Cell Repository (Giappone). | ||
| Celle OP9-DL1 | Le celle possono essere richieste allo Zú ñ iga-Pflü laboratorio cker. | ||
| Software FlowJo | Nel | i citometri | |
Riferimenti
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notc....
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Ristampe e permessi
