È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo

10.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 ottobre 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.

Abstract

Il sistema di co-coltura OP9/OP9-DL1 è diventato un metodo consolidato per derivare tipi differenziati di cellule del sangue da progenitori embrionali ed ematopoietici sia di origine murina che umana. Ora è utilizzato per affrontare una crescente varietà di complesse questioni genetiche, cellulari e molecolari relative all'emopoiesi ed è all'avanguardia degli sforzi per tradurre questi risultati di base in applicazioni terapeutiche. Le procedure sono semplici e producono regolarmente risultati solidi. Tuttavia, il successo della differenziazione ematopoietica in vitro richiede un'attenzione particolare ai dettagli del mantenimento dei reagenti e delle colture cellulari. Inoltre, il protocollo presenta passaggi sensibili alla tecnica che, sebbene non difficili, richiedono cura e pratica per essere padroneggiati. Qui ci concentriamo sulle procedure per la differenziazione dei linfociti T dalle cellule staminali embrionali di topo (mESC). Forniamo un protocollo dettagliato con discussioni sui passaggi e i parametri critici che consentono una differenziazione cellulare riproducibile e robusta in vitro. È nell'interesse del settore prendere in considerazione una più ampia adozione di questa tecnologia, in quanto ha il potenziale per ridurre l'uso di animali, abbassare i costi e abbreviare i tempi della sperimentazione di base e traslazionale.

Introduzione

È stato istituito un sistema di coltura cellulare in cui le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono differenziate in cellule T in vitro.1 Questo sistema sfrutta la capacità della segnalazione di Notch di guidare il differenziamento delle cellule T. 2 La linea cellulare OP9-DL1 è stata creata trasducendole cellule OP9 3 derivate dal midollo osseo con un ligando Notch, Delta-like 1 (DL1). 4 L'attivazione della cascata di segnalazione Notch in vitro facilita lo sviluppo delle cellule T escludendo altre linee cellulari. Con l'inclusione di citochine appropriate, questo sistema fornisce un "microambiente" di coltura cellulare che supporta l'avanzamento sequenziale della mESC verso le linee di cellule ematopoietiche e, infine, di cellule T. Questo sistema supporta l'identificazione citofluorimetrica delle cellule T nei vari stadi di sviluppo osservati durante la normale ontogenesi delle cellule T nel timo. Per lo studio di questioni selezionate relative allo sviluppo delle cellule T, questa procedura è diventata un'alternativa interessante ai modelli murini interi in vivo 5 e ai metodi di coltura di organi timici fetali in vitro utilizzati per ottenere lo sviluppo di cellule T da precursori ematopoietici derivati da cellule staminali embrionali di topo. 6 Il principale vantaggio del sistema di co-coltura OP9 è che coinvolge tecniche di coltura cellulare standard e semplici e non dipende dall'uso continuo di animali da esperimento.

Seguiamo un protocollo dettagliato e pubblicato in precedenza nei nostri esperimenti che utilizzano questo approccio. 7 Abbiamo utilizzato questa tecnologia per esaminare i prodotti di differenziazione ematopoietica di cloni mESC non manipolati, cloni mESC di alta qualità selezionati a mano per produrre embrioni chimerici8 e cloni ESC trasfettati in modo stabile provenienti direttamente dalla selezione farmacologica. 9 Abbiamo notato che la cinetica temporale della differenziazione iniziale in vitro da mESC a colonie simili a mesodermi in questo modello può essere variabile tra i singoli cloni. Le co-colture mESC-OP9 possono essere valutate visivamente per la progressione verso il mesoderma. Mentre questo di solito viene completato entro il quinto giorno di co-coltura, tra i singoli cloni, il completamento può essere ritardato di uno o due giorni. La formazione quantitativa (~80-90%) del mesoderma deve essere raggiunta prima del trasferimento per ottenere una formazione ottimale di cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) e una robusta linfopoiesi. Pertanto, quando si lavora con più cloni di mESC, è meglio ritardare questo passaggio del "giorno 5" fino a quando tutti i cloni non completano la transizione verso colonie simili a mesodermi. Ciò consente la sincronia del successivo sviluppo tra i cloni dopo il loro trasferimento in condizioni di differenziazione ematopoietica. Tre giorni dopo il passaggio delle formazioni mesodermiche per l'80-90%, le HPC vengono raccolte dai monostrati di OP9. Le HPC possono essere seminate su nuove cellule OP9 per consentire la differenziazione di linee cellulari monocitiche, eritroidi e B. In alternativa, le HPC possono essere seminate su cellule OP9-DL1 e guidate verso lo sviluppo di cellule T. Tutte le colture di differenziazione in vitro vengono fornite con Flt-3L a partire dal giorno 5, con un'ulteriore aggiunta di IL-7 a partire dal giorno 8. Le analisi di citometria a flusso eseguite in vari momenti durante l'esperimento consentono di monitorare i progressi attraverso le fasi e i lignaggi della differenziazione ematopoietica e dello sviluppo delle cellule T. Le cellule T CD4/CD8 doppi positive (DP) iniziano a emergere entro il giorno 16 della co-coltura e sia le cellule DP che le cellule CD8 singole positive (SP) sono abbondanti entro il giorno 20. Il risultato generale e la robustezza della co-cultura dipendono in gran parte dalla capacità di accertare visivamente il completamento dei significativi punti di svolta dello sviluppo che si verificano. Questo protocollo vuole essere una guida per il riconoscimento di queste pietre miliari, nonché degli altri parametri critici, che sono fondamentali per una differenziazione di successo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1 Preparazione della Cultura Media, Citochine e piatti gelatinizzato

  1. Preparare supporti cellule ES utilizzando Modifica Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio e piruvato di sodio. Aggiungere 20% ESC Qualificato Fetal Bovine Serum (FBS), 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% HEPES Buffer, 1% non-aminoacidi essenziali, gentamicina 0,1% (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 mM) β-mercaptoetanolo. Sterilizzare supporti cellule ES per filtrazione.
  2. Preparare supporti OP9 facendo 1 L di Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) da polvere secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Miscelarlo. Sterilizzare per filtrazione in due aliquote da 500 ml.
    NOTA: è consigliato e rischia di produrre una migliore manutenzione delle cellule OP9 e nei risultati di differenziazione in vitro L'uso di supporti a base di polvere. Questo approccio è diventato la nostra procedura standard. Tuttavia, notiamo anche that abbiamo a volte usato liquido pre-fatte α-MEM con un adeguato successo.
  3. Preparare il congelamento dei media con l'aggiunta del 10% dimetilsolfossido (DMSO) al 90% FBS. Agitare delicatamente e sterilizzare per filtrazione. Conservare a 4 ° C.
  4. Preparare 2,000x Flt-3 ligando (10 mg / ml) sciogliendo ricombinante umano Flt-3 ligando (Flt-3L) in mezzi OP9 completo a 10 mcg / ml. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore per quanto riguarda la stabilità e lo stoccaggio.
    NOTA: La stabilità di Flt-3L è breve (1 mese a 4 ° C o 3 mesi a -80 ° C).
  5. Preparare 1,000x IL-7 (1 mg / ml) utilizzando mezzi OP9 completo. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore sulla stabilità e la conservazione (IL-7 è stabile fino a 12 mesi a -80 ° C).
  6. Preparare 1,000x leucemia inibitorio Factor (LIF) (10 mg / ml) da una diluizione 1:10 del 10 7 unità di LIF in supporti cellule ES. Conservare aliquota a 4 ° C. Assicurarsi di annotare la data di scadenza prevista dal fabbricante sulle fiale aliquote.
    NOTA: Il prodotto è stabile in forma concentrata o diluita almeno 18 mesi dalla data di produzione.
  7. Preparare 6 pozzetti gelatinizzati da aggiungere 1,5 ml di 0,1% soluzione di gelatina in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Lasciare piatti nella cappa sterile a temperatura ambiente con coperchi su, permettendo almeno 30 minuti per il rivestimento. I piatti possono anche essere lasciati in un incubatore umidificato durante la notte. Rimuovere eventuali residui di soluzione di gelatina a destra prima semina delle cellule. Non lasciate che la soluzione di gelatina completamente asciugare nel pozzo.

2 Preparazione e manutenzione di cellule di alimentazione e di cellule staminali embrionali di topo (Mesc)

NOTA: Incubare tutte le celle in un umidificata 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2.

  1. Scongelamento fibroblasti embrionali di topo (MEF)
    1. Quick-scongelare una fiala congelata (~ 5 x 10 6 cellule / fiala) di mitomicina C-trattati (o in altro modo mitoticamente arrestato MEF) e trasferirli in una provetta da 15 ml.
    2. Aggiungere 8 ml di mezzi di cellule staminali alle cellule scongelati, in modo goccia a goccia per diluire gradualmente il DMSO dal mezzo congelamento.
    3. Centrifugare le cellule a 400 x g a 4 ° C per 5 min. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di media cellulare ES.
    4. Preparare una provetta da centrifuga da 50 ml con 33 ml di supporti pre-riscaldato cellule ES. Aggiungere 3 ml di MEF risospeso a portare il volume finale di 36 ml.
    5. Distribuire 3 ml del MEF risospeso in ciascun pozzetto di due piastre gelatinizzato 6 pozzetti. Posizionare le piastre in incubatore per almeno sei ore per consentire alle cellule di fissare e sparsi prima della semina i mESCs su di loro. Questi strati alimentatore mitoticamente arrestati potrebbero essere utilizzabili per diversi giorni dopo la semina iniziale, se i loro media viene cambiato ogni 2-3 giorni.
      NOTA: MEF di recente arrestati possono anche essere utilizzati.
    6. MESCs Semina
      1. Quick-scongelare un flaconcino con un clone Mesc congelato nel bagno di 37 ° C l'acqua e preparare le celle come descritto in 2.1.1-2.1.3.
        NOTA: congelare 2 fiale di Mesc da un pozzo confluente di un 6-pozzetti.
      2. Rimuovere i supporti da un pozzetto (per Mesc clone) del 6 pozzetti con monostrati MEF arrestati (preparati nel passaggio 2.1.5) e seminare il 3 ml di mESCs sulla parte superiore del monostrato MEF. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF (10 ng / ml). Piatti Rientro in incubatrice.
    7. ES manutenzione delle cellule e il passaggio tripsina mediata
      NOTA: Modificare supporti quotidiani, o Spalato sulla base di confluenza di Mesc. In modo ottimale, la raccolta e split / re-piastra le cellule a giorni alterni.
      1. Rimuovere i supporti di cellule ES e lavare mESCs con 2 ml di PBS. Rimuovere PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C per 3-5 min.
      2. Raccogliere le cellule trypsinized e trasferirli in una provetta da centrifuga 15 ml. Pipettare vigorosamente la sospensione cellulare per rompere ciuffi di mCES. Aggiungere 2 ml di completo supporto cellula ES alla sospensione cellulare per neutralizzare la tripsina.
      3. Cellule Spin a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml ES supporto cellulare.
      4. Rimuovere i supporti da 6 pozzetti contenenti preparati monostrati MEF arrestati. Aggiungere la quantità appropriata di sospensione cellulare (in base al rapporto di divisione desiderato) in 3 ml di supporti cellule ES in ciascun pozzetto per essere seminati. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF. Un confluenti Mesc ben diviso 1: 6 sarà pronto per il passaggio in 2 giorni.
    8. OP9 / mantenimento delle cellule OP9-DL1
      1. Scongelare una fiala di cellule OP9 (seguire la procedura 2.1.1-2.1.3 utilizzando supporti OP9)
      2. Aggiungere 7 ml OP9 media per 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Aggiungere 3 ml di cellule risospese in maniera goccia a goccia, la distribuzione di cellule in tutta la piastra. Posizionare le cellule durante la notte in incubatrice.
      3. Controllare la confluenza delle cellule OP9 il giorno successivo. Se il piatto contiene molte cellule galleggianti morte, remove media e aggiungere 10 ml di media OP9 fresco. Riportare il piatto per l'incubatore se quasi piena confluenza non si osserva. Split (utilizzando tripsina) 1: 4 prossimo monostrato confluente OP9.
        NOTA: Le piastre devono raggiungere di nuovo allo stesso livello confluenza in circa 2 giorni. Fare attenzione a non lasciare che le cellule OP9 diventare over-confluenti.
      4. Congelare i primi passaggi di cellule OP9 come scorte di espansione.
        NOTA: congelare 2 fiale di cellule OP9 da un vicino confluenti 10 centimetri piatto. Ogni flaconcino di espansione magazzino può essere ulteriormente propagato per creare scorte di lavoro che vengono poi utilizzati in Mesc esperimenti di co-coltura. Tenere tutti gli stock OP9 congelati in azoto liquido piuttosto che nel -80 ° C freezer, dal momento che le temperature fluttuanti possono influenzare negativamente la qualità delle blocca.

    3. OP9-DL1 Co-cultura Procedura

    1. Preparazioni di co-coltura
      1. Circa una settimana prima dell'inizio di una co-coltura, scongelare MEF, mESCs e sto lavorando cellulare OP9CKS. Poiché le cellule OP9-DL1 non sono necessari fino a co-coltura giorno 8, scongelare le cellule OP9-DL1 durante i primi tre giorni dopo co-coltura iniziazione. Mantenere o congelare tutte le cellule, se necessario.
      2. Determinare il numero iniziale di 10 cm piastre con monostrati cellulari OP9 pronti a raggiungere l'80% di confluenza in co-coltura giorno 0 in base alla scala dell'esperimento (ad esempio, il numero di cloni Mesc per differenziare e il numero di co-coltura punti di tempo a da analizzare). Per preparare una co-coltura, diviso nei pressi di piatto confluenti di cellule OP9 tra 1: 4 e 1: 6 due giorni prima di quando saranno necessari i monostrati.
        NOTA: Uno sarà bisogno di almeno una piastra per ogni ESC clone. Tipicamente, un singolo clone ESC seminato su un singolo piatto (come descritto sotto) al giorno 0 dovrebbe produrre abbastanza cellule per seminare sei piatti al giorno 5 di passaggio. Ogni piastra giorno 5 consentirà un certo punto volta successiva analisi.
      3. Dal monostrati OP9 saranno continuamente necessari per il passaggio co-coltura, aver cura di sempre maintain un numero adeguato di ulteriori piastre di coltura OP9 in parallelo con la co-coltura.
    2. Giorno 0: Avvio di co-coltura
      1. Raccogliere Mesc come in 2.3.1-2.3.4. Contare le cellule.
      2. Per ogni clone Mesc preparare 5 x 10 4 Mesc in 10 ml di OP9 supporti per piastra.
        NOTA: Anche se non abbiamo usato, notiamo che un mezzo alternativo composto da α-MEM, 10% FBS, e 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanolo è stato segnalato anche per l'uso in differenziazione co-colture 10.
      3. Rimuovere vecchi media da OP9 piatti e aggiungere 10 ml di sospensione Mesc ai piatti avendo cura di distribuire le cellule in modo uniforme in tutta la piastra. Porre le capsule nella C incubatore 37 °.
    3. 3 ° giorno: Cambio media
      1. Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Colonie dovrebbero cominciare a perdere lucentezza e appaiono appiattite.
      2. Rimuovere i supporti dai piatti e aggiungere delicatamente 10 ml di fresca OP9media.
      3. Restituire i piatti co-coltura per l'incubatrice. Visivamente monitorare la formazione di colonie mesoderma-come ogni giorno per informare i tempi di preparazione OP9 alimentatore monostrato per il passaggio successivo (giorno 5), che non deve essere effettuata fino a ~ 80-90% delle colonie visualizzare visivamente mesoderma simile morfologia. Massima rinvio della fase di trasferimento di cellule giorno 5 è di 2 giorni.
    4. Giorno 5: tripsina passaggio mediato con pre-placcatura.
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 10 cm piatti con le cellule OP9 ottimale confluenti. Procedere con le fasi successive solo se le co-colture mostrano visivamente le caratteristiche descritte al punto 3.3.3 (vedi risultati anche Rappresentante).
      1. Rimuovere i supporti dai piatti di co-coltura. Aggiungere 4 ml di PBS per lavare. Agitare il PBS e rimuovere. Aggiungere 4 ml di 0,25% tripsina e posizionare i piatti in incubatrice per ~ 5 min.
      2. Interrompere lo strato di cellule trypsinized di pipettaggio vigoroso, facendo attenzione a non introdurre eccessive bolle d'aria, fino a quando un, sospensione di cellule per lo più unico omogeneo si ottiene.
      3. Aggiungere 4 ml di media OP9 completi e mescolare pipettaggio. Trasferire le cellule in un nuovo, piatto 10 centimetri vuoto e posto in incubatrice per 30 minuti per permettere alle cellule OP9 di aderire al piatto. Questa fase "pre-plating" riduce il numero di cellule OP9 trasferiti alla fase successiva di co-coltura.
      4. Preparare 50 ml provette con filtri di cella di 40 micron.
      5. Raccogliere le cellule non aderenti dal piatto pre-plated e farli passare attraverso il filtro delle cellule nel tubo. Lavare il piatto delicatamente con 6 ml di PBS e farla passare attraverso lo stesso filtro, lasciando le cellule OP9 attaccate dietro.
      6. Centrifugare le cellule a 400 x g 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule pellet in 3 ml di media OP9 completo. Contare le cellule.
      7. Rimuovere i supporti da 10 cm piastre con cellule OP9 ottimale confluenti.
      8. Per ogni punto di tempo di analisi, seminare 5 x 10 5 cellule in mono OP9strato in 10 ml di volume finale.
      9. Aggiungere 5 ng / ml umana ricombinante Flt-3L e posizionare i piatti in incubatrice.
    5. 8 ° giorno: emopoietiche progenitrici delle cellule (HPC) di raccolta
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 6 pozzetti con monostrati OP9 o OP9-DL1 cellule in modo che essi saranno in ~ 80% confluenti in tempo per questa fase.
      1. Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri.
      2. Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Cluster Shiny di HPC devono essere liberamente fissati alla monostrato OP9. Raccogliere il maggior numero di queste cellule come possibile lavando (ma non eccessivamente interrompere) il monostrato OP9 con una pipetta e la media esistenti sul piatto. Per evitare la formazione di schiuma, lasciare sempre almeno 1 ml di media nella punta della pipetta durante questa collezione HPC / fase di lavaggio.
      3. Far passare le cellule attraverso il filtro 40 micron in un tubo. Aggiungere 8 ml di PBS alla stessa piastra e controllare al microscopio se tutti HPC noiri raccolti. Ripetere la fase di lavaggio / collezione con PBS e (se necessario) con il lavaggio più forte. Scolare le cellule in provetta già contenente le cellule dallo stesso piatto.
      4. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C.
      5. Preparare una master mix di 3 ml (per piastra seminata il giorno 5), dei mezzi di comunicazione OP9 con 5 ng / ml Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
      6. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in mezzi OP9 con Flt-3L + IL-7 Master Mix (3 ml per ogni piatto 10 centimetri trasformati). Trasferire le cellule raccolte da ogni piatto in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con cellule OP9.
        1. Al fine di guidare le cellule verso monociti, cellule B o lignaggi eritroidi, seminare le cellule raccolte sulle cellule OP9. Per ricavare cellule T, seminare le cellule su monostrati di cellule OP9-DL1.
      7. Posizionare le piastre da 6 pozzetti in incubatrice.
    6. Giorno 10: Cambio media
      1. Preparare una provetta da centrifuga da 15 ml per ogni distinto mesc clone-alimentatore tipo di cellula combinazionizione in co-coltura.
      2. Preparare una master mix di mezzi OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7. Preparare 3 ml per ogni bene.
      3. Raccogliere delicatamente i media da ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti che combina supporti da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
      4. Aggiungere 2 ml di master mix multimediale OP9 (vedi 3.6.2) in ogni pozzetto.
      5. Centrifugare la media raccolti a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet (molto piccola se visibile) in 1 ml di OP9 master mix dei media (vedi 3.6.2) per pozzetto originariamente raccolti nella fase 3.6.3.
      6. Distribuire 1 ml di cellule di nuovo in ogni pozzetto da cui il supporto è stato originariamente raccolti portando il volume in ogni pozzetto a 3 ml. Riportare i piatti per l'incubatrice.
    7. Giorno 12: Nessun passaggio tripsina
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di piatti 6 pozzetti con cellule OP9 o OP9-DL1 in modo che essi saranno in modo ottimale confluenti in tempo per questo step. Giorno 12 è ideale per la citometria di flusso analisi di sviluppo eritroide, monociti e cellule T early stage.
      1. Preparare una master mix (3 ml per ogni bene che continuerà in co-coltura) dei media OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
      2. Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri (uno per ogni ESC clone-alimentatore tipo di cellula combinazione in co-coltura).
      3. Pipettare vigorosamente i media esistenti in ciascun pozzetto di disaggregare tutte le cellule (tra cui il monostrato) nel pozzo. Continuare con pipettaggio forte fino a raggiungere uno stato simile ad una sospensione di cellule singole.
      4. Passare le cellule raccolte attraverso il filtro nel tubo. Aggiungere 3 ml di PBS in ogni pozzetto per lavare e raccogliere tutte le cellule rimanenti. Passare cellule attraverso lo stesso filtro. Combinare le cellule da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
      5. Eliminare il filtro cella utilizzata e rimuovere un equivalente aliquota da un pozzetto (~ 6 ml) per ogni desideratocitometria a flusso (o altro) analisi da effettuare in quel giorno. Conservare queste aliquote sul ghiaccio prima dell'uso.
      6. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet dai tubi centrifuga da 50 ml a 3 ml di Master Mix per pozzetto di essere ri-seminato. Aggiungere 3 ml per pozzetto di ciascuna sospensione cellulare al tipo di cellula alimentatore appropriato e mettere i piatti in incubatrice.
    8. Giorno 14: Cambio media
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
    9. Giorno 16: Nessun passaggio tripsina
      NOTA: Preparare in anticipo piatti da 6 pozzetti di cellule OP9 o OP9-DL1 confluenti in modo ottimale per questo passo.
      NOTA: Giorno 16 è ideale per citometria a flusso di analisi dei linfociti B e le cellule T fase centrale.
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7.
    10. Giorno 18: Cambio media
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
    11. Giorno 20: Nessun passaggio tripsina
      NOTA: Giorno 20 is ideale per citometria a flusso analisi di metà a fine fase di sviluppo le cellule T.
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7. Se lo si desidera, effettuare differenziazione delle cellule passato giorno 20 cambiamento alternata media e non tripsina passaggi ogni due giorni, con monitoraggio giornaliero del tasso di espansione dei linfociti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Quando coltivate su MEF, in presenza di LIF, mESCs possono essere mantenuti in uno stato indifferenziato. In condizioni ideali, appaiono come colonie compatti di cellule circondate da un alone lucido in microscopia a contrasto di fase (Figura 1). Tali colture devono essere monitorati quotidianamente. In base alla confluenza delle cellule, i media possono essere cambiati o cellule possono essere divise. Limitrofe colonie Mesc non dovrebbero venire al punto di contatto uno con l'altro. Un normale, sana cu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il sistema OP9-DL1 co-coltura è stata utilizzata per studiare il ruolo dei vari prodotti genici durante lo sviluppo di tipi di cellule del sangue da cellule staminali. 8,12,13 Ha anche dimostrato un modello efficace per studiare la funzione del gene DNA normativo durante il differenziamento cellulare. 9,14 Usando questo approccio come alternativa ai modelli interi mouse possono produrre un notevole risparmio di tempo e costi di esperimenti che affrontano molte questioni fondamentali in ematopoiesi....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Joon Kim per l'assistenza esperta di citometria a flusso. La ricerca nei laboratori degli autori è supportata dal programma SCORE del National Institutes of Health (sovvenzione SC1-GM095402 a B.D.O) e dal Canadian Institutes of Health Research (a J.C.Z.P.). J.C.Z.P. è supportato da una cattedra di ricerca canadese in immunologia dello sviluppo. L'infrastruttura di ricerca biomedica dell'Hunter College è supportata in parte dal programma NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) tramite sovvenzioni MD007599. Ringraziamo inoltre il New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) per il suo sostegno all'avvio della ricerca sulle cellule staminali presso l'Hunter College tramite sovvenzioni C023048.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMCorning15-013-CV
Cellule staminali qualificate FBSGemini100-125
Penicillina/StreptomicinaCorning30-002-CI
L-alanil L-glutamminaCorning25-015-CI
HEPES tampone MilliporeTMS-003-C
Aminoacidi non essenzialiThermoScientificSH30853.01
Gentamicina Regent Solution (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-mercaptoetanolo (55 mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
Unità filtroMilliporeSCGPU05RE0.22 μ m Membrana PES
Grado di coltura cellulare AcquaCorning25-055-CM&
alpha;-MEM Tecnologie per la vita 12000-022Polvere, ricostituita secondo le raccomandazioni del produttore
Bicarbonato di sodio SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03È richiesto il collaudo dei singoli lotti 
DimetilsolfossidoSigmaD2650
Ligando umano ricombinante Flt-3R& D Systems308-FK
Murina Ricombinante IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
acqua Utrapure con lo 0,1% di gelatinaMilliporeES-006-B
MEFs trattati con mitomicina CMilliporePMEF-CFQualsiasi MEF ad arresto mitotico può essere utilizzato
DPBSCorning21-031-CV
Filtro cellulare (40 μ m)Fisher22363547
Piatto per coltura tissutale 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-pozzettoBD Falcon353046
provette per microcentrifuga da 1,5 mlUSA Scientific1615-5500
Provette per centrifuga da 15 mlBD Falcon352096
Provette da centrifuga da 50 mlBD Falcon352070
polistirene da 5 ml a fondo tondo con tappo per filtro a celleBD Falcon352235Provette per FACS 
Celle ES R1Celle ATCCSCRC-1011
OP9Le cellule possono essere ottenute dal Riken Laboratory Cell Repository (Giappone).
Celle OP9-DL1      Le celle possono essere richieste allo Zú ñ iga-Pflü laboratorio cker.
Software FlowJo Neli citometri
inattivate a caldo Provetta in Celle nostro laboratorio sono stati utilizzati a flusso Tree Star FACS

Riferimenti

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Differenziazione delle cellule TSistema di co-coltura OP9Cellule progenitrici ematopoieticheAnalisi tramite citometria a flussoMantenimento della coltura cellulareMonostrato di cellule stromaliSviluppo dei linfociti TModello in vitroCD4 CD8 doppio positivi
Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.