Method Article

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo le interazioni spazio-temporali del patogeno e delle difese immunitarie a livello della mucosa non sono facilmente visualizzabili negli ospiti vertebrati esistenti. Il metodo qui presentato descrive una piattaforma versatile per studiare la candidosi mucosa nei vertebrati vivi utilizzando la vescica natatoria del giovane zebrafish come sito di infezione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Difesa precoce contro i patogeni delle mucose consiste sia una barriera epiteliale e cellule immunitarie innate. La immunocompetency di entrambi, e la loro intercomunicazione, sono di primaria importanza per la protezione contro le infezioni. Le interazioni di cellule immunitarie innate epiteliali e con un agente patogeno è meglio studiati in vivo, in cui il comportamento complesso si sviluppa nel tempo e nello spazio. Tuttavia, i modelli esistenti non consentono un facile spazio-temporale delle immagini della battaglia con i patogeni a livello della mucosa.

Il modello sviluppato qui crea un'infezione della mucosa con iniezione diretta del patogeno fungino, Candida albicans, nella vescica natatoria di zebrafish giovanile. L'infezione risultante permette imaging ad alta risoluzione di comportamenti epiteliale e innata cellule immunitarie durante lo sviluppo della malattia della mucosa. La versatilità di questo metodo permette di interrogatorio di accoglienza per sondare la sequenza riportata di eventi immunitari che portano a phreclutamento agocyte e di esaminare il ruolo di particolari tipi di cellule e percorsi molecolari nella protezione. Inoltre, il comportamento del patogeno come funzione di attacco immunitario può essere ripreso simultaneamente utilizzando proteine ​​esprimono fluorescente C. albicans. Risoluzione spaziale Aumento della interazione ospite-patogeno è possibile anche utilizzando la tecnica rapida vescica natatoria dissezione descritta.

Il modello di infezione della mucosa descritto qui è semplice e altamente riproducibile, che lo rende uno strumento prezioso per lo studio della mucosa candidosi. Questo sistema può anche essere sostanzialmente traducibile ad altri patogeni mucosali come microbi micobatteri, batteriche o virali che normalmente infettano attraverso superfici epiteliali.

Introduction

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Le infezioni della mucosa possono portare a infezioni del flusso sanguigno pericolose per la vita a causa del danno della barriera epiteliale, che consente agli agenti patogeni di accedere all'ambiente sistemico1,2. Inoltre, le infezioni delle mucose possono anche causare un'immunopatologia significativa anche se contenute esternamente3-5. Il fungo unicellulare commensale Candida albicans è presente nella maggior parte della popolazione nella cavità orale e in altri siti mucosi6-9. Sebbene normalmente contenuti da risposte immunitarie innate e adattative, i difetti immunitari innati e gli interventi medici possono portare a una grave candidosi della mucosa. L'assalto alla barriera epiteliale si traduce in un aumento del rischio di malattia disseminata pericolosa per la vita e immunopatologia, come nel caso della candidosi vulvo-vaginale, inoltre la colonizzazione da C. albicans è stata collegata all'omeostasi immunitaria polmonare10,11. La candidosi disseminata è ora la quarta infezione del flusso sanguigno più comune nelle unità di terapia intensiva12 e la mortalità fino al 40% la rende una delle principali preoccupazioni. A causa dell'aumento dei trattamenti immunomodulatori per i pazienti con malattie autoimmuni, cancro o trapianti d'organo, è imperativo comprendere l'interazione tra questo patogeno e il compartimento immunitario della mucosa.

La maggior parte dei progressi biologici cellulari riguardanti le interazioni C. albicans-cellula a livello della mucosa provengono da modelli in vitro13-15 e murini16-18. Entrambi questi approcci presentano vantaggi distinti, ma la capacità di visualizzare cellule vive ad alta risoluzione in un ospite intatto ha limitato la caratterizzazione temporale e spaziale dell'infezione. Per questi studi, c'è la necessità di un modello in vivo in cui l'interazione tra patogeno, cellule immunitarie innate ed epiteliali possa essere visualizzata in un ospite vertebrato intatto.

Il pesce zebra è emerso come uno strumento inestimabile per la comprensione delle malattie umane, principalmente grazie alla sua trasparenza e alla possibilità di manipolare geneticamente. Lo sviluppo delle cellule e degli organi è stato ripreso in modo squisitamente dettagliato, il che ha portato alla descrizione di nuovi comportamenti delle cellule immunitarie, come il comportamento delle cellule T nel timo19 in via di sviluppo o la battaglia tra micobatteri intracellulari e fagociti20-22. Lavori recenti hanno descritto le interazioni microbico-ospite intestinale nel pesce zebra e hanno dimostrato che la colonizzazione microbica del tratto intestinale influenza la fisiologia intestinale dell'ospite e la resistenza ad altre infezioni23,24. Inoltre, è stata descritta un'infezione attraverso l'epitelio intestinale per diversi agenti patogeni.

A differenza del tratto intestinale, la vescica natatoria rappresenta un modello di mucosa più isolato e complementare. Questo organo è un'estensione del tubo intestinale in via di sviluppo e si forma anteriormente al fegato e al pancreas25,26. Produce tensioattivo, muco e peptidi antimicrobici27,28 e anatomicamente, oltre che ontogeneticamente, questo organo è considerato un omologo del polmone dei mammiferi29,30. Poiché il condotto pneumatico rimane collegato all'intestino nel pesce zebra, ciò consente l'infezione da immersione in modo naturale. Sorprendentemente, le uniche infezioni naturali conosciute dei pesci con le specie di Candida sono le infezioni da C. albicans nella vescica natatoria31. Recentemente abbiamo descritto un modello sperimentale di infezione da immersione in cui C. albicans infetta la vescica natatoria e abbiamo scoperto che questa infezione ricapitola alcuni dei segni distintivi dell'interazione C. albicans-epiteliale in vitro32,33.

Nel metodo qui presentato, il modello originale di infezione da immersione viene migliorato iniettando direttamente C. albicans nella vescica natatoria di 4 giorni dopo la fecondazione (dpf) zebrafish. Ciò consente un controllo temporale preciso dell'infezione e un inoculo altamente riproducibile. Consente un imaging intravitale dettagliato, insieme alla versatilità del modello zebrafish. Come esempio di ciò che può essere fatto con questo metodo, presentiamo le dinamiche spazio-temporali della crescita di C. albicans insieme al reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione. Poiché il tessuto della vescica natatoria del pesce zebra è difficile da visualizzare intravitalmente, presentiamo anche una tecnica di dissezione rapida della vescica natatoria che migliora il segnale di fluorescenza e la risoluzione microscopica. Questi metodi ampliano la cassetta degli attrezzi per la ricerca fungina, immunologica e dell'acquacoltura, oltre a descrivere una nuova via di infezione che può essere tradotta per modellare altre infezioni fungine, batteriche o virali delle superfici mucose.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH sotto Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocollo A2012-11-03.

1. Zebrafish allevamento a 4 giorni dopo la fecondazione

  1. Raccogliere AB zebrafish, o qualsiasi altra linee transgeniche, entro il primo 3 ore dopo la fecondazione, come mostrato in un altro video 34.
  2. Incubare 120 uova in un 15 centimetri piastre Petri contenenti 150 ml di E3 Media (5 NaCl mm 0,17 mM KCl; 0,33 mm CaCl 2; 0,33 mm MgCl 2; 2 HEPES mM; pH 6.8) con il blu di metilene (0,3 mg / ml finale concentrazione) in un incubatore a 33 ° con 12/12 luce / buio fotoperiodo.
  3. Sostituire la media dopo 6 ore con E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, 10 mg / ml concentrazione finale) e rimuovere le uova morti.
  4. Incubare per 4 giorni a 33 ° C, lo scambio dei mezzi con fresca E3 + PTU dopo 2 giorni.

2. Inproiezione Micro-ago Preparazione

  1. Estrarre borosilicato capillare (OD 1,2 millimetri; ID 0,69 millimetri) in un micro-ago con un estrattore ago con le seguenti impostazioni (550 Calore, 0 Pull, 130 Velocity; 110 Time).
    NOTA: Le impostazioni variano da filamento a filamento per ottenere micro-aghi di forma simile (vedi Figura 1) e dovrà essere riadattato ogni volta che viene installato un nuovo filamento.
  2. Riempire un micro-ago con 3 ml di 0,4 micron filtrata salina tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mm KH 2 PO 4; pH 7.4) con un 20 microlitri microloader pipetta tip.
  3. Impostare il micro-ago su un supporto micropipetta su un micromanipolatore collegata ad un sistema di iniezione a pressione. Impostare la pressione di iniezione a 30 PSI e la durata dell'impulso a 30 msec.
  4. Utilizzando una piastra di Petri con acqua distillata, abbassare il micro-ago fino a 1/5 dell'ago è nell'acqua. Agganciare il micro-ago with pinzette sottili appena sotto il livello dell'acqua. Portare il micro-ago fuori dall'acqua e spingere il pedale più volte fino a visualizzare un bolo.
  5. Misurare il diametro del bolo abbassando il micro-ago su un emocitometro strati con una goccia di tipo A olio per immersione. Regolare la durata dell'impulso per ottenere il volume desiderato (vedi tabella 1).
  6. Impostare la contropressione per il bolo di rimanere stabile in olio (abbassare la pressione se il bolo aumenta il volume e aumentare la contropressione se il volume di bolo diminuisce). Registrare la durata dell'impulso per ogni micro-ago.
  7. Rimuovere la PBS dal micro-ago aspirando usando un puntale microloader ed espellere la sinistra-over PBS ponendolo nuovamente l'iniettore e lanciando l'interruttore di impulso continuo. Prenotare ogni micro-ago.

3. Candida Preparazione

  1. Streak Candida albicans trasformate con codone ottimizzato dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRed da uno stock congelati (-80 ° C magazzino in 25% glicerolo) utilizzando un bastoncino di legno su una sterile destrosio lievito peptine (YPD) piastra di agar (10 g estratto / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio , 20 g / L di agar, autoclave e versò 25 ml in piastre di Petri) e incubare una notte a 30 ° C.
  2. Scegliere una colonia utilizzando un bastoncino di legno sterile e inoculare 5 ml di liquido YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio, autoclavato e asetticamente aliquotato in 5 ml di 16 x 150 mm coltura vetro tubi).
  3. Incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo a rulli a 60 rpm.
  4. Raccogliere 1 ml di C. cultura albicans e il trasferimento in un 1,7 ml provetta da centrifuga sterile.
  5. Centrifugare a 5.000 g per un paio di secondi. Svuotare il surnatante e aggiungere accuratamente 1 ml di PBS sterile, vortice. Ripetere due volte.
  6. Contare le colonie usando un emocitometro diluendo 1 ml di brodo 1: 1000 in PBS sterile.

4. Iniettare Zebrafish inla vescica natatoria

  1. Riscaldare un piatto di iniezione (2% agarosio) per 30 min in un incubatore a 33 °.
  2. Al tempo desiderato, rimuovere il 100 dei 150 ml di E3 + PTU dalla piastra Petri 15 centimetri contenente il pesce per iniettare utilizzando una pipetta 25 ml senza aspirare alcun zebrafish.
  3. Anestetizzare 4 dpf zebrafish aggiungendo 2 ml di un / ml tamponato tricaine metano sulfonato magazzino 4 mg (TR) per i 50 ml supporti rimanenti (concentrazione finale di 200 mg / ml) e attendere 15 min.
  4. Sotto un microscopio da dissezione, selezionare il pesce con una vescica natatoria gonfiato. Pesce può anche essere proiettato in quel momento per fenotipo omogeneo, come la distribuzione dei neutrofili in mpo: linea GFP utilizzando un epifluorescenza dissezione microscopio.
  5. Diluire il C. albicans magazzino dalla sua concentrazione iniziale (fase 3.8) a 1,5 x 10 7 unità formanti colonia per ml (ufc / ml) in PBS.
  6. Trasferire 30 zebrafish sul piatto di iniezione con un tubo di plastica di trasferimentotte e rimuovere il supporto in eccesso.
  7. Utilizzando uno strumento di pesca-wire (0,012 pollici di diametro filo da pesca super-incollato in un capillare borosilicato), fare 3 linee di 10 pesci, tenendo il piatto iniezione verticale e orientare il pesce in verticale.
  8. Togliere la carta in eccesso.
  9. Vortice accuratamente il tubo con 1,5 x 10 7 CFU / ml C. albicans.
  10. Riempire un micro-ago con 3 ml di C. albicans utilizzando una nuova punta microloader pipetta e impostare la durata dell'impulso per l'impostazione appropriata (vedere il punto 2.9).
  11. Ruotare il piatto iniezione per formare un angolo di 20 ° tra il micro-ago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria (Figura 3A).
  12. Premere il micro-ago nella vescica natatoria, assicurandosi che il foro dell'ago sia nel lume, e premere il pedale una volta.
  13. Ripetere l'operazione per ogni pesce e trasferire a un piatto di recupero (25 ml E3 + PTU) inondando il piatto con un E3d svuotamento nel piatto di recupero.
  14. Trasferire altri 30 pesce al piatto iniezione.
  15. Ripetere l'iniezione con un nuovo micro-ago riempito con fondo in agitazione C. albicans.
  16. Fine iniettando controllo PBS, se necessario, usando un piatto diversi di iniezione per evitare la contaminazione e versare in un piatto di recupero separato (passo 4.10).

5. Screening il pesce per desiderata Inoculum

  1. Preparare 40 ml di 0,4% bassofondente soluzione di agarosio (LMA) aggiungendo 160 mg di agarosio a basso punto di fusione 40 ml di E3, in ebollizione da microonde fino a completa dissoluzione e raffreddamento a 37 ° C. Aggiungere 400 ml di TR (concentrazione finale di 200 mg / ml), una volta raffreddato.
  2. Dopo 30 min di recupero, anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 mL E3 + PTU, concentrazione finale 200 mg / ml).
  3. Trasferimento 30 pesci (con il minor numero possibile di mezzi) a 2 ml di LMA in una barca di peso.
  4. Aspirare singoli pesci con una pipetta di trasferimento e piatto il pesce con 1 goccia di LMA in una piastra di imaging a 96 pozzetti, utilizzando solo i 10 x 6 pozzi centrali.
  5. Ripetere fino a quando tutti i pesci di schermo vengono caricati alla piastra di imaging.
  6. Ai media solidificano a temperatura ambiente per 5 min.
  7. Posizionare il pesce dalla loro parte, facendo in modo che siano a contatto con il fondo di vetro.
  8. Usando l'obiettivo 20X su un epifluorescenza / microscopio confocale invertita e il filtro appropriato, registrare il numero di C. cellule di lievito albicans in vescica natatoria di ogni pesce.
  9. Selezionare il pesce con 15-25 cellule di lievito nella vescica natatoria (o inoculo desiderato), eutanasia non selezionata pesce (800 ug / ml di TR in E3) e ritornare pesci selezionato in un piatto profondo Petri con 50 ml di E3 + PTU by aggiungendo 3 gocce di E3 alla piastra di imaging pozzetti selezionati ed aspirando il pesce con una pipetta di plastica trasferimento.
  10. Incubare a 33 ° C per la durata desiderata.

6. Imaging the Fish post-selezione

  1. Al momento desiderato, eliminare 25 dei 50 ml di media E3 + PTU dalla capsula di Petri profondo contenente il pesce di immagine.
  2. Anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 ml E3 + PTU rimanente, la concentrazione finale di 200 mg / ml).
  3. Piatto il pesce in un piatto di imaging 96-bene e la posizione in modo appropriato (passi 5,3-5,7).
  4. Immagine di scansione microscopia confocale utilizzando i laser appropriati e filtri di emissione. Prima concentrarsi sul pesce con l'obiettivo 4X in contrasto interferenziale differenziale (DIC) e di acquisire immagini della regione di interesse utilizzando l'obiettivo 20X con i laser confocale in modalità di scansione con 2 velocità msec / pixel e 1024 x 600 pixel aspect ratio. Acquisire Z-stack con 1 micron dimensione del passo, applicando modalità filtro Kalman di 3 fotogrammi.
  5. Ritorno a un piatto fondo di Petri con 50 ml E3 + PTU o in individuapozzi l (piatto 24 pozzetti cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubare a 33 ° C.

7. Dissecting la vescica natatoria

  1. Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto.
  2. Preparare una LMA 2% (passo 5,3 con 160 mg di bassa fusione agarosio in 8 ml di E3).
  3. Al momento desiderato, anestetizzare il pesce (fase 5.2).
  4. Trasferire 10 pesci in una provetta 1,7 ml centrifuga con 1 ml di E3 e euthanize aggiungendo 200 ml di 4 mg / ml Tricaine (concentrazione finale 800 mg / ml) al tubo da centrifuga e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente.
  5. Preparare un vetrino di imaging ponendo 4 gocce di grasso per vuoto in un quadrato, distanti 1 cm su un MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2).
  6. Mettere 2 gocce di 2% LMA nel centro della piazza.
  7. Posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore ha smesso di battere, rimuovere l'acqua in eccesso.
  8. con una pinzetta belle sezionare il vescica natatoria mantenendo la testa in una posizione fissa con le pinze sinistra e tirando giù l'intestino anteriore con le pinzette destra (Figura 4A).
  9. Sollevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico con le pinzette sinistra, separandolo dal tratto digerente, e posizionarlo al centro della LMA 2% prima che solidifica.
  10. Inserire una copertura antiscivolo (18 x 18 mm) sulla parte superiore del vetrino imaging e spingerla fino a toccare il grasso per vuoto, nonche la LMA (Figura 2).
  11. Immagine entro 10 minuti di dissezione, come descritto al punto 6.4. Ripetere il passaggio 7,7-7,11 con gli altri pesci.

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Results

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Microiniezione nella vescica natatoria posteriori

Il metodo sperimentale qui presentato descrive l'iniezione di una dose costante di C. cellule di lievito albicans nella vescica natatoria di 4 dpf zebrafish. Lavoro precedente con il modello di immersione suggerisce che la risposta immunitaria vescica natatoria a C. albicans è simile a mammiferi mucosa candidosi 32. Qui mostriamo un metodo di infezione modificato che è più semplice, riproducibile e rapida; d...

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Discussion

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Anticipi e limitazioni della microiniezione modello di malattia vescica natatoria

Il modello qui presentato è un'estensione del modello di immersione mucosa candidosi descritto in Gratacap et al (2013).; aggiunge i vantaggi di un tempo un'infezione controllata, una dose un'infezione altamente riproducibile, e quindi una maggiore efficienza. Dimostriamo qui nuovi metodi che permettono non invasivo documentazione temporale delle dinamiche di infezione in modo molto dettagliat...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori ringraziano il Dr. Le Trinh e Dr. Tobin per generosamente fornire la α-catenina: linea pesce citrino e Bill Jackman per averci permesso di fare le riprese nel suo laboratorio. Gli autori riconoscono le fonti di finanziamento National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Questo manoscritto è pubblicato come principale dell'agricoltura e delle foreste Esperimento numero di pubblicazione Stazione 3371.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette da 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Piastre di Petri profondeFisher Scientific89107-632
Pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-7M
Estratto di lievitoVWR Scientific90000-726
PeptoneVWR Scientific90000-264
DestrosioFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pinzetta fine (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Tasselli in legnoVWR Scientific10805-018
Agarosio a basso punto di fusioneVWR Scientific12001-722
Estrattore per micropipette marrone fiammanteSutter InstrumentsP-97
Capillare borosilicatoSutter InstrumentsBF120-69-10
Sistema di iniezione MPPI-3Strumentazione scientifica applicata Unità diMPPI-3
Strumentazione scientifica applicata Kit
Strumentazione scientifica applicata InterruttoreMPIP
Applied Scientific StrumentazioneFSW
MicromanipolatoreStrumentazione Scientifica ApplicataMM33
Base MagneticaStrumentazione Scientifica ApplicataBase
Tricaina metano solfonatoWestern Chemical Inc.MS-222
Microscopio da dissezioneOlympusSZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Microscopio confocaleOlympusIX-81 con sistema confocale a scansione laser FV-1000
Eppendorf930001007
Provette per colture in vetro (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Bambini argilla (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Blu di metileneVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Piastre di PetriFisher ScientificFB0875712
Emocitometro (
immersione di tipo ABlue Marble Products51935
CentrifugaEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Filo da pescaPiastra
di imaging a 96 pozzetti (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Grasso per alto vuoto (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Vetrino per microvetrini (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Vetrini coprioggetti (18 x 18 mm), n. 1,5VWR Scientific48366-045
Piastra di Petri da 15 cm (plastica Olympus)Genesee Scientific32-106
Glicerolo (prodotti chimici EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
a 24 pozzetti (plastica Olympus)Genesee Scientific25-107
Peso barche (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
contropressione porta micropipette BPU a pedale Magnetica Obiettivo per microscopio 20X Olympus UPlanSApo 20x/0.75 Tamburo a rulli New Brunswick Scientific TC-7 Puntali per pipette Microloader Olio da Piastra di coltura

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

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