In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

Sommario

Due metodi basati sulla citometria a flusso, un test di priming delle cellule T in vitro e la colorazione intracellulare delle citochine, sono stati utilizzati per misurare la capacità di presentazione dell'antigene delle cellule dendritiche e le risposte delle cellule T antigene-specifiche a un'infezione mutante del virus del Nilo occidentale nei topi.

Abstract

Un virus attenuato West Nile (WNV), una non strutturale (NS) 4B-P38G mutante, indotta citochine superiore innata e le risposte delle cellule T rispetto al wild-type WNV nei topi. Recentemente, mieloide fattore di differenziazione 88 (MyD88) Segnalazione ha dimostrato di essere importante per priming di cellule T iniziale e lo sviluppo delle cellule di memoria T durante l'infezione WNV mutante NS4B-P38G. In questo studio, due flusso metodi basati citometria - una in vitro delle cellule T saggio di adescamento e una citochina colorazione intracellulare (ICS) - sono stati utilizzati per valutare le cellule dendritiche (DC) e funzioni delle cellule T. Nella cella T adescamento test, la proliferazione cellulare è stato analizzato mediante citometria a flusso dopo co-coltura di cellule dendritiche da entrambi i gruppi di topi con estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) - etichettato cellule CD4 ⁺ T di OTII topi transgenici. Questo approccio ha fornito una determinazione accurata della percentuale di cellule proliferanti CD4 ⁺ T con migliorata significativamente sensibilità globale rispetto alla tradizioneal saggi con reagenti radioattivi. Un sistema provetta è stato utilizzato in entrambe le procedure di coltura cellulare e citochine colorazione del protocollo ICS. Rispetto al tradizionale sistema basato piastra di coltura tissutale, questa procedura modificata era più facile per eseguire a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture. Inoltre, le cellule infette WNV- sono state trattate con paraformaldeide in entrambi i test, che ha consentito un'ulteriore analisi fuori strutture BL3. Nel complesso, questi in vitro test immunologici possono essere utilizzati per valutare in modo efficace risposta immunitaria cellulo-mediata durante l'infezione da WNV.

Introduzione

Virus West Nile (WNV), una neurotropo, plus-rilevati flavivirus, è una minaccia per la salute pubblica emergente. Attualmente, vaccini sono stati approvati per uso umano ^1. Un ceppo WNV attenuato, che ha una sostituzione P38G nel non strutturale (NS) di proteine ​​4B, è noto per indurre non letalità nei topi ma citochine superiore innate e le risposte delle cellule T nei topi wild-type di WNV NY99 ceppo ^2. I topi immunizzati con il mutante NS4B-P38G stati tutti protetti da una sfida secondario con letale wild-type WNV. Questo suggerisce che il mutante NS4B-P38G ha caratteristiche adatte per un vaccino candidato ideale. I meccanismi con cui il mutante NS4B-P38G induce protezione ad alta immunità adattativa non sono chiaramente ancora capito. Toll-like receptors (TLR), che riconoscono pattern molecolari associati ai patogeni, svolgono un ruolo fondamentale nell'avvio di immunità innata alle infezioni virali. Il percorso di segnalazione nucleo TLR utilizza mieloide risposta differenziazione primaria geNE 88 (MyD88) come scheda primaria ^3,4. In un recente studio, la segnalazione MyD88 ha dimostrato di giocare un ruolo importante nello sviluppo delle cellule mediata durante WNV NS4B- P38G infezione nei topi mutanti ^5. Le cellule dendritiche (DC) sono una delle più importanti cellule presentanti l'antigene espositrici la capacità unica di avviare le risposte delle cellule T primarie durante l'infezione virale ^6,7. Cellule T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ entrambi contribuiscono all'immunità protettiva di lunga durata e sono importanti per la sopravvivenza di accoglienza a seguito di tipo selvaggio WNV infezione ^8,9. Due saggi immunologici sono stati usati in questo studio per valutare le funzioni di queste cellule nei topi mutanti infettati NS4B-P38G.

In primo luogo, un dosaggio priming di cellule T in vitro è stato utilizzato per confrontare la capacità presentanti l'antigene di DC di wild-type WNV-infetti e MyD88 ^{- / -} mice. Per aumentare la sensibilità del test, ingenuo CD4 ^{+ cellule T sono stati isolati da OTII topi transgenici che esprimono uno specifico Vα2 / Vβ5 TCR per l'ovoalbumina pollo (OVA) peptide 323 - 339. DC di WNV topi infetti sono stati purificati, e co-coltura con carboxyfluorescein succinimidil Pasqua (CFSE ) -labeled cellule CD4 + T in presenza di OVA peptide. Dopo 5 giorni di co-coltura, le cellule sono state raccolte e fissate con paraformaldeide (PFA) e analizzati mediante citometria a flusso. Saggi proliferativa, sono state tradizionalmente effettuata mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) o triziata deoxyriboside timina (3 HTdr) 10. Tuttavia, questi test sono o radioattivi e / o che necessitano di apparecchiature speciali a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture, dove vengono condotti studi WNV. L'analisi citofluorimetrica della proliferazione dei linfociti dimezzando seriale dell'intensità di fluorescenza del colorante vitale CFSE è diventato più comunemente usato in saggi immunologici, come il colorante è più stabilee uniformemente incorporati in cellule, rilevata facilmente mediante citometria di flusso, ed è non radioattivo 11. Il test ha anche la capacità di valutare il numero di divisioni cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo test in studi WNV è che la fissazione delle cellule infettate con 1-2% PFA possa inattivare WNV 12, che consentirà l'acquisizione dei campioni con un citometro a flusso in un laboratorio BL2.}

Successivamente, una procedura modificata intracellulare di citochine colorazione (ICS) è stato utilizzato per studiare il ruolo di MyD88 segnalazione nella regolazione del WNV specifiche risposte delle cellule T in NS4B-P38G topi mutanti-infettati. In questo saggio, splenociti isolati da topi infetti sono stati trattati in vitro con WNV peptidi specifici. Brefeldina A inserito mantenere le citochine all'interno della cellula. Dopo 5 ore di incubazione, le cellule sono state raccolte, lavate e colorate per sottogruppi di cellule T. Le cellule sono state poi fissati in PFA, permeabilizzate e colorate per interferone (IFN) -γ e analizzate mediante citometria a flusso.Come con altri flusso-citometria saggio basato, una volta che le cellule vengono trattate con fissazione e tampone di permeabilizzazione contenente PFA, campioni infetti possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per l'ulteriore elaborazione e analisi. In diversi studi pubblicati, abbiamo usato ICS per misurare le funzioni effettrici delle cellule T in WNV-infetti topi ^13,14. Anche se è ben consolidata, uno svantaggio principale di questo saggio è che la procedura è molto lunga e potrebbe essere più tempo quando eseguita all'interno di strutture BL3. Qui, un metodo basato ICS-tube micro-centrifuga ha dimostrato di essere più fattibile, facile procedere e richiede meno tempo quando eseguita all'interno di un laboratorio BL3.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato animali presso l'Università del Texas Medical Branch.

1. Isolamento delle DC da topi non infetti e WNV infettate

1. Per età e per sesso partita 6-10 settimane di età, wild-type C57BL / 6 (B6) e MyD88 ^{- / -} mice. Inoculare per via intraperitoneale (ip) con 500 unità formanti placca (PFU) di WNV NS4B- P38G mutante. Al giorno 3 dopo l'infezione, eutanasia B6 e MyD88 ^{- / -} mice con CO _2. Utilizzare i topi non infetti di entrambi i gruppi come controlli. Utilizzare tre topi da ciascun gruppo.
2. Pelliccia bagnato sul lato sinistro del mouse sacrificato con etanolo al 70% e tagliato via il pelo lungo il lato sinistro del mouse, circa a metà strada tra le gambe anteriori e posteriori. Tagliare aprire la cavità del corpo. Rimuovere la milza utilizzando le pinze. Posizionare la milza in una capsula di Petri con RPMI.
3. Isolare DC milza utilizzando sfere magnetiche anti-CD11c secondole istruzioni del produttore.

2. Purificazione e etichettatura delle cellule T di OTII topi transgenici

1. Harvest una milza da un ingenuo del mouse OTII come descritto al punto 1.2 di cui sopra e omogeneizzare la milza tra le estremità smerigliato di due slitte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml, aggiungere mezzo RPMI fino a 14 ml. Sia la sospensione riposare per 5 min e 13 ml di trasferimento ad una nuova provetta conica da 15 ml.
2. Isolare le cellule CD4 ⁺ T spleniche utilizzando un kit di isolamento di cellule CD4 ⁺ T secondo le istruzioni del produttore.
3. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml, lavare due volte con PBS. Risospendere le cellule in PBS con albumina sierica bovina 0,5% (BSA) a 1 x 10 ⁶ cellule per ml, e aggiungere 0,5 mmol / ml di CFSE. Incubare a 37 ° C per 10 minuti, al riparo dalla luce.
4. Aggiungere 5 ml terreno completo a freddo (RPMI-1640 con siero fetale bovino 10% di calore-inattivato, 1/100 volantibiotici / antimicotici, 1/100 vol L-glutammina e 1 / 1.000 vol di 1.000 x 2-mercaptoetanolo).
5. Incubare in ghiaccio per 5 min. Lavare le cellule una volta con PBS, fix 0.2 x 10 ⁶ etichettati cellule CD4 ⁺ T in 2% PFA e acquisire su un citofluorimetro. Utilizzare questo esempio per determinare il livello basale di CFSE. Re-sospende il resto delle cellule etichettate in terreno completo.

3. Co-cultura OTII T cellule con DC di topi infettati da WNV

1. Cultura 2 x 10 ⁵ purificati cellule CD4 ⁺ T di topi OTII solo o con DC purificate di wild-type o MyD88 ^{- / -} mice (2 x 10 ⁴⁾ in un piatto ben 24, con o senza residui OVA 323-339 (1 g / ml) in 1 ml di mezzo completo per pozzetto.
2. Incubare le cellule a 37 ° C per 5 giorni. Celle di raccolta, lavare due volte in tampone FACS (PBS con 1% FBS) e fissare in 0,25 ml 2% PFA. Vortex immediatamente.

4. Citometria a flusso Analisi di In Vitro </ Em> T cellulare adescamento

1. Per l'acquisizione, fare doppio clic sull'icona del software di citometria a flusso. Per una trama densità lineare FSC-A vs linear SSC-A, selezionare i canali da 0 a 200.000 in FSC-A e 0 a 200.000 su SSC-A. Quindi creare un cancello su cellule vive (P2; vedi Figura 1A).
2. Per analizzare l'intensità di fluorescenza di CFSE, aprire l'istogramma del canale FL1 e acquisire 20.000 eventi sulla popolazione gated. Impostare un marcatore su campioni di cellule in coltura OTII sola (Figura 1A).
3. Acquisire i campioni per le cellule OTII co-coltura con wild-type DC (Figura 1B) o MyD88 ^{- / -} DC (Figura 1C) in modo simile.

5. Isolamento e stimolazione di splenociti per citochine saggi

1. Infettare B6 e MyD88 ^{- / -} mice con WNV NS4B-P38G mutante utilizzando la stessa procedura descritta in step 1.1. Al giorno 30 dopo l'infezione, ri-sfida superstite topi con 2.000 PFU del wild-type WNV ceppo ip A giorni 8 e 21 di infezione WNV post-primaria o al giorno 4 dopo l'infezione secondaria, eutanasia topi con CO ₂ per la raccolta di milza .
   NOTA: Abbiamo usato 2-3 topi per gruppo, per ogni punto di tempo.
2. Fare una sospensione singola cella di splenociti come sopra descritto al punto 1.2 e 2.2 passo. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e li ri-sospendere in 10 ml di media completo.
3. Diluire le cellule con mezzo completo a 2,5 x 10 ⁶ cellule / ml. Aggiungere 1 ml di splenociti in un tubo micro-centrifuga 1.5 ml.
4. Per simulare cellule CD8 ⁺ T, diluire NS4B ed E peptidi specifici WNV (SSVWNATTA e IALTFLAV) a 1 mg / ml in DMSO. Per la stimolazione di cellule CD4 ⁺ T, diluire NS3 ed E peptidi specifici WNV (RRWCFDGPRTNTILE e PVGRLVTVNPFVSVA) a 1 mg / ml in DMSO. Aggiungere 10 ml di peptidi alle cellule followed da 1 ml di Brefeldina A soluzione. Utilizzare le cellule senza trattamento peptidi come controlli. Mescolare le cellule.
5. Punzone due fori con un ago da 18 G nel tappo della provetta. Incubare le cellule a 37 ° C per 5 ore.

6. intracellulare di citochine colorazione

1. Trasferire le cellule in un nuovo tubo micro-centrifuga. Spin celle per 5 minuti a 300-400 xg e versare il surnatante. Aggiungere 1 ml FACS tampone, rotazione 5 min a 300-400 xg e risospendere cellule pipettando con 120 microlitri FACS buffer.
2. Aggiungere 2 ml Fc bloccante e incubare cellule a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 1 ml FACS buffer per ogni provetta. Spin 5 min a 300-400 x g.
3. Risospendere le cellule in 300 ml FACS tampone e dividerli in tre provette (circa 0,8 x 10 ⁶ cellule per provetta). Come mostrato nella Tabella 1, la riserva di primo tubo di ciascuna condizione di coltura per ratto IgG-PE colorazione. Per il secondo tubo, aggiungere 3 ml di anti-CD4 APC per CD4 peptidi-trattati cellule, 3 μl di anti-CD8 FITC alle cellule CD8 peptidi-trattati o entrambi gli anticorpi alle cellule senza trattamento peptidi. Utilizzare il terzo tubo di risarcimento colorazione. Per ogni condizione cultura, utilizzare tre provette di cellule colorate con APC-coniugato CD4, CD8 FITC coniugato o in PE etichettati anticorpi CD3 soli (3 ml per provetta) come controlli di compensazione per FL1, FL2 e canali FL4.
4. Cellule Vortex brevemente. Lasciare in ghiaccio per 20 minuti e proteggere dalla luce. Aggiungere 1.4 ml di tampone FACS. Spin 5 min a 300-400 xg e versare il surnatante.
5. Agitare per disturbare pellet (o brevemente vortex). Risospendere pellet cellulare in 250 ml di fissaggio / permeabilizzazione solutionby pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min e proteggere dalla luce.
6. Aggiungere 1,2 ml di tampone FACS. Spin 5 min a 300-400 XG e risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS.
   NOTA: A questo punto, le cellule possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per ulteriore trasformazione o conservata in frigorifero e protetto dalla luce per up per tre giorni.
7. Aggiungere 500 microlitri FACS buffer. Spin 5 min a 300-400 XG e risospendere le cellule in 500 l di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio. Spin 5 min a 300-400 x g.
8. Risospendere le cellule in 100 microlitri 1x Perm / Wash, aggiungere 3,5 microlitri anti-IFNγ-PE al tubo precedentemente aggiunto con anticorpi per CD4 e / marcatori cellulari o CD8 T in fase 6.3 e 3.5 ml topo IgG-PE nel tubo riservata per il controllo IgG per 25 min in ghiaccio e proteggere dalla luce. Lavare le cellule aggiungendo 1,4 ml di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio. Spin 5 min a 300-400 x g. Ripetere la fase di lavaggio con l'aggiunta di 1,4 ml di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio.
9. Spin 5 min a 300-400 xg e decantare il surnatante. Lavare le cellule aggiungendo 1,4 ml di tampone FACS e risospendere in 400 microlitri di tampone FACS per acquisizione finale.

7. Citometria a flusso Analisi delle citochine intracellulari colorazione

1. Utilizzare le stesse impostazioni di acquisizione come al punto 4.1. Create un cancello su cellule vive (P2; Figura 2A). Regolare le tensioni con i tubi di compensazione per ogni gruppo.
2. Aperti due nuovi dot plot, una per visualizzare i dati raccolti per FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), e l'altra è per visualizzare i dati raccolti per FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Acquisire 50.000 eventi per la popolazione gated di ogni campione.

Risultati

Nel saggio T cellule adescamento, le cellule CD4 ⁺ T CFSE etichettati sono state coltivate con DC purificate dalla wild-type-mutante infetto NS4B-P38G e MyD88 ^{- / -} mice in presenza o assenza di peptidi OVA. Cellule T etichettati coltivate solo con o senza OVA per 5 giorni sono stati usati come controlli negativi. Come mostrato nella Figura 1A, le cellule T sono state gated totale per l'analisi di fluorescenza sul canale FL1. Il marcatore è stato istituito sulla base delle appena e...

Discussione

WNV è un patogeno BL3. A causa delle norme di sicurezza, test immunologici con i campioni WNV-infetti sono spesso limitati dalla disponibilità di attrezzature in BL3 strutture o più lungo e noioso per eseguire. In un recente studio, abbiamo utilizzato due metodi basati citometria a flusso per studiare cellule risposte immunitarie mediate durante l'infezione WNV ^5. In entrambi i test, le cellule infettate da WNV sono stati trattati con 1-2% direttamente o con una soluzione di fissaggio / permeabilizzazione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Invitrogen	11875	riscaldamento a 37 gradi C
perline magnetiche anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	seguire il produttore' s istruzioni perline
magnetiche anti-CD4	Miltenyi Biotec	130-095-248	seguire il produttore' s istruzioni CFSE
	Invitrogen	C34554
Residuo OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptidi	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A soluzione	BD Bioscience	555029
Blocco Fc del topo	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	coniugato APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 coniugato FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Soluzione di fissazione/permeabilizzazione	BD-Bioscience	554722
Tampone di permeabilizzazione/lavaggio	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Citometro a flusso Accuri	BD Bioscience