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Articolo metodologico

Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

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DOI:

10.3791/52139

⸱

20 gennaio 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Abstract

Discs large (Dlg) è un membro conservato della famiglia delle guanilato chinasi associate alla membrana e funge da principale proteina di impalcatura presso la giunzione neuromuscolare larvale (NMJ) in Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che la distribuzione postsinaptica di Dlg a livello della NMJ larvale si sovrappone a quella di Hu-li tai shao (Hts), un omologo degli adducini dei mammiferi. Inoltre, si osserva che Dlg e Hts formano un complesso tra loro sulla base di esperimenti di co-immunoprecipitazione che coinvolgono lisati di mosca adulti interi. A causa della natura di questi esperimenti, tuttavia, non era noto se questo complesso esistesse specificamente nel NMJ durante lo sviluppo larvale.

Il saggio di ligazione di prossimità (PLA) è una tecnica di recente sviluppo utilizzata principalmente in colture cellulari e tissutali in grado di rilevare le interazioni proteina-proteina in situ. In questo test, i campioni vengono incubati con anticorpi primari contro le due proteine di interesse utilizzando procedure immunoistochimiche standard. Gli anticorpi primari vengono quindi rilevati con una coppia appositamente progettata di anticorpi secondari coniugati con oligonucleotidi, denominati sonde PLA, che possono essere utilizzati per generare un segnale solo quando le due sonde si sono legate in stretta vicinanza l'una all'altra. Pertanto, le proteine che si trovano in un complesso possono essere visualizzate. Qui, viene dimostrato come il PLA possa essere utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina in situ nella NMJ larvale di Drosophila. La tecnica viene eseguita su preparazioni muscolari della parete larvale del corpo per dimostrare che esiste effettivamente un complesso tra Dlg e Hts nella regione postsinaptica delle NMJ.

Introduzione

Drosophila dischi di grandi dimensioni (Dlg) è un membro conservato della guanilato famiglia chinasi associata alla membrana di ponteggi proteine ​​che aiutano a orchestrare l'assemblaggio di grandi complessi proteici in siti specifici della membrana plasmatica. Originariamente identificato come una proteina soppressore del tumore, Dlg serve come un importante determinante di epiteliale 1,2,3 apicobasal polarità. Dlg serve anche come un importante modulo di ponteggio a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) dei motoneuroni glutamatergici durante lo sviluppo larvale 4. Dlg svolge ruoli diversi al larvale NMJ, e la sua pleiotropismo si basa sulla sua capacità di associare con più proteine ​​5,6. Una di queste proteine ​​è Hu-li tai shao (Hts), un omologo alle adducins mammiferi che sono stati descritti principalmente per quanto riguarda i loro ruoli nella regolazione della actina-spettrina citoscheletro 7. È stato precedentemente dimostrato che Dlg e Hts possono formare un complesso con l'altro sulla base in vitro esperimenti di co-immunoprecipitazione coinvolgono tutta adulti di mosca lisati 8. Una carenza di questi risultati, tuttavia, è che non indicano dove Questo forme complesse. Con l'uso di immunoistochimica, le distribuzioni di Dlg e HTS vengono osservate per sovrapporsi alla membrana postsinaptica del NMJs larvali, ma sono in un complesso in questa regione 8? Come recentemente dimostrato e dettagliato ulteriormente qui, di prossimità legatura Assay (PLA) è utilizzato per cercare un in situ associazione tra Dlg e Hts specificamente al larvale NMJ 27.

PLA è una relativamente nuova tecnica utilizzata principalmente in cellule e tessuti cultura in grado di rilevare le interazioni proteina-proteina in situ 9. In questo saggio, gli anticorpi primari contro le due proteine ​​di interesse vengono rilevati con un paio di anticorpi secondari specie-specifici, definito sonde PLA, che sono coniugati ad oligonucleotidi (Figura 1A, B). Se le due proteines sono in stretta vicinanza l'uno all'altro (cioè entro poche decine di nanometri), la distanza tra le sonde PLA allegate può essere colmato attraverso ibridazione di oligonucleotidi due connettori aggiuntivi (Figura 1C). In questa conformazione, le estremità libere delle oligonucleotidi connettore sono abbastanza vicino per fare contatto con l'altro, e una molecola di DNA circolare chiuso possono essere formati su di legatura in situ (Figura 1D). La molecola di DNA circolare serve come modello per in situ cerchio di rotolamento di amplificazione, che è innescato da uno degli oligonucleotidi coniugati alle sonde PLA (Figura 1E). Sequenze all'interno amplificato, prodotto DNA concatemeric risultante possono poi essere visualizzati con, sonde oligonucleotidiche complementari fluorescenza marcata (Figura 1F). Poiché il DNA amplificato rimane attaccato ad una delle sonde PLA, la localizzazione subcellulare della proteina-proteina interazione withina tessuto può essere prontamente accertata.

Diversi metodi sono comunemente usati per rilevare le interazioni proteina-proteina anche in tecniche in vitro, come co-immunoprecipitazione, pull-down test e lievito di screening doppio ibrido, e in tecniche vivo come il trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) e bimolecolari complementazione fluorescenza ( BiFC). Una trappola delle tecniche in vitro è che essi non identificano in cui l'interazione è endogeno in corso, mentre le tecniche vivo il citate in coinvolgono l'espressione artificiale di proteine ​​di fusione che non può riflettere il comportamento nativo dei loro omologhi endogeni. Uno dei principali vantaggi di PLA è che è in grado di determinare all'interno di un tessuto la localizzazione subcellulare di interattori proteici endogeni che sono in stretta vicinanza l'uno all'altro e probabilmente formano un complesso, con il grado di vicinanza necessaria per generare un segnale è paragonabile alla FRET e BiFC. PLA può rilevare interazioni con alta specificità e sensibilità a causa dell'accoppiamento del riconoscimento anticorpale e amplificazione del DNA. Così, il dosaggio può generare segnali luminosi discreti, in forma di puncta che rivelano la posizione esatta dell'interazione. Inoltre, gli antigeni difficilmente visibili possono essere rilevati. Infine, PLA è una tecnica relativamente semplice da eseguire, e non richiede una procedura di immunoistochimica standard per completare. Pertanto, PLA offre un vantaggio tecnico rispetto agli altri saggi di interazione proteina-proteina che sono spesso afflitto con tempi lunghi di preparazione e ampie risoluzione dei problemi.

Questo protocollo illustra come PLA può essere applicato al Drosophila larvale NMJ al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogena in situ. Qui, PLA viene eseguita su preparazioni muscolari parete corpo larvali dove Dlg e Hts sono mostrati di esistere davvero in un complesso in zona post-sinaptica di NMJs. PLA non è stata precedentemente utilizzata per studiare la larvale NMJ, e ci sono al momento solo una manciata di articoli pubblicati che hanno utilizzato questo test nel tessuto Drosophila. Si spera che ulteriore esposizione del PLA per la comunità Drosophila si tradurrà in un maggiore ricorso come uno strumento aggiuntivo per integrare altri, più comunemente usati proteina-proteina saggi di interazione.

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Protocollo

1. Preparazione parete Corpo

NOTA: Preparazione di terzo stadio larvale pareti corpo (per lo studio delle NMJs che innervano i muscoli della parete corpo) è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al 10, o Ramachandran e Budnik 11,12, ma con alcune modifiche..

  1. Dissezione
    1. Sollevare scorte mosca e croci a 25 ° C per 5-6 giorni usando procedure standard 13.
    2. Scegli strisciando terzo instar larve di fiale o flaconi utilizzando una pinza sottile.
    3. Lavare le larve in un piccolo piatto di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere eventuali particelle di cibo.
    4. Posizionare un larva su un disco Sylgard e immergerlo in alcune gocce di ghiaccio freddo PBS. Utilizzando ghiacciata PBS aiuterà stordire la larva rendendo più facile da manipolare. Durante la dissezione, assicurarsi che la preparazione è sempre immerso in PBS per evitare che si asciughi.
    5. Posizionare il larva con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che i due tratti tracheali sono visibili al microscopio da dissezione (Figura 2A). Utilizzando le pinze per afferrare un perno minutien, pin la larva giù alla fine posteriore vicino alle spiracoli (Figura 2b). Con un altro perno, penetrare attraverso la cuticola all'estremità anteriore vicino i ganci bocca. Allungare delicatamente la larva fuori il lungo, poi pin basso (Figura 2B).
    6. Utilizzando forbici microdissezione, pizzicare la fine posteriore vicino al pin per creare una piccola apertura. L'incisione dovrebbe essere abbastanza superficiale passare solo attraverso la cuticola.
    7. Posizionando la punta della lama inferiore delle forbici nell'incisione, tagliare lungo l'intera lunghezza della linea mediana dorsale tra i due tratti tracheali (Figura 2C). Puntare le lame a forbice leggermente verso l'alto quando il taglio per evitare di danneggiare i muscoli della parete del corpo ventrali.
    8. Fai una piccola incisione orizzontale leggermente anteriore al postpin eriorly-posto (Figura 2C). Fare un'altra incisione simile poco posteriore al pin anteriormente classificata (Figura 2C). Le incisioni dovrebbero solo passare attraverso la cuticola.
      NOTA: Le tre incisioni di passaggi 1.1.7 e 1.1.8 combinati dovrebbe assomigliare ad un " figure-protocol-1 "Una volta completato, cioè, un lembo sinistro e destro sul lato dorsale del corpo larvale dovrebbe essere prodotto.
    9. Pulire accuratamente fuori gli organi interni con le pinze. Aggiungendo qualche goccia forti di PBS aiuterà spostare gli organi dal corpo larvale, rendendo così più facile per rimuoverli. Evitare colpendo il corpo larvale in quanto causerà danni ai muscoli della parete del corpo.
    10. Srotolare il corpo larvale aperto e appuntare gli angoli verso il basso (Figura 2D). Quando pinning, allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente per formare un rettangolo uniformemente-tensione (see Figura 2G per la forma), facendo attenzione a non strappare i muscoli della parete del corpo nel processo.
    11. Finire rimuovendo eventuali organi interni rimanenti (Figura 2E).
  2. Fissazione e permeabilizzazione
    1. Immergere le pareti del corpo appuntato alcune gocce di soluzione di Bouin. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio. In alternativa, utilizzare 4% paraformaldeide (PFA) come fissativo alternativo; incubare per 30 min.
    2. Risciacquare tre volte con tampone fosfato Saline con Triton (PBT).
    3. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere con attenzione i perni e trasferire le pareti del corpo da parte dei loro angoli in un siliconato 0,65 ml provetta.
    4. Conservare le pareti del corpo in PBT a 4 ° C fino al momento PLA. Per ottenere risultati ottimali, avviare immunocolorazione le pareti del corpo entro un giorno o due di dissezione.
      NOTA: Per risparmiare i reagenti e di garantire che tutte le pareti del corpo sono trattati allo stesso modo durante il test, diversi genotipi possono essere inseriti in un unicotube. I genotipi possono distinguere tagliando gli angoli delle pareti del corpo diverso (vedere Figura 2F per gli esempi).

2. immunoistochimica

NOTA: immunocolorazione di terzo stadio larvale pareti corpo è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al 14 e Ramachandran e Budnik 11, ma con alcune modifiche 11,14..
NOTA: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente e con agitazione se non diversamente specificato.

  1. Blocco
    1. Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
    2. Blocco con 1% albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora.
  2. Immunostaining
    1. Incubare le pareti del corpo con anticorpi primari di topo e di coniglio contro le due proteine ​​di interesse (diluito in 1% BSA) per 2 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. In questo caso, utilizzare il mouse 01:10 anti-Dlg e 1: 250 coniglio unNTI-HtsM 15,16. Gli anticorpi contro i marcatori che non sono fatti nel topo o di coniglio possono essere inclusi - per esempio, utilizzare 1: 200 di capra anti-Hrp per delineare le membrane neuronali.
    2. Lavare con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
    3. Incubare con anticorpi secondari coniugati fluoroforo per rilevare marcatori (diluito in 1% BSA) per 2 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. Poiché il segnale PLA viene successivamente visualizzata con un fluoroforo rosso, un'altra fluoroforo deve essere utilizzato per rilevare il marcatore - esempio, utilizzare 1: 200 FITC-coniugato anti-capra per rilevare l'anticorpo anti-Hrp capra. Grazie all'uso di reagenti sensibili alla luce, mantenere i tubi al buio da questo punto in poi.
      NOTA: Il kit utilizzato permette di PLA da eseguire tra anticorpi primari sollevate nel topo e coniglio, con il segnale visualizzato sul canale rosso al microscopio confocale. Se lo si desidera, altri kit sono disponibili che consentono il dosaggio di essere fatto con primaanticorpi Ry sollevate in altre specie, e il segnale visualizzati su altri canali.

3. prossimità legatura Assay

NOTA: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente e con agitazione se non diversamente specificato.

  1. PLA Sonde
    1. Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
    2. Incubare con sonde PLA (1: 5 di diluizione ciascuno in 1% BSA) per 2 ore a 37 ° C. In questo caso, utilizzare 40 ml di PLA sonda anti-topo MENO, 40 ml di sonda PLA PLUS anti-coniglio e 120 ml di 1% BSA per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo. Fino ad una diluizione 1:25 sonde PLA ancora può risultare in un rapporto adeguato segnale-rumore (cioè, per questo esperimento).
  2. Legatura
    1. Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio A due volte per 5 minuti ciascuno.
    2. Incubare con la soluzione di legatura (1:40 diluizione della Ligase in tampone legatura) per 1 ora at 37 ° C. In questo caso, usare 5 ml di Ligase, 40 ml di tampone 5 legatura e 155 ml di acqua ad elevata purezza per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
  3. Amplificazione
    1. Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio A due volte per 2 minuti ciascuna.
    2. Incubare con la soluzione Amplification (1:80 diluizione della polimerasi in tampone Amplificazione) per 2 ore a 37 ° C. In questo caso, utilizzare 2,5 ml di polimerasi, 40 ml di 5 buffer di amplificazione e 157,5 ml di acqua ad elevata purezza per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
  4. Preparazione Imaging
    1. Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio B due volte per 10 minuti ciascuno.
    2. Lavare con 0,01X tampone di lavaggio B una volta per 1 min.
    3. Equilibrare in poche gocce di soluzione di montaggio per almeno 30 minuti prima del montaggio, o conservare una notte a 4 ° C.
    4. Utilizzando una pinza sottile, trasferire accuratamente le pareti del corpo su una piattaforma scorrevole wesimo loro cuticole rivolto verso il basso. Posizionare le pareti del corpo in righe e nello stesso orientamento in una o due gocce di montante. Posizionare un 22 mm x 40 millimetri coprioggetto sulla preparazione facendo attenzione a non creare bolle d'aria, quindi sigillare il vetrino con smalto trasparente.
    5. Conservare i vetrini al buio a -20 ° C fino al momento per l'imaging confocale.

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Risultati

In wild-type terzo stadio larvale NMJs, Dlg è prevalentemente trova a livello della membrana post-sinaptica di tipo I boutons glutamatergiche, con livelli di immunoreattività Dlg essere più pronunciato in tipo IB boutons di tipo è boutons (figura 3A) 4. Hts è presente in tutto il muscolo, ma si concentra in zona post-sinaptica con Hts livelli immunoreattività appare uguale in entrambi di tipo I boutons, ed è anche trovato presinapticamente (figura 3A ') 8,17. Si no...

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Discussione

Questo rapporto dimostra come PLA può essere applicata alla Drosophila larvale NMJ. Il test viene eseguito su preparazioni muscolari parete corpo larvali al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogeni presenti al NMJ. Con questa tecnica, Dlg e HTS vengono mostrati per essere in stretta vicinanza l'uno all'altro, e pertanto esistere in un complesso, in particolare in corrispondenza della zona 27 postsinaptico. A sostegno di questo risultato, un precedente studio ha fornito prove...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center per la fornitura di scorte mosca. Ringraziamo anche il Developmental Studies Ibridoma Bank e il dottor Lynn Cooley (Yale University) per la fornitura di anticorpi. Un ringraziamento particolare va a AhHyun Yoo per il suo aiuto sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (Krieger), William e Ada Isabelle Steel Fund (Krieger), e la Canadian Institutes of Health Research (Harden).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pinze (fini #5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184Mescolare la base elastomerica e l'agente indurente in un rapporto 10:1. Impostare per 30 min. Versare in uno stampo (es. utilizzare una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti). Lasciare indurire per almeno 24 ore. Far aderire il coperchio di una capsula di Petri da 60 x 15 mm durante la dissezione.
Spille per minuzie (0,0125  Forbici
15200-00
VetriniIncollare due vetrini coprioggetti da 22 x 22 mm2 su un vetrino da microscopio con smalto trasparente, lasciando un < 20 mm di spazio tra loro per il montaggio del campione.
w1118Bloomington Drosophila Stock Center3605
hts01103Bloomington Drosophila Stock Center10989stato ribilanciato su un bilanciatore GFP in modo che i mutanti omozigoti possano essere selezionati in base all'assenza di segnale GFP.
1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato): 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7.0NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Soluzione di BouinSigma-AldrichHT10132
4% PFA (Paraformaldeide): 4% PFA in 1x PBSPFA (Scienza dell'Anachemia - 66194-300). Vedere doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 per istruzioni su come preparare la soluzione.
[header]
1x PBT (Soluzione Salina Tamponata con Fosfato con Triton): 1x PBS con 0,01% di TritoneTriton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Albumina Sierica Bovina): 1% BSA in 1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001). Conservare a 4 °C.
topo anti-Dlg (Dischi grandi)Studi sullo sviluppo Banca di ibridomi4F3Utilizzare a una diluizione 1:10 in 1% BSA.
coniglio anti-HtsM (Hu-li tai shao)Fornito dalla dottoressa Lynn Cooley (Università di Yale). Utilizzare alla diluizione 1:250 in 1% BSA.
coniglio anti-Pak (chinasi attivata da p21)Fornito dal Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Utilizzare alla diluizione 1:500 in 1% BSA.
topo anti-Wg (senza ali)Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi4D4Utilizzare a una diluizione 1:5 in 1% BSA.
capra anti-Hrp (rafano perossidasi)Jackson                          ImmunoResearch123-065-021Uso a una diluizione 1:200 in BSA all'1%.
Asinino coniugato FITC-anti-capraJackson                       ImmunoResearch705-095-003Utilizzare a una diluizione 1:200 in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-coniglio PLUSSigma-AldrichDUO92002
Duolink Reagenti per il rilevamento in situ RossoSigma-AldrichDUO92008
1x Wash Buffer A: 0,01  M Tris, 0,15  M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Tampone di lavaggio B: 0,2  M Tris, 0,1  M NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Tampone di lavaggio B: 2  mM Tris, 1  mM NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink Terreno di montaggio in situ con DAPISigma-AldrichDUO82040
per microdissezione (ultra fine)Fine Science Tools per piattaforma Stock Center è

Riferimenti

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NMJ larvale di DrosophilaInterazione proteina-proteinaMicroscopia confocaleImmunofluorescenzaMembrana postsinapticaComplesso Dlg HtsSonde PLAAmplificazione a cerchio rotolantePreparazione della parete corporea
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