Method Article

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

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In vivo le interazioni spazio-temporali del patogeno e delle difese immunitarie a livello della mucosa non sono facilmente visualizzabili negli ospiti vertebrati esistenti. Il metodo qui presentato descrive una piattaforma versatile per studiare la candidosi mucosa nei vertebrati vivi utilizzando la vescica natatoria del giovane zebrafish come sito di infezione.

Abstract

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Difesa precoce contro i patogeni delle mucose consiste sia una barriera epiteliale e cellule immunitarie innate. La immunocompetency di entrambi, e la loro intercomunicazione, sono di primaria importanza per la protezione contro le infezioni. Le interazioni di cellule immunitarie innate epiteliali e con un agente patogeno è meglio studiati in vivo, in cui il comportamento complesso si sviluppa nel tempo e nello spazio. Tuttavia, i modelli esistenti non consentono un facile spazio-temporale delle immagini della battaglia con i patogeni a livello della mucosa.

Il modello sviluppato qui crea un'infezione della mucosa con iniezione diretta del patogeno fungino, Candida albicans, nella vescica natatoria di zebrafish giovanile. L'infezione risultante permette imaging ad alta risoluzione di comportamenti epiteliale e innata cellule immunitarie durante lo sviluppo della malattia della mucosa. La versatilità di questo metodo permette di interrogatorio di accoglienza per sondare la sequenza riportata di eventi immunitari che portano a phreclutamento agocyte e di esaminare il ruolo di particolari tipi di cellule e percorsi molecolari nella protezione. Inoltre, il comportamento del patogeno come funzione di attacco immunitario può essere ripreso simultaneamente utilizzando proteine ​​esprimono fluorescente C. albicans. Risoluzione spaziale Aumento della interazione ospite-patogeno è possibile anche utilizzando la tecnica rapida vescica natatoria dissezione descritta.

Il modello di infezione della mucosa descritto qui è semplice e altamente riproducibile, che lo rende uno strumento prezioso per lo studio della mucosa candidosi. Questo sistema può anche essere sostanzialmente traducibile ad altri patogeni mucosali come microbi micobatteri, batteriche o virali che normalmente infettano attraverso superfici epiteliali.

Introduction

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Le infezioni della mucosa possono portare a infezioni del flusso sanguigno pericolose per la vita a causa del danno della barriera epiteliale, che consente agli agenti patogeni di accedere all'ambiente sistemico1,2. Inoltre, le infezioni delle mucose possono anche causare un'immunopatologia significativa anche se contenute esternamente3-5. Il fungo unicellulare commensale Candida albicans è presente nella maggior parte della popolazione nella cavità orale e in altri siti mucosi6-9. Sebbene normalmente contenuti da risposte immunitarie innate e adattative, i difetti immunitari innati e gli interventi medici possono portare a un....

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Protocol

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NOTA: Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH sotto Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocollo A2012-11-03.

1. Zebrafish allevamento a 4 giorni dopo la fecondazione

  1. Raccogliere AB zebrafish, o qualsiasi altra linee transgeniche, entro il primo 3 ore dopo la fecondazione, come mostrato in un altro video 34.
  2. Incubare 120 uova in un 15 centimetri piastre Petri contenenti 150 ml di E3 Media (5 NaCl mm 0,17 mM KCl; 0,33 mm CaCl 2; 0,33 mm MgCl 2; 2 HEPES mM; pH 6.8) con il blu di metilene (0,3 mg / ml fin....

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Results

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Microiniezione nella vescica natatoria posteriori

Il metodo sperimentale qui presentato descrive l'iniezione di una dose costante di C. cellule di lievito albicans nella vescica natatoria di 4 dpf zebrafish. Lavoro precedente con il modello di immersione suggerisce che la risposta immunitaria vescica natatoria a C. albicans è simile a mammiferi mucosa candidosi 32. Qui mostriamo un metodo di infezione modificato che è più semplice, riproducibile e rapida; d.......

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Discussion

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Anticipi e limitazioni della microiniezione modello di malattia vescica natatoria

Il modello qui presentato è un'estensione del modello di immersione mucosa candidosi descritto in Gratacap et al (2013).; aggiunge i vantaggi di un tempo un'infezione controllata, una dose un'infezione altamente riproducibile, e quindi una maggiore efficienza. Dimostriamo qui nuovi metodi che permettono non invasivo documentazione temporale delle dinamiche di infezione in modo molto dettagliat.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori ringraziano il Dr. Le Trinh e Dr. Tobin per generosamente fornire la α-catenina: linea pesce citrino e Bill Jackman per averci permesso di fare le riprese nel suo laboratorio. Gli autori riconoscono le fonti di finanziamento National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Questo manoscritto è pubblicato come principale dell'agricoltura e delle foreste Esperimento numero di pubblicazione Stazione 3371.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette da 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Piastre di Petri profondeFisher Scientific89107-632
Pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-7M
Estratto di lievitoVWR Scientific90000-726
PeptoneVWR Scientific90000-264
DestrosioFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pinzetta fine (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Tasselli in legnoVWR Scientific10805-018
Agarosio a basso punto di fusioneVWR Scientific12001-722
Estrattore per micropipette marrone fiammanteSutter InstrumentsP-97
Capillare borosilicatoSutter InstrumentsBF120-69-10
Sistema di iniezione MPPI-3Strumentazione scientifica applicata Unità diMPPI-3
Strumentazione scientifica applicata Kit
Strumentazione scientifica applicata InterruttoreMPIP
Applied Scientific StrumentazioneFSW
MicromanipolatoreStrumentazione Scientifica ApplicataMM33
Base MagneticaStrumentazione Scientifica ApplicataBase
Tricaina metano solfonatoWestern Chemical Inc.MS-222
Microscopio da dissezioneOlympusSZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Microscopio confocaleOlympusIX-81 con sistema confocale a scansione laser FV-1000
Eppendorf930001007
Provette per colture in vetro (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Bambini argilla (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Blu di metileneVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Piastre di PetriFisher ScientificFB0875712
Emocitometro (
immersione di tipo ABlue Marble Products51935
CentrifugaEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Filo da pescaPiastra
di imaging a 96 pozzetti (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Grasso per alto vuoto (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Vetrino per microvetrini (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Vetrini coprioggetti (18 x 18 mm), n. 1,5VWR Scientific48366-045
Piastra di Petri da 15 cm (plastica Olympus)Genesee Scientific32-106
Glicerolo (prodotti chimici EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
a 24 pozzetti (plastica Olympus)Genesee Scientific25-107
Peso barche (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
contropressione porta micropipette BPU a pedale Magnetica Obiettivo per microscopio 20X Olympus UPlanSApo 20x/0.75 Tamburo a rulli New Brunswick Scientific TC-7 Puntali per pipette Microloader Olio da Piastra di coltura

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the ....

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Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

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