Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa

Sommario

I metodi per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo stanno diventando cruciali per ogni aspetto della ricerca genomica, ma sono laboriosi, costosi e richiedono tempo. Qui viene presentato un sistema robotico di manipolazione dei liquidi disponibile in commercio che automatizza l'immunoprecipitazione della cromatina per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo con quantità limitate di cellule.

Abstract

L'immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è una tecnica di scelta per lo studio delle interazioni proteina-DNA. ChIP-seq è stato utilizzato per mappare le interazioni proteina-DNA e allocare le modifiche degli istoni. La procedura è noiosa e richiede molto tempo, e una delle principali limitazioni è la necessità di elevate quantità di materiale di partenza, di solito milioni di cellule. L'automazione dei saggi di immunoprecipitazione della cromatina è possibile quando la procedura si basa sull'uso di biglie magnetiche. I protocolli automatizzati di immunoprecipitazione della cromatina e la preparazione di librerie sono stati specificamente progettati su un sistema robotico di manipolazione dei liquidi disponibile in commercio, dedicato principalmente all'automazione dei saggi epigenetici. In primo luogo, è stata dimostrata la convalida di saggi ChIP-seq automatizzati utilizzando anticorpi diretti contro varie modificazioni istoniche, seguita dall'ottimizzazione dei protocolli automatizzati per eseguire l'immunoprecipitazione della cromatina e la preparazione della libreria a partire da un basso numero di cellule. L'obiettivo di questi esperimenti è quello di fornire uno strumento prezioso per la futura analisi epigenetica di specifici tipi di cellule, sottopopolazioni e campioni bioptici.

Introduzione

Come Next-Generation Sequencing (NGS) le tecnologie si sono diffuse e più accessibile, il metodo principale per la mappatura a livello di genoma di interazioni proteina-DNA è ora cromatina seguito da NGS rilevamento (ChIP-seq), che permette la scoperta del fattore di trascrizione siti o modelli di modificazioni degli istoni vincolanti. ChIP-seq è vantaggiosa nel fornire dati ad alta throughput dell'intero genoma che può essere utilizzato per l'analisi quantitativa e qualitativa delle interazioni proteina-DNA mediante la misura dei frammenti di DNA arricchito. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in esperimenti ChIP-seq standard come la difficoltà di ottenere abbastanza materiale per creare una libreria sequenziamento.

Esperimenti ChIP sono divisi in sei fasi fondamentali, tra cui le regioni di legame 1) reticolazione proteina-DNA 2) la preparazione del campione, che include la lisi cellulare e taglio della cromatina mediante ultrasuoni, 3) la formazione degli immunocomplessi,4) precipitazione dei immunocomplessi, 5) lavaggio delle immunocomplessi, e 6) eluizione del materiale arricchito e analisi qPCR e NGS.

Il successo di un saggio ChIP dipende da tre fattori principali: una buona preparazione cromatina, la quantità di antigene nel campione originale, e la specificità e affinità dell'anticorpo per il suo antigene affine. Una limitazione importante è il requisito di elevate quantità di partire numero di cellule per ottenere abbastanza DNA arricchito per creare una libreria sequenziamento. Per gli scienziati che lavorano con quantità di campione limitati, quali biopsie o di cellule sotto-popolazioni, esperimenti di ChIP-seq sono molto impegnativo. Recenti studi hanno dimostrato che saggi ChIP-seq possono essere eseguite quando si lavora con una bassa quantità di celle ^{1, 2.} Diagenode ha sviluppato un sistema di manipolazione robotizzato liquido che può automatizzare completamente esperimenti ChIP-seq quando iniziano con un numero limitato di cellule.

Automation forniscemolti vantaggi rispetto preparazione manuale dei campioni di chip-ss quanto diminuisce errore umano, riduce la variabilità, e riduce il costo sperimentale. Sono stati riportati i protocolli semi-automatico per cromatina e la preparazione biblioteca, ma nessuno di questi studi ha mostrato dati quando si utilizza il numero di cellule bassi ^{3, 4, 5, 6.}

In questo documento un flusso di lavoro completo automatizzato è descritto sia per immunoprecipitazione e preparazione biblioteca saggi cromatina in un sistema di trattamento del liquido robot che utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e che può risolvere diversi parametri di ottimizzazione del protocollo. Qui, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti con successo su un numero limitato di cellule con l'obiettivo di semplificare, standardizzare, e fornendo una soluzione affidabile per studiare profili epigenetici in popolazioni piccole cellule. Il protocollo ChIP automatizzato descritto in questo documento è stato ottimizzato su cellule HeLa utilizzando specifici anticorpi istoni e reagenti but il flusso di lavoro può essere adattato ad altre linee cellulari e anticorpi con corrispondenti ottimizzazione sperimentale.

Protocollo

1. Gli esperimenti ChIP standard

1. Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione.
   1. Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere tripsina-EDTA (1x) alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto. Raccogliere le cellule e lavare due volte con 10 ml di PBS.
      NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari.
   2. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Procedere per contare le cellule.
   3. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg, scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di PBS. Il numero ottimale di cellule per la fase di fissaggio è di 10 milioni di cellule per 500 ml di PBS.
   4. Aggiungere 13,5 ml di fresco 37% di formaldeide in ciascuna aliquota di 500 microlitri di sospensione cellulare. Fissare le cellule per 8 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 57 ml di 1,25 M glicina solution per fermare la fissazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione costante delicatamente vortice. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi.
   6. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet di cellule.
   7. Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio.
2. Lisi cellulare e cromatina taglio
   1. Aggiungere 10 ml di ghiaccio di lisi freddo IL1 tampone al pellet (1 ml di tampone di lisi per 1 milione di cellule è il rapporto ottimale). Pipetta su e giù diverse volte e incubare per 10 min a 4 ° C con miscelazione delicata.
   2. Centrifugare il lisato per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Scartare il surnatante.
   3. Aggiungere 10 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio IL2 ai lisati e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare i lisati per 10 minuti a 4 ° C.
   4. Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C e scartare il surnatante.
   5. Prepare il buffer tranciatura completa aggiungendo il 200x cocktail inibitore di proteasi (PIC) al buffer taglio IS1. Mantenere il buffer in ghiaccio per 5 min e lavorare in ghiaccio dopo. Aggiungere 1 ml di completo buffer di taglio IS1 a ogni 10 milioni di cellule pellet e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Prima sonicazione incubare i campioni in ghiaccio per 10 min per ridurre la viscosità del campione.
   6. Al taglio di 300 aliquote microlitri di cromatina mediante ultrasuoni utilizzando un bagno di acqua sonicatore per 2 o 3 serie da 10 cicli ciascuno. Un ciclo consiste di 30 sec "ON" e 30 sec "OFF" in un ambiente ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione con un tempo più breve sonicazione 5 a 10 cicli di 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Brevemente vortex e girare i tubi tra le piste. Quando si utilizzano altri tipi di sonicatori, seguire le corrispondenti istruzioni del produttore per la cromatina taglio.
   7. Centrifugare la cromatina tranciati a 16.000 xg per 10 min e collect il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro.
   8. Analizzare l'efficienza di taglio cromatina prima immunoprecipitazione passo con 1-1,5% gel TAE agarosio o bionalyzer. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp.

2. Basso Esperimenti chip Cell

1. Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione
   1. Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere 1x Tripsina-EDTA alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto.
      NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari.
   2. Raccogliere cellule aggiungendo 1 ml di mezzo di coltura contenente siero in una provetta centrifugazione 1 ml. Contare le cellule.
   3. Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. Portare il numero di cellularea 10.000 cellule per ml di terreno di coltura per la fissazione.
   4. Aggiungere 27 ml di 36,5% di formaldeide fresco preparato in ciascuna provetta per il fissaggio. Capovolgere il tubo due o tre volte e incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 115 ml di soluzione 1,25 M glicina al campione, invertire il tubo due o tre volte e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi.
   6. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante lentamente.
   7. Lavare le cellule con 1 ml di ghiaccio freddo HBSS con PIC (200x, concentrazione finale 1x). Capovolgere il tubo due o tre volte per risospendere le cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio.
2. Lisi cellulare e cromatina taglio
   1. Aggiungere 25 ml di tampone di lisi completa tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) per 10.000 cellule e agitare manualmente il fondo della provetta per risospendere le cellule. Incubare in ghiaccio per 5 min.
   2. Aggiungere 75 ml di completo HBSS (HBSS + PIC) tampone in ciascuna aliquota contenente 10.000 cellule.
   3. Taglio aliquote di 100 microlitri di 10.000 cellule per ultrasuoni per 5 set di 5 cicli ciascuno. Un ciclo si compone di 30 sec "ON" e 30 sec "OFF" l'impostazione ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione utilizzato con un tempo di sonicazione più breve di 5 cicli di 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. Si noti che i preparativi cromatina, tipi di cellule e diversi sonicatori richiedono esperimenti di ottimizzazione taglio separati.
   4. Centrifuga la cromatina tranciati a 14000 g per 10 minuti a scartare il materiale insolubile e raccogliere il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro.
   5. Analizzare l'efficienza di taglio cromatina prima fase immunoprecipitazione utilizzando 1-1,5% TAE gel di agarosio oil bionalyzer. Campioni Trattare con RNase prima agarosio analisi gel al fine di migliorare la valutazione visiva di taglio. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp.

3. Immunoprecipitazione della cromatina e Biblioteca Prep

1. Per standard, automatizzato esperimenti ChIP
   1. Aggiungere 120 ml di chip di buffer H (ChIP Buffer H + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 2 ml a 20 ml, come campione di ingresso.
   2. Selezionare il chip 200 microlitri protocollo automatizzato nello strumento di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa.
   3. Eseguire un esperimento ChIP automatico utilizzando, cromatina pari a 1-2 milioni di cellule, 1-2 mg di anti-H3K79me3, grado -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e H3K9me3 ChIP-seq coniglio anticorpi policlonali. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda della modifica degli istoni e l'affinità e specificity dell'anticorpo corrispondente.
      1. Usare la stessa quantità di IgG di coniglio non immune da un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 20 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione.
   4. Utilizzare i istoni automatizzato reagenti ChIP-seq per effettuare esperimenti di ChIP automatizzate con anti-H3K79me3 e policlonali -H3K4me2. Utilizzare i reagenti del kit chip ss ideali per eseguire esperimenti chip anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3.
   5. Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore.
   6. Purificare il DNA inverso reticolato sul sistema automatizzato. Seleziona autprotocolli omated per la purificazione del DNA con un protocollo o un kit con magnetico purificazione del DNA basato tallone. Eluire il DNA in 25 ml di acqua.
   7. Quantificare il DNA immunoprecipitato estraendo 10% del DNA immunoprecipitato. La resa DNA immunoprecipitato dipende dalla qualità della cromatina e anticorpi, tipo di cellula e la modifica di destinazione istoni. Quantificare il DNA utilizzando un kit di test secondo le istruzioni del produttore.
   8. Analizzare la qualità del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa utilizzando primer per almeno 1 positivo e 1 controllo negativo regioni genomiche. Non utilizzare più del 10% del DNA immunoprecipitato totale per valutare arricchimenti chip.
      1. Preparare le reazioni qPCR. Aggiungere 10 ml di una master mix 2x SyberGreen qPCR, 1 ml di miscela di primer, 1-5 ml di DNA immunoprecipitato o ingresso e acqua sterile fino a 20 ml di volume di reazione finale. Il programma qPCR prevede una fase iniziale di denaturazione a 95 ° Cper 5-10 minuti a seconda del fornitore della Taq polimerasi e le temperature di ricottura deve essere impostato secondo i primer selezionati.
   9. Utilizzare automatizzato protocolli biblioteca preparazione compatibili con i Illumina ChIP-seq reagenti preparazione biblioteca disponibili in commercio per costruire le librerie utilizzando sia ChIP DNA e il DNA di ingresso salvato dalla stessa preparazione cromatina. Utilizzare 10-20 ng di DNA immunoprecipitato da ciascun anticorpo per la preparazione libreria. Preparare fino a 16 librerie automatizzate per ciclo.
   10. Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore Illumina. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo la Illumina conduttura, filtro standard e allineare la legge per l'ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con l'assetto ELAND. Utilizzare SICER ⁷ o MACS ⁸ per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle di cime wesimo Homer ^9, BEDTools ¹⁰ o software preferito.
2. Per numero automatizzato basso cellulari esperimenti ChIP
   1. Aggiungere 120 ml di tampone ChIP completa tC1 (ChIP Buffer tC1 + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 20 microlitri come input.
   2. Selezionare automatizzato protocollo microlitri ChIP 200 nel sistema di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa.
   3. Eseguire un esperimento ChIP-seq automatizzato utilizzando reagenti ChIP automatizzati e anticorpi ChIP qualità ottimizzati per lavorare sulle quantità cromatina bassi. Utilizzare cromatina corrispondente a 10.000 cellule e 100.000 cellule, 0,5 mg di anti-H3K27me3, 0,25 mg -H3K4me3, 0.1 mg -H3K27ac, 0,25 mg -H3K9me3 grado anticorpi policlonali di coniglio ChIP-Seq Premium coniglio. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda modifica istoni e l'affinità e specificità dell'anticorpo corrispondente.
      1. Usare la stessa quantità di rab non immuneIgG bit come un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 10 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione.
   4. Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore.
   5. Purificare DNA reticolato inversa utilizzando le colonne di spin seguendo le istruzioni del produttore ed eluire in volumi da 6 ml a 25 ml di acqua.
   6. Quantificare il DNA utilizzando un kit test commerciale. Analizzare i risultati per qPCR utilizzando primer per le regioni di controllo positivi e negativi per valutare la qualità chip.
   7. Utilizzare un kit di preparazione biblioteca con reagenti preparazione di libreria ottimizzata per preparare librerie a basso quan DNAquan-. Utilizzare 30 pg e 300 pg di DNA chip (corrispondenti rispettivamente a 10.000 e 100.000 cellule esperimenti) per la preparazione biblioteca. Preparare le librerie che utilizzano il protocollo automatizzata compatibile con i reagenti di preparazione biblioteca. La libreria prep velocità automatizzata è 1 a 48 librerie per ciclo.
   8. Dopo la riparazione fine dei modelli a doppia elica del DNA, legare gli adattatori stem-loop scindibili contenenti i siti di primer di sequenziamento. Dopo l'estensione DNA passo, amplificare il campione con il metodo di amplificazione alta fedeltà descritto nel protocollo kit di preparazione biblioteca.
   9. Dopo l'amplificazione biblioteca, quantificare e purificare le librerie seguendo le indicazioni del kit di preparazione biblioteca. Si noti che la selezione del formato dopo purificazione non è necessaria.
   10. Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo lo standard gasdotto produttore, il filtro, e allineare la legge per l'ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con la ELAND ⁷ mascherina. Utilizzare SICER ⁸ o MACS ⁹ per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle dei picchi con Homer, BEDTools ^10, o qualsiasi software preferito.

Figura 1. Screenshots del software che mostra come impostare esperimenti ChIP automatizzata nel PI-Star Compact. Il software offre la flessibilità di selezionare la quantità di campioni per periodo e per modificare i parametri sperimentali chiave (Anticorpo Coating, IP e lavaggi ) secondo le esigenze ricercatore. La procedura automatizzata consente testare diverse condizioni in parallelo (vale a dire, diversi tipi e le quantità di anticorpi, diversi tipi e le quantità di cellule e persino diversi tipi e quantità di sfere magnetiche nello stesso periodo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Schermate del software che mostra come impostare la preparazione automatizzata libreria per sequenziamento di nuova generazione utilizzando il kit biblioteca nel sistema di automazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Ottimizzazione esperimenti ChIP-seq automatizzati per otto diversi marcatori degli istoni

Al fine di sviluppare con successo e validare i protocolli ChIP automatizzati, anticorpi grado ChIP-Seq precedentemente convalidati in esperimenti di ChIP-Seq manuali (dati non riportati) sono stati selezionati. I seguenti anticorpi grado ChIP-seq sono stati scelti per questo studio: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3. La specificità di tutti gli anticorpi grado ChIP-seq è stato già confermato dalla macchia puntino, array di peptidi e gli esperimenti Western Blot (dati non riportati). Esperimenti pilota ChIP-qPCR con quantità crescenti di anticorpi sono stati eseguiti per determinare la sensibilità degli anticorpi (Figura 3). qPCR con almeno due positive e due obiettivi di controllo negativi sono stati analizzati e profili con arricchimenti di positivo oltre bersaglio negative superiori a cinque volte sono qualificati per il sequenziamento exper iments. E 'importante eseguire esperimenti Chip e ChIP-Seq con un'alta qualità della cromatina tranciati. Tutti gli esperimenti ChIP riportati in questa pubblicazione sono stati eseguiti utilizzando cromatina fresco. È anche possibile congelare le cellule fissate a -80 ° C e procede all'elaborazione cromatina e tranciatura in un giorno diverso. Tuttavia, cromatina preparato da cellule fissate congelate possono comportarsi in modo diverso da cromatina preparati al momento e quindi le condizioni di sonicazione può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni preparazione cromatina. Quando si lavora con diversi tipi cellulari, possono essere utilizzati i buffer di tranciatura con differenti composizioni detergenti (SDS). Tipi cellulari, quali linee cellulari primarie o cellule coltivate in sospensione sono cellule difficili da taglio e richiederanno di alte concentrazioni di SDS (1%), mentre le linee cellulari che sono facili da taglio come HeLa richiederà basse concentrazioni SDS (0,1%) nel buffer di taglio.

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Figura 3. Validazione di anticorpi ChIP qualità utilizzando il sistema di automazione. ChIP è stata eseguita con l'anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3 anticorpi policlonali di coniglio su cromatina tosata da 1 milione di cellule HeLa-S3 seconda delle modificazioni degli istoni. Protocolli ChIP automatizzati con volumi di lavoro 200 microlitri sono stati utilizzati nello strumento di automazione per gli esperimenti di titolazione degli anticorpi. Anticorpo quantità di 1, 2, 5 e 10 mg sono state testate per esperimento ChIP e 2 mg di IgG sono stati usati come controllo negativo in ogni esperimento. Arricchimenti sono stati valutati mediante qPCR. I risultati sono mostrati in% di ingresso (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all'ingresso del DNA dopo l'analisi qPCR). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo la convalida e la determinazione optima l quantità di anticorpi ChIP qualità da utilizzare nel sistema di automazione, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti per generare profili di sequenziamento per ciascuna modifica istoni (Figura 4).

Figura 4. istone profili ChIP-seq generati da esperimenti di ChIP-seq automatizzati. La figura mostra i profili ChIP-seq in diverse regioni genomiche per H3K4me3, H3K9ac e H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 e H3K36me3. 4A mostra la distribuzione picco lungo l'intero X -chromosome e 4B la distribuzione in una regione di 75 kb circostante il gene GAPDH. 4C mostra i profili di H3K27me3, H3K36me3 e H3K4me3 in una regione 500 kb circostante il gene MYT1 e 4D mostra la distribuzione di H3K9me3 in un ZNF12 circostante 200 kb regione.large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Istoni profili epigenetici per sei diverse modificazioni degli istoni associati con l'espressione genica sono stati generati (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 e H3K36me3). La figura 4A mostra profili ChIP-seq lungo il cromosoma X per i diversi marcatori degli istoni. La correlazione altamente picco osservato tra i 6 differenti profili istoni indica le capacità del sistema automatizzato per generare dati precisi e affidabili. Figura 4B, 4C e 4D mostrano la distribuzione dei picchi di diverse modificazioni degli istoni in specifiche regioni genomiche.

Automatizzati esperimenti cromatina immunoprecipitazione giù a 200 cellule

La quantità minima di cellule che possono essere utilizzati in esperimenti di ChIP dipende dalla qualità della cromatina, la specificity e la sensibilità degli anticorpi e l'abbondanza della modifica degli istoni o proteine ​​studiate. Selezione buone anticorpi grado ChIP-seq è importante quando si lavora con quantità limitate di campione e la selezione dei reagenti ottimali e diversi vettori migliora l'efficienza del recupero di DNA e contribuire al successo dell'esperimento chip. Per determinare l'importo minimo di cellule che il protocollo ChIP automatizzato in grado di elaborare, diverse quantità di cromatina, anticorpi, e sfere magnetiche sono stati testati nel sistema automatizzato IP-Star utilizzando reagenti ChIP specificamente ottimizzati per funzionare con basse quantità di cromatina.

Innanzitutto, cromatina da 10.000 cellule è stato sonicato come descritto nel protocollo. I risultati sono stati confermati da ChIP qPCR (Figura 5A) che mostra arricchimenti significativi con H3K4me3 anticorpi nelle regioni di controllo positivo e il segnale trascurabile nelle regioni di controllo negativo. Per il confronto e la prova di coerenza, additionadati ottenuti con l H3K27ac, H3K9me3, e anticorpi H3K27me3, con 10.000 cellule è fornito.

Esperimenti ChIP automatizzati sono stati eseguiti poi per dimostrare le capacità del sistema automatizzato per lavorare con basse quantità di celle utilizzando lo stesso anticorpo H3K4me3. Il chip automatizzato eseguito bene, dimostrata da una serie di dieci reazioni IP che erano riproducibili e altamente paragonabili ai risultati ChIP manuali (Figura 5B). Esperimenti manuali e automatizzati sono stati eseguiti e benefici dei protocolli automatici sono stati visti nel ridurre esperimento per sperimentare la variabilità (Figura 5C).

Figura 5. Ottimizzazione del chip e Auto ChIP esperimenti su 10.000 cellule sono stati eseguiti esperimenti di ChIP manuali su 10.000 cellule e con 0,25 mg di H3K4me3, 0,1 mg di H3K27ac, 0,5 mg di H3K9me3 e 0,25 mg di anticorpi H3K27me3. Quantitativi identici di IgG di coniglio sono stati usati come controllo. La qPCR è stata eseguita con primer per due loci positive e due loci negativo per ogni saggio ChIP. La Figura 5A mostra il recupero, espressa come percentuale di input (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all'ingresso del DNA dopo analisi qPCR). Figura 5b mostra 10 reazioni ChIP eseguiti sul IP-Star Compact con 0,25 mg H3K4me3 policlonale e 0,25 mg di IgG di coniglio anticorpo di controllo come negativo. Poi è stata effettuata l'analisi qPCR con primer per il positivo promoter loci EIF4A2 e GAPDH TSS e il negativo exon2 loci mioglobina e Sat2. La figura mostra il recupero, espressa come percentuale di ingresso (quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all'ingresso del DNA dopo analisi qPCR). La Figura 5C illustra dati H3K4me3 piastrina di 10 esperimenti ChIP manuali in confronto al 10 esperimenti ChIP automatizzati. Barre di errore rappresentano s deviazioni tandard di ciascuna delle dieci repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per comprendere la sensibilità dei protocolli ChIP automatizzati, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una quantità di cellule che variava da 100.000 fino a 200 cellule per IP. L'anticorpo anti-H3K27me3 stato usato in quanto è una modifica molto comune istoni. L'uso di altri anticorpi istone o non-istoni può richiedere cellule più o meno, a seconda l'abbondanza dell'epitopo e la qualità dell'anticorpo. Gli esperimenti sono stati convalidati mediante PCR quantitativa e si è osservato che, riducendo quantità di perline e sfondo anticorpi negli esperimenti è ridotto permettendo successo risultati ChIP-qPCR con soli 200 cellule anticorpo (Figura 6).

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Figura 6. automatizzato test chip su 200 cellule. Cellule Hela-S3 e anticorpi diretti contro H3K27me3. La cromatina è stata tosata da 1 milione di cellule e diluizioni seriali di questo cromatina (da 100.000 a 200 equivalenti cellule) sono stati utilizzati per reazione chip. 1 mg di H3K27me3 e 10 ml di proteine ​​sfere magnetiche A rivestite sono stati utilizzati in esperimenti 100.000 cellule, 0,5 mg di H3K27me3 e 10 ml di perline su 10.000 e 1.000 celle, e 0,25 mg di H3K27me3 e 5 ml di perline con 500 e 200 cellule. 1 mg e 0,5 mg di IgG di coniglio sono stati utilizzati come anticorpo di controllo negativo durante l'esecuzione di esperimenti con 100.000 celle e 1.000 cellule rispettivamente. 6A mostra l'occupazione di TSH2B e GAPDH geni in% su ingresso. 6B mostra occupazione relativa del TSH2B rispetto ai controlli GAPDH negativo regione genomica.

Analisi valle dei risultati ChIP-seq su10.000 cellule

Al fine di valutare la qualità globale degli esperimenti ChIP-seq automatizzato con i numeri di partenza bassi di cellule, automatizzati sono stati eseguiti saggi ChIP-seq con 0,25 mg dell'anticorpo H3K4me3 su 10.000 cellule HeLa ed esperimenti Chip On sono stati utilizzati 100.000 cellule HeLa-S3 come controllo positivo per l'esperimento. Le librerie automatizzate sono state utilizzate le biblioteche Microplex kit di preparazione reagenti adeguati alle biblioteche preparati con basse quantità di DNA. Si noti che, anche se è possibile eseguire con successo chip esperimenti automatizzati con meno di 10.000 cellule, gli importi dei tirato giù DNA non saranno sufficienti per preparare librerie utilizzando i reagenti del kit. Generazione Cluster e sequenziamento sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. La bioinformatica analizza dopo i sequenziamento mostrano ottimi risultati a partire dal numero di cellule campioni a bassa chip. Il set di dati 30 pg (corrispondenti a 10.000 cellule del materiale di partenza ) Contengono basso rumore di fondo e picchi di arricchimento altamente affidabili confermati sia dal 300 pg dataset (corrispondenti a 100.000 cellule del materiale di partenza) e il set di dati H3K4me3 generato dal Broad Institute del progetto ENCODE che è stato utilizzato come riferimento esterno. È importante notare i dati Top rapporto di sovrapposizione 40, che si riferisce ad un metodo standard utilizzato nel progetto ENCODE ^11, in cui il chip-seq è considerata riproducibile se si confrontano i due insiemi di dati esiste almeno una sovrapposizione 80% dei migliori 40% dei picchi ordinati per punteggio significato. Il set di dati di 30 pg soddisfa questi criteri rispetto sia al 300 pg dataset (considerando tutte le sue vette, non solo il migliore del 40%) ei dati Broad Institute (Tabella 1). Il set di dati di 300 pg mostra picchi quasi identici ai dati Broad Institute con Top rapporto di sovrapposizione 40 98% (Figura 7).

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Figura 7. saggi Chip e generazione biblioteca 10.000 cellule esperimenti ChIP-seq sono stati generati su 10.000 e 100.000 cellule HeLa-S3 utilizzando H3K4me3 anticorpi (0,25 mg / mL). Le 35 etichette bp sono stati mappati al genoma umano con la mascherina ELAND. Durante la successiva picco chiamando SICER potrebbe attendibilmente identificare i arricchimenti dal numero di cellule bassi così come da milioni di cellule. I set di dati sono stati analizzati e confrontati tra loro e ai dati di riferimento generati dal Broad Institute. I campioni di cellule bassi sono coerenti e abbia una grande somiglianza. Il campione 30 pg soddisfa il criterio ENCODE ¹¹ (min. 80% della top 40% dei picchi deve sovrapporsi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1.

Discussione

Immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento è ormai una procedura standard. Qui un protocollo ChIP-seq automatizzata in grado di generare profili epigenetici cromatina con solo 10.000 cellule del materiale di partenza è presentato.

Automatizzare Chip e preparazione biblioteca test consente la standardizzazione della procedura di ottimizzazione di chip e ridurre la variabilità sperimentale. Il sistema di gestione dei liquidi presentato qui elimina molte delle procedure manuali associati ChIP riducendo le mani in tempo per appena 30 minuti, riduce al minimo la perdita di campione, e consente accurate ChIP-seq con pochi picogrammi di ingresso biblioteca. Al fine di raggiungere gli esperimenti riusciti ChIP-seq automatizzati, è anche fondamentale utilizzare di alta qualità preparati cromatina tranciati e anticorpi grado ChIP-seq in ogni esperimento Il sistema utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e offre flessibilità per modificare i principali parametri sperimentali come incubazione tempo per il cappotto anticorpiing e passaggi di immunoprecipitazione o modifica delle condizioni di lavaggio che consentono al ricercatore di condurre tutti gli esperimenti necessari per l'ottimizzazione ChIP-seq. Il sistema automatizzato è una piattaforma "aperta" che permette anche il confronto di più reagenti in parallelo per l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali per ciascuna linea cellulare individuale e anticorpi e consente un confronto diretto dei vari tipi e concentrazioni di cromatina, anticorpi diversi e anche diversi tipi di magnetica perline.

Uno dei limiti del sistema automatizzato è la necessità di automatizzare tutti i protocolli in volumi che vanno da 5 microlitri di 200 microlitri. Tuttavia, la miniaturizzazione degli esperimenti in questa piattaforma automatizzata consente inoltre di risparmiare sui costi di reagenti.

Oltre ai protocolli descritti in questo studio, il sistema è adattabile e anche automatizza una varietà di altre applicazioni basate branello magnetico come un immunoprecipitazionend cattura di DNA metilato (tecnologie MeDIP e MethylCap), immunoprecipitazione di DNA hydroxylmethylated (hMEDIP), immunoprecipitazione della cromatina sequenziale (ReChIP), RNA immunoprecipitazione (RNA-IP), la conversione bisolfito, e saggi di purificazione del DNA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PBS	Life technologies	14190-094
Tripsina-EDTA	Sigma	T3924-100ML
Formaldeide 37%	Sigma	F8775-25
1.25 M Soluzione di glicina	Diagenode	C01020010	Componente del kit ChIP-seq ideale
Tampone di lisi iL1	Diagenode	C01020010	Componente del kit ChIP-seq ideale
Tampone di lisi iL2	Diagenode	C01020010	Componente del kit ChIP-seq ideale
Tampone di taglio iS1	Diagenode	C01020010	Componente del kit ChIP-seq ideale
Mix di inibitori della proteasi (200x)	Diagenode	C01010130	Componente del kit Auto True Micro ChIP
HBSS (senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo)	Life technologies	14175-053
Tampone di lisi tL1	Diagenode	C01010130	Componente del kit Auto True Micro ChIP ChIP
Buffer ChIP tC1	Diagenode	C01010130	Componente del kit Auto True Micro ChIP
kit ideale ChIP-seq Kit	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	Componente del kit Auto Histone ChIP-seq
Kit Auto Histone ChIP-seq	Diagenode	C01010020
Kit Auto True Micro ChIP	Diagenode	C01010130
Anticorpo policlonale H3K79me3-Anticorpo policlonale Classic	Diagenode	C15310068
H3K27me3-Anticorpo policlonale Classic	Diagenode	C15410069
H3K4me3-Anticorpo policlonale Classic	Diagenode	C15410030
Anticorpo policlonale H3K4me2-Classic	Diagenode	C15410035
Anticorpo policlonale H3K9ac-Premium	Diagenode	C15410004
Anticorpo policlonale H3K9/14ac-Premium	Diagenode	C15410200
Anticorpo policlonale H3K36me3-Premium	Diagenode	C15410058
Anticorpo policlonale H3K9me3-Premium	Diagenode	C15410193
Rabbit IgG	Diagenode	C15410206
Perle paramagnetiche rivestite di proteina-A	Diagenode Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
colonne MicroChIP DiaPure	Diagenode	C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1,25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Illumina Kit di preparazione del campione per DNA genomico	Illumina	FC-121-3001
Kit Illumina True-seq Kit di preparazione della libreria ChIP	Kit	IP-202-1012
preparazione della libreria MicroPlex	Diagenode	C05010010
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
Kit di quantificazione per la preparazione della libreria Illumina	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star Compact  Sistema automatizzato	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit system	Invitrogen	Q32857
Illumina Hiseq systems	Illumina