Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.
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Articolo metodologico
Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umane pluripotenti indotte (cellule staminali hiPSCs) possono essere generati con le metodologie di riprogrammazione basata lentivirali-. Tuttavia, tracce di geni potenzialmente oncogeni rimanenti nelle regioni attivamente trascritti del genoma, limitano il loro potenziale per l'uso in applicazioni terapeutiche umani 1. Inoltre, antigeni non umani derivanti dalla riprogrammazione di cellule staminali o di differenziazione in derivati terapeuticamente rilevanti escludono questi hiPSCs vengano utilizzati in un contesto clinico umano 2. In questo video, vi presentiamo una procedura per la riprogrammazione e l'analisi hiPSCs senza fattore gratuitamente transgeni esogeni. Questi hiPSCs poi possono essere analizzati per alterazioni di espressione genica nel introne specifica l'lentivirus. Questa analisi può essere condotta utilizzando sensibile reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR), che ha un vantaggio rispetto meno sensibili tecniche precedentemente utilizzato per rilevare le differenze di espressione genica 3. La conversione completa inbuone prassi di fabbricazione clinica-grade (GMP) condizioni, permette di rilevanza clinica umana. Il nostro protocollo offre un altro metodo, a condizione che i criteri esenti attuali espandere e comprendono caratterizzati derivati basati hiPSC senza fattore di applicazioni, ad terapeutiche umane derivanti hiPSCs GMP-grade, che dovrebbero eliminare qualsiasi rischio di immunogenicità a causa di antigeni non-umani. Questo protocollo è ampiamente applicabile per lentivirali riprogrammato cellule di qualsiasi tipo e fornisce un metodo riproducibile per la conversione di cellule riprogrammate in condizioni di GMP-grade.
Introduzione
Le cellule umane adulte hanno dimostrato di essere in grado di subire rimodellamento e riprogrammazione epigenetica, come risultato dell'espressione lentivirale di quattro fattori di trascrizione chiave4,5. Un importante progresso nel campo della riprogrammazione è stato l'uso di una singola cassetta di cellule staminali lentivirali essociabili (STEMCCA), che ospitava tutti e quattro i fattori di trascrizione di riprogrammazione che consentivano un preciso rapporto stechiometrico di espressione proteica6. Inoltre, quando trasdotta in una specifica molteplicità di intervalli di infezione, STEMCCA può portare a eventi di integrazione genomica prevalentemente singoli durante il processo di riprogrammazione7. L'introduzione di una versione accisabile di STEMCCA, che utilizza la tecnologia Cre/loxP seguita dall'escissione del vettore di riprogrammazione dopo la derivazione della linea di cellule staminali, ha permesso di derivare linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di fattori8. Inoltre, al fine di migliorare le applicazioni terapeutiche delle hiPSC, era necessario implementare una metodologia nuova, rapida e facilmente applicabile per la conversione di linee cellulari di grado GMP (Good Manufacturing Practice), da condizioni contenenti xeno a condizioni prive di xeno. Qui, discutiamo una metodologia pertinente che valuta in modo più preciso le differenze di espressione genica integrata, in particolare quando integrata in un introne, e la conversione cellulare di livello clinico in condizioni GMP putative.
Ricerche precedenti hanno utilizzato solo l'analisi trascrizionale microarray relativamente insensibile per analizzare le differenze di espressione genica nei geni integrati dopo la trasduzione STEMCCA3,9. Qui, introduciamo la metodologia dell'analisi quantitativa sensibile della reazione a catena della polimerasi (PCR), per esaminare ulteriormente le differenze di espressione genica integrata. È importante sottolineare che gli attuali criteri di approdo sicuro scartano le hiPSC che hanno geni con integrazioni virali, limitando così l'applicabilità di queste cellule per le terapie cellulari umane a valle9. Proponiamo che lo status quo possa cambiare con l'uso di hiPSC riprogrammate intronicamente completamente caratterizzate e prive di transgeni. Inoltre, introduciamo un robusto protocollo di conversione cellulare di grado GMP che può essere facilmente applicato a una varietà di tipi di cellule diverse, originariamente derivate in condizioni contenenti xeno10. Ciò offre opportunità significative per lo sviluppo di futuri esperimenti di riprogrammazione cellulare, che richiedono condizioni di livello clinico per mantenere la rilevanza terapeutica umana.
Queste metodologie forniscono una base su cui gli attuali criteri di approdo sicuro possono essere ampliati per includere linee hiPSC riprogrammate STEMCCA caratterizzate che mantengono un profilo di espressione genica normale dopo l'escissione di STEMCCA dall'introne integrato. Inoltre, la conversione completa in condizioni cliniche, prive di antigeni animali non umani, aiuterà a incorporare molti più tipi di cellule, che sono state precedentemente riprogrammate e caratterizzate solo in condizioni contenenti xeno. Queste metodologie, combinate, sono motivi convincenti per la Food and Drug Administration (FDA) statunitense per prendere in considerazione l'estensione della loro approvazione limitata dalle terapie basate su cellule staminali embrionali umane (ESC) alle terapie basate su hiPSC11.
Abbiamo recentemente dettagliato la derivazione di una linea hiPSC priva di fattori che è stata completamente caratterizzata e convertita in condizioni di grado clinico putativo10. Qui, dettagliamo il protocollo per la derivazione di hiPSC utilizzando il lentivirus STEMCCA. Queste cellule staminali subiscono quindi un processo di escissione seguito da caratterizzazione dell'espressione genica. Infine, le hiPSC vengono convertite in condizioni di grado GMP mediante una metodologia di conversione lenta.
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Protocollo
NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata nel Awe et al 10..
1. Riprogrammazione umano adulto Dermal fibroblasti con STEMCCA
- Fibroblasti dermici Thaw adulti umani (HUFS), di passaggio a 4 o inferiore, in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti, avendo cura di non immergere la parte superiore del flaconcino con l'acqua.
- Posizionare la poltiglia 1 ml di fibroblasti umani in una fiala conica 15 ml e posizionare lentamente 4 ml di supporti HUF standard preriscaldata a 37 ° C, in un modo goccia a goccia, per diluire le dimetil solfossido (DMSO) e risospendere le cellule.
- Centrifugare la fiala a 200 xg per 10 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un volume adeguato di media per creare una sospensione di 100.000 cellule / ml e aggiungere 2 ml in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, pre-rivestito per 20 minuti con 0,2% di gelatina.
NOTA: Una sorella bene con un numero uguale di cellule per linea e condizione deve essere seminato for il conteggio delle cellule / molteplicità di infezione (MOI) di calcolo. - Oscillare la piastra di lato all'altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Il giorno di trasduzione, ottenere conta delle cellule (s) dalla sorella ben (s) circa 24 ore dopo la placcatura HUF iniziale.
- Scongelare 2 x 10 8 TU, o, concentrato lentiviral equivalente (STEMCCA) e portare a 1 x 10 8 TU / ml in HUF media.
- Trasdurre cellule con un rapporto di 10-MOI in HUF multimediale integrato con 8 mg / ml agente trasfezione. Mescolare pozzi trasdotte uniformemente e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale, passare i mezzi di HUF di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) medie standard.
- Nei giorni 2 a 6, cambiare i media quotidiana di media PSC umana.
- Il giorno 6, piatto due 0,2% di gelatina rivestite piatti da 10 cm di1,5-1,75 x 10 6 MEF derivati da CF1 topi in HUF supporti 12.
- Il giorno 7, facendo attenzione a non centrifugare più di 100 grammi, l'uso della temperatura ambiente tripsina per sollevare la giornata 7 fibroblasti riprogrammate da un pozzetto della piastra sei bene e il passaggio ad un rapporto di 01:16, placcando tutte le cellule in modo uniforme tra due piastre 10 cm, con i media PSC umano fresco, che sono stati placcati con MEF il giorno prima. Distribuire aggregati di cellule in un movimento a spirale in senso orario e posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato notte.
- Circa 48 ore dopo la semina le cellule riprogrammate sul MEF e ogni giorno dopo, cambiare fuori trascorsi supporti PSC umani con mezzi freschi.
- Dopo 3 o 4 settimane, prendere le singole colonie con tipico ESC come la morfologia con un ago 21-gauge e subclone fuori in un 24-pozzetti stipulando circa 8 a 10 pezzi singoli di colonie specifiche nei singoli pozzetti in un 0,2% di gelatina rivestita 24 pozzetti pre-seeded con MEF derivate da topi CF1 a medio PSC umana.
NOTA: Dopo l'espansione delle colonie raccolte, le colonie devono essere caratterizzato come pluripotenti dalla formazione corpo embrioide e analisi di espressione di marcatori pluripotenza a livello proteico.
2. Vector Integrazione analisi in loco e STEMCCA Excision
- Analizzare il sito di integrazione STEMCCA da amplificazione lineare non restrittiva PCR come descritto 10.
- Dopo saggiare per garantire una integrazione in una zona desiderata del genoma, STEMCCA accise aspirando il vecchio supporto ESC umana. Poi, unire 45 ml di virus adeno-Cre-PuroR concentrato con 8 mg / ml agente trasfezione in 3 ml di media PSC standard per la 24 ore.
- Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, aspirare il surnatante virale mista e lavare le cellule due volte con i media PSC umani. Inserire supporti PSC umani freschi insieme con 2 ug / ml puromicina per un periodo di 5 giorni, cambiando i media ingegno giornalierah mezzi freschi e antibiotici.
- Dopo 5 giorni, subclone rimanendo colonie con un ago 21-gauge su 0,2% pozzi gelatina rivestite, in un 12-pozzetti pre-rivestito con MEF derivati da CF1mice ed espandere come sopra.
NOTA: Dopo l'espansione sufficiente per ottenere un titolo congelato, è necessaria la conversione in condizioni di assenza di alimentazione. Aspettatevi almeno il 95% la morte colonia di cellule staminali, come la maggior parte delle cellule non saranno trasdotte con successo e si soccombere antibiotico nel periodo di 5 giorni di incubazione. Sebbene adeno-Cre-PuroR integra in un efficienza 0,001-1% in cromosomi di accoglienza delle cellule infette, reexposing un campione di colonie senza fattore di puromicina per assicurare la morte cellulare 100% confermerà nessuna integrazione è verificato 13. - Scongelare una fiala di pre-aliquotati matrice membrana basale su ghiaccio, per un periodo di circa 2 ore (raccomandazioni del produttore) finché la matrice è un liquido e diluire ad una concentrazione finale di 1:30 fredda mezzi basale. Coal numero desiderato di pozzetti in una piastra a sei pozzetti di 1 ml per pozzetto. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Cross-botola (con un ago calibro 18, o un bicchiere di plastica o "punta"), almeno 20 o 30 colonie da un pozzo in precedenza rivestito con MEF. Fare attenzione a ridurre MEF edificante e trasferire dalla piastra.
- Generare il dispositivo tratteggio attraverso un certo numero di approcci differenti, dal riscaldamento più complicato, tirando, e la finitura di una pipetta Pasteur di vetro su una fiamma libera, per il semplice utilizzo di una punta di plastica pipetta sterile o, come nel nostro caso, 21- e / o calibro 18 aghi.
- Aspirare la matrice dal rivestito ben dopo incubazione.
- Togliere i pezzi delle colonie delicatamente raschiando dal vecchio piatto con una pipetta 200 microlitri e posizionare con cura in 3 ml di mezzi freschi combinate 1 nel piatto di matrice rivestita. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato. Cambia i media 48 ore dopo passaging.
- Estratto DNA genomico da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore, a più del 80% di confluenza, con kit di estrazione del DNA commerciale.
- Analizzare per una corretta asportazione con primer specifici per le integrazioni esogeni del lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Ricostituire primer liofilizzati con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 10 micron.
- Eseguire una PCR con il seguente protocollo cinque fasi: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di ciascuno dei seguenti: denaturazione a 98 ° C per 20 sec, ricottura di primer a 62 ° C per 15 sec, ed estensione a 72 ° C per 15 sec; seguito da un singolo ciclo di estensione finale a 72 ° C per 3 min.
- Effettuare un gel di agarosio al 3% in peso su 1,5 g di agarosio e l'immissione in 50 ml di tampone Tris-acetato 1x-EDTA. Forno a microonde fino agarosio è sciolto e posto in gel macchia DNA a pdiluizione Roper, mescolare e dispensare il volume corretto in cassette gel a solidificare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Carico 12 ml di prodotto di PCR mescolato con 3 ml di colorante di caricamento in un gel di agarosio al 3%. Eseguire il gel per 30 minuti a 80 V.
- Visualizza con luce ultravioletta per l'assenza di una banda che indica il corretto escissione.
3. La quantificazione di differenze di espressione genica utilizzando PCR quantitativa di pre e post-hiPSCs asportati
- Estratto RNA totale da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore utilizzando kit di estrazione RNA commerciali.
- Reverse-trascrivere fino a 1 mg di RNA totale utilizzando kit commerciali in conformità con le istruzioni del produttore. Utilizzare ancorato-oligo (dT) 18 e primer esameriche casuali.
NOTA: Assicurarsi che il protocollo PCR è su misura per le trascrizioni gene di più o di meno di 4 kb. Dovranno essere fatti per i qualsiasi gene STEMCCA originariamente integrato primer specificinto. - Ricostituire il primer liofilizzato con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 20 micron.
- Utilizzare 5 ng di campione per 20 microlitri di reazione che consiste di sonda UPL 10 micron, 2x LightCycler 480 Sonde Maestro, e 20 micron avanti e indietro primer.
4. Conversione in condizioni GMP-grade
- Il primo giorno di transizione i hiPSCs post- asportato verso condizioni di GMP-grade, fare una miscela di mezzi composto da PSC umana combinata multimediali 1 (i media combinata 1) e di grado clinico buone pratiche di fabbricazione (GMP) di media compatibile (supporti combinate 2 ) ad un rapporto di 80:20.
- Aspirare off i vecchi media combinato 1 e collocare 3 ml di nuovi media combinati 1 e 2, pre-riscaldato, al rapporto di 80:20. Cambiare i media al giorno per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 4, rendere il supporto combinato 1 e 2 con un rapporto 50:50. Aspirare il vecchio media e soste con i media pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 al rapporto di 50:50. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 7, rendere i media combinata 1 e 2 con un rapporto 20:80. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinati 1 e 2 al rapporto di 20:80. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 10, effettuare i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Cambiare media ogni giorno a questo rapporto specifico. Le cellule sono ora in media liberi-xeno completamente definito. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
NOTA: Durante l'intero processo di conversione, è necessario passaging routine con un ago calibro 18 per mantenere la giusta dimensione delle colonie e la densità. Piano su passaging cellule ogni 4 o 5 giorni sulla base della dimensione delle colonie, confluenza, e differenziazione. - Coat un pozzetto in una piastra a sei pozzetti con un substrato senza xeno definito come raccomandato dal produttore.
- Passaggio meccanicamente un confluente bene, già convertito in-Xeno gratuita condizioni di media, da una piastra di sei bene con un ago 18-gauge. È importante sottolineare che, posizionare nuovi media (supporti combinati 2) sulle cellule con un inibitore ROCK 1x per 1 ora, prima passaging pre-condizione di media.
- Aspirare la soluzione substrato sintetico largo della nuova piastra che le cellule vengono trasferiti. Rimuovere tutti i supporti contenenti i grumi di cellule staminali dal vecchio piatto e trasferimento a nuova piastra.
- Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 2 giorni con il minimo disturbo fisico (idealmente piatti, una volta all'interno dell'incubatrice, non sono direttamente toccati in alcun modo) per una massima attaccamento.
NOTA: Le cellule richiederanno cambiamenti di media al giorno. Passagin continuag ogni 4 giorni saranno importanti. Utilizzando un ago 21-gauge, passaggio solo le parti di colonie con ottima morfologia ESC-like (elevato rapporto nucleocytoplasmic). Ciò garantirà la selezione per le colonie hiPSC corretto che crescerà bene e alla fine produrranno colonie omogenee. Tempo complessivo di derivazione del CES come colonie è tra 15-20 giorni dopo il cambio di supporto iniziale combinato. - Congelare le hiPSCs post- asportato GMP-grade per primo tratteggio incrociato tutte le colonie utilizzando un ago calibro 18. Sollevare tutte le parti fuori utilizzando una pipetta 200 microlitri e trasferire tutti i supporti contenenti le cellule ad una fiala conica 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Mentre le cellule sono centrifugazione, fare un supporto congelamento costituito da volumi uguali di supporto combinato freddo 2 e congelamento media con una concentrazione finale di DMSO del 7,5%.
- Dopo le cellule sono pellettizzati, aspirare off vecchia medio e goccia a goccia risospendere il pellet con i media di congelamento. Immediatamente transfer di fiale congelamento e mettere in un -80 ° C freezer.
5. hiPSCs Characterizing GMP-grade Post-asportati
- Per garantire una corretta espressione dei marcatori pluripotenza post-conversione, utilizzare QPCR per quantificare l'espressione di marcatori pluripotenza chiave (SOX2, OCT4, e Nanog) utilizzando i primer elencati nella tabella 1 con la stessa procedura di cui al punto 3. metodologie QPCR seguire la stessi passaggi elencati al punto 3.
- Utilizzare citometria a flusso per rilevare l'acido non umano sialico Neu5Gc (N acido -glycolylneuraminic) in base a condizioni standard elencati nel kit come precedentemente pubblicato 10.
- Lavare delicatamente le piastre di coltura cellulare con cellule utilizzando PBS 1x (PBS).
- Dissociate colonie utilizzando 1x reagente di dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.
- Durante il tempo di incubazione di 5 minuti di passo 5.4, preparare la soluzione di blocco (disponibile inkit) facendo un 0,5% agente di blocco in ghiacciata PBS.
- Etichettare la seguente serie di tubi per citometria a flusso di analisi: senza macchia; 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) DAPI; Controllo anticorpo 1: 200; Anticorpo primario 1: 200; Anticorpo secondario 1: 200 Donkey Anti-Pollo IgG (H + L); MEF campione; Cellule post-asportato esempio a matrice; e celle su supporto sintetico Campione post-asportato.
- Scuotendo leggermente aggregati di cellule dal punto 5.4 con l'aggiunta di 2 ml di soluzione bloccante e trasferire il contenuto di un tubo da 15 ml. Centrifugare a 80 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule due volte con soluzione bloccante e centrifugare come indicato al punto 5.7.
- Delicatamente risospendere circa 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di soluzione bloccante con il corrispondente volume di diluizione di ciascun anticorpo. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C per 1 ora.
- Ripetere lava tre volte al punto 5.8.
- Risospendere il pellet cellulare in 400 ml di diluente Buffer (dal kit) con 1: 100 di DAPI per tubi 2, 6, 7, e 8 come elencato passo 5.6.
- Cellule filtrare con un colino 40 micron e attraversano citofluorimetro.
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Risultati
Vi presentiamo un protocollo per derivare clinico-grade hiPSCs senza fattore utilizzando l'approccio basato riprogrammazione-lentivirali STEMCCA. La figura 1A mostra un quadro rappresentativo di tre diverse linee di pre-asportato hiPSC, dopo la riprogrammazione con l'approccio STEMCCA su uno strato di MEF. Il vantaggio principale del metodo riprogrammazione STEMCCA risiede nel successo riprogrammazione coerente ottenuto da più scienziati, in diversi gruppi di ricerca e posizioni. Figura 1B
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Discussione
Descriviamo una metodologia di derivazione hiPSCs senza fattore e renderli clinicamente rilevante convertendo queste cellule in condizioni GMP-grade per la differenziazione delle cellule a valle in future terapie umane. Sebbene questo protocollo è ampiamente applicabile ad una varietà di tipi cellulari, abbiamo scelto di riprogrammare fibroblasti dermici umani, a causa della facilità di estrazione dal paziente e la loro applicabilità alle terapie umane personalizzati. Una volta che le limitazioni sono state sanate, per ...
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Dichiarazioni
James A. Byrne (JAB) e Agustin Vega-Crespo ricevono finanziamenti per la ricerca da Fibrocell Science, Inc. JAB è un consulente scientifico per Fibrocell Science, Inc. Nessun altro autore ha interessi concorrenti da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, e Saravanan Karumbayaram (SK) per la loro assistenza nell'esecuzione degli esperimenti di derivazione e caratterizzazione delle iPSC; Aaron Cooper per l'esecuzione degli esperimenti di analisi delle iPSC; Vittorio Sebastiano e Renee A. Reijo Pera per aver diretto gli sforzi iniziali di riprogrammazione; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack e Donald B. Kohn per aver diretto l'istituzione delle strutture GMP dell'UCLA che consentono la conversione e la caratterizzazione di iPSC di grado clinico; Gustavo Mostoslavsky per averci fornito il vettore di riprogrammazione policistronica STEMCCA. Questo lavoro si basa su una collaborazione di ricerca con Fibrocell Science e l'iniziativa CIDMOD (Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives) per generare terapie cellulari personalizzate e sicure. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti dell'Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research dell'UCLA, della Phelps Family Foundation, della Fibrocell Science, Inc. e dell'UCLA CTSI Scholar's Award to JAB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni e reagenti | |||
| DMEM/F12 (terreni basali) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16000044 | |
| Terreno essenziale minimo (MEM) aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillina-streptomicina, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Scongelare a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a &meno; 20 ° C |
| Siero di ricambio knockout | Invitrogen | 10828028 | scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a &meno; 20 ° C |
| Tripsina/EDTA, 0,5% | Invitrogen | 15400-054 | Diluire il brodo fino allo 0,05% in 1x PBS |
| Fattore di crescita dei fibroblasti di base | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Ricostituire a 10 &; g/ml di pasta in albumina sierica bovina allo 0,1% disciolta in 1x PBS e conservare a &meno; 80 gradi C |
| β-mercaptoetanolo | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (matrice della membrana basale) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Diluire il flaconcino madre Matrigel con 10 ml di DMEM/F12 mentre è in ghiaccio per una diluizione 1:2. Aliquot e conservare a &meno; 20 °C. |
| CELLstart (Substrato sintetico) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromicina | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basilea, Svizzera) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/mezzo di congelamento | Lonza (Basilea, Svizzera) | 12-769E | |
| Dimetil solfossido | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatina, da pelle suina | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Produrre brodo allo 0,2% in PBS, autoclavare e conservare a temperatura ambiente. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combina l'integratore 5x con il terreno di base, aliquote e conserva a 4 gradi; C per un massimo di 2 settimane. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Terreno di coltura | Stelo | 05-100-1A | Scongelare a 4 gradi C O/N, aliquotare e conservare a 4 gradi C per un massimo di 2 settimane. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (reagente di dissociazione) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/agente di trasfezione | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12 pozzetti | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| piastre a 6 pozzetti | VWR | 29442-042 | |
| piastre da 10 cm | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| ago calibro 18 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| ago calibro 21 | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Giappone) | ||
| BD FACSDiva Versione 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies e Stemgent | È costituito da parti uguali di mTeSR1 e Nutristem | |
| Terreni combinati 2 | StemCell Technologies e Stemgent | È costituito da parti uguali di TeSR2 e | |
| Nutristem HUF Media | Dulbecco' s Eagle modificato' s medium/F12 [DMEM/F12] integrato con il 10% di siero fetale bovino, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Glutamax e 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 integrato con il 20% di siero sostitutivo knockout, 1x Glutamax, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Primocin, 1x β-mercaptoetanolo e 10 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco' s Eagle modificato' s medio/F12; PBS, soluzione salina tamponata con fosfato. |
Riferimenti
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
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