Articolo metodologico

Analisi rapida e robusta di Cellulare e Molecolare polarizzazione indotta da chemochine Signaling

DOI:

10.3791/52140

⸱

12 dicembre 2014

 , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, 2Cnrs, UMR8104, 3Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

In questo articolo

Sommario

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La segnalazione delle chemochine suscita marcate alterazioni della morfologia cellulare e alcune importanti ridistribuzioni delle proteine intracellulari. Qui, viene fornito un protocollo rapido e dettagliato per studiare questi eventi.

Abstract

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Le cellule rispondono alla stimolazione chemochine, perdendo la loro forma rotonda in una polarizzazione processo chiamato, e alterando la localizzazione subcellulare di molte proteine. Tecniche di imaging classici sono stati usati per studiare questi fenomeni. Tuttavia, hanno richiesto l'acquisizione manuale di molte cellule seguite da tempo quantificazione della morfologia e la co-localizzazione della colorazione di decine di cellule. Qui, un metodo rapido e potente è descritto per studiare questi fenomeni su campioni costituiti da diverse migliaia di cellule usando un flusso di imaging citometria tecnologia che combina i vantaggi di un microscopio con quelle di un citometro. Utilizzando linfociti T stimolate con CCL19 e colorazione per le molecole MHC di classe I e actina filamentosa, una strategia di gating è presentato per misurare simultaneamente il grado di alterazioni di forma e la misura di co-localizzazione di marcatori che sono affetti da segnalazione CCL19. Inoltre, questa strategia ci ha permesso di gating Observe la segregazione di actina filamentosa (nella parte anteriore) e fosforilata proteine ​​Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (nella parte posteriore) in cellule T polarizzate dopo la stimolazione CXCL12. Questa tecnica è anche utile per osservare l'effetto di blocco sulla polarizzazione di due elementi differenti: inibizione della polimerizzazione mediante un inibitore farmacologico ed espressione dei mutanti del Par6 / atipica PKC percorso di segnalazione. Così, la prova viene dimostrato che questa tecnica è utile per analizzare sia le alterazioni morfologiche e redistribuzioni di proteine.

Introduzione

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Chemochine sono piccole proteine ​​solubili che attirano le cellule a posizioni specializzate 1. Pertanto, partecipano al corretto posizionamento delle cellule in tessuti, una funzione cruciale per lo sviluppo e la fisiologia. Il sistema immunitario non fa eccezione a questa regola in quanto si basa sull'azione di molti diversi tipi di cellule che agiscono di concerto per montare una risposta immunitaria efficace. Controllando la posizione specifica di un tipo di cellula immunitaria in un dato stato, chemochine sono pre-preliminare antigeni estranei possono essere rilevati e neutralizzati.

In linfociti T in particolare, che....

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Protocollo

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1. Preparazione di linfociti T

  1. Preparare principale del mouse o cellule T umane come descritto 10,11.
  2. Coltivare cellule T umane in mezzo completo RPMI con 10% siero umano AB ad una densità di 2 - 3 x 10 6 cellule / ml.
    NOTA: L'uso di siero fetale di vitello (FCS) invece di siero umano può suscitare polarizzazione spontanea di una grande frazione di cellule T umane in coltura. Conservare queste cellule in coltura per 4 - 5 giorni ed ulteriormente processo in qualsiasi momento durante questo periodo.
  3. Mantenere cellule T del mouse in mezzo completo RPMI supplementato con 10% FCS ad una densità cellulare sim....

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Risultati

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Il primo esempio scelto qui riguarda l'uso di linfociti T primari umani stimolati con CCL19. Tuttavia, la stessa strategia può essere utilizzata con le cellule T di topo primaria, linee cellulari T o qualsiasi altro tipo di cellula sensibile alla stimolazione chemochine. La strategia di gating qui presentato comprende una serie di finestre che selezionano gli eventi focalizzato, poi le singole celle. Infine la gamma di intensità di fluorescenza è seguito come esempio su due marcatori: MHC classe I HLA-ABC e actina filam.......

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Discussione

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Usando una tecnologia recente del flusso di imaging citometria, una strategia rapida ed informativo gating per analizzare gli eventi cellulari e molecolari indotti dalla stimolazione chemochine è presentato. Da un unico esperimento, si possono ottenere due tipi principali di informazioni: le variazioni di morfologia cellulare indotta da chemochine stimolazione e la distribuzione subcellulare di proteine ​​differenti durante il processo di polarizzazione. È interessante notare che la prova è prevista anche la possibilità.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono notevolmente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert e Louise Rimbault dello strumento Cochin Imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, CNRS e Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMIGibco61870-010
Siero umano ABPAAC11-021Preriscaldare per inattivare il complemento.
Siero fetale di vitelloPAN BiotechP30-3300Preriscaldare per inattivare il complemento.
Kit nucleofattore per cellule T umaneLonzaVCA-1002
Murine IL7Peprotech217-17
HBSSGibco14025-050Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
HepesGibco15630-056
Murine CCL19Peprotech250-27BLe aliquote vengono scongelate con ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule.
umane CCL19Peprotech300-29Bvengono scongelate con ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule.
umane CXCL12Peprotech300-28Avengono scongelate su ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule. Questa chemochina può essere utilizzata anche sulle cellule T di topo.
Scienze della microscopia elettronicaPFA157-8-100Questa è una soluzione di PFA all'8% in acqua. Miscelare volume a volume con 2x PBS per ottenere una soluzione di PFA al 4% in PBS.
BSASigmaA3059
SaponinaFluka84510
Alexa Fluor 594 falloidinaInvitrogenA12381
Anticorpo FITC-anti-HLA-ABCBeckman CoulterIM1838clone B9.12.1
Anti-P-ERM anticorpoTecnologia di segnalazione cellulare3149P
ImageStreamx Mark IIAmnis
Le aliquote Le aliquote

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
  2. Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
  3. Rougerie, P., Rho Delon, J.

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Chemokine SignalingImaging Flow CytometryT Lymphocyte PolarizationActin SegregationMHC Class I StainingProtein Co localization AnalysisMorphological QuantificationPar6 PKC Pathway InhibitionCCL19 StimulationCXCL12 Stimulation

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