Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione simultanea dei circoli di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e dei circoli di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC). Il test TREC/KREC può essere utilizzato come marcatore della produzione di timo e midollo osseo.
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Articolo metodologico
Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR
In questo articolo
Sommario
Abstract
'I cerchi di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e i cerchi di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC) sono elementi di DNA circolarizzati formati durante il processo di ricombinazione che crea recettori per le cellule T e B. Poiché i TREC e i KREC non sono in grado di replicarsi, vengono diluiti dopo ogni divisione cellulare e quindi persistono nella cellula. La loro quantità nel sangue periferico può essere considerata come una stima della produzione di timo e midollo osseo. Combinando il test TREC ben consolidato e comunemente utilizzato con una versione modificata del test KREC, abbiamo sviluppato una PCR quantitativa duplex in tempo reale che consente la quantificazione dei linfociti T e B di nuova produzione in un singolo test. Il numero di TREC e KREC è ottenuto utilizzando una curva standard preparata diluendo in serie i giunti segnale TREC e KREC clonati in un plasmide batterico, insieme a un frammento del gene costante alfa del recettore delle cellule T che funge da gene di riferimento. I risultati sono riportati come numero di TREC e KREC/106 cellule o per ml di sangue. La quantificazione di questi frammenti di DNA si è dimostrata utile per monitorare la ricostituzione immunitaria dopo trapianto di midollo osseo sia nei bambini che negli adulti, per una migliore caratterizzazione delle deficienze immunitarie o per una migliore comprensione di alcune attività immunomodulanti dei farmaci.
Introduzione
Cerchi escissione recettore T-cellulare (TREC) e cerchi ricombinazione di escissione-K (eliminazione KRECs) sono piccoli elementi di DNA della circolare che vengono asportate in una proporzione di T e cellule B, rispettivamente, durante un processo di ricombinazione DNA genomico, portando alla formazione di un repertorio altamente diversificato di T e dei recettori delle cellule B. Essi non hanno alcuna funzione, ma perché sono stabili e non possono essere replicate, vengono diluiti dopo ogni divisione cellulare, persistendo quindi solo in una delle due cellule figlie. Pertanto, i livelli nel sangue periferico può essere assunta come una stima della produzione del mi....
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Protocollo
NOTA: Etica dichiarazione: Questo protocollo segue le linee guida della nostra istituzione, la Spedali Civili di Brescia
1. Preparazione di un "Triple-Insert" plasmidi
- Selezione e preparazione di adeguate materiale di partenza:
- Ottenere un campione contenente cellule molto che possono avere TREC e KRECs rilevabile con PCR, come il sangue periferico di un giovane soggetto sano raccolto in provette EDTA.
NOTA: In origine, si era sviluppato il metodo che utilizza timociti per TREC e cellule mononucleate da frammenti di tonsille per KRECs, ma soggetti sani di solito hanno una quantità di TREC e KRECs sufficienti per c....
- Ottenere un campione contenente cellule molto che possono avere TREC e KRECs rilevabile con PCR, come il sangue periferico di un giovane soggetto sano raccolto in provette EDTA.
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Risultati
Il dosaggio è stato effettuato in un campione rappresentativo di 87 controlli sani: 42 bambini di età compresa tra 0-17 (maschi / femmine: 25/17) e 45 adulti di età compresa tra 24-60 (maschi / femmine: 29/16). I risultati sono stati ottenuti come TREC e KRECs per 10 6 PBMC, e poi le TREC e KRECs per ml di sangue sono stati calcolati.
Il numero di TREC diminuisce con l'età a causa involuzione timica, 4 in particolare in un modo molto acuto da 0 a 3 - 4 anni. Negli adult.......
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Discussione
La quantificazione TREC e KREC può essere considerata una buona stima della produzione recente di timo e midollo osseo, a condizione che vengano prese in considerazione alcune avvertenze. Anche se un metodo di quantificazione assoluta che impiega una curva standard richiede più reagenti e più spazio sulla piastra di reazione della PCR in tempo reale, garantisce risultati quantitativi estremamente accurati perché le quantità di campione sconosciute vengono interpolate da curve standard costruite su quantità note di materi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | metodo di separazione in gradiente di densità |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | Estrazione del DNA |
| Oligonucleotidi DNA non modificati HPSF 0,01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Risospendere il prodotto liofilizzato a 100 pmol/µ l | |
| AmpliTaq DNA polimerasi: incluso 10x Buffer II e 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| Kit di clonazione TOPO TA per il subclonaggio | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmide Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10.000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmide Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5.000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| tampone TE (1 mM TRIS e 0,1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Sonde a doppia marcatura HPLC 0,01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Risospendere il prodotto liofilizzato a 100 pmol/µ l | |
| Spettrofotometro NanoDrop 2000c | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Termociclatore | Biosistemi applicati/Tecnologie per la vita | 4359659 | |
| Sistema PCR in tempo reale Fast 7500 | Biosistemi applicati/Tecnologie | ||
| la vita Software di rilevamento della sequenza SDS 1.4 | Biosistemi applicati/Tecnologie |
Riferimenti
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....
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Ristampe e permessi
