L'approccio chirurgico post-auricolare descritto consente una somministrazione rapida e diretta nel timpano della scala cocleare del topo, riducendo al minimo la perdita di sangue e la mortalità animale. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia cocleare utilizzando la somministrazione molecolare, farmacologica e virale a topi postnatali attraverso la membrana rotonda della finestra.
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Articolo metodologico
Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all'orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell'udito. Introduzione di vettori nell'orecchio interno deve essere fatto in modo che l'agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell'orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l'udito dopo la consegna del VGLUT3 all'orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).
Introduzione
La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile 1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all'interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, u....
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Protocollo
NOTA: tutte le procedure e la gestione degli animali rispettate le linee guida etiche NIH e requisiti del protocollo approvati Care and Use Committee della University of California Animal Istituzionale, San Francisco.
1. Preparare la Animal di Chirurgia
- Eseguire interventi chirurgici in un ambiente pulito, spazio dedicato. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, sterilizzare con una sterilizzatrice vetro tallone prima dell'intervento.
NOTA: In questo protocollo, utilizzare giorno postnatale 10-12 (P10-12) topi FVB. Età diverse e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico pro....
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Risultati
Per verificare le caratteristiche tecniche e l'utilità di un approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP sono state consegnate in topi P10-12 all'orecchio interno tramite l'RWM. Questo approccio dimostra espressione del transgene successo all'interno delle cellule ciliate interne (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 e GFP GFP figura 3A), le cellule ciliate esterne (OHC) (GFP Figura 2) e cellule di supporto.......
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Discussione
In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l'obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari 30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale 24, cocleostomia 31,32 e sacco .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da una sovvenzione R21 del National Institutes of Health e da una sovvenzione di Hearing Research, Incorporated.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ketamina | Butler Schein | ||
| Xilazina | AnaSed | ||
| Acepromazina | Fornito da UCSF LARC | ||
| Analgesia del carprofene | Fornito da UCSF LARC | ||
| Betadine Betadine | Puredue Pharma | ||
| desametasone unguento oftalmico (TobraDex) | Alcon | ||
| Termoforo | Braintree scientific, inc. | ||
| Ago 25G | BD | 305127 | |
| pipetta capillare in borosilicato | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Sutura PDS*plus Antibatterico | Ethicon | PDP149 | |
| Colla tissutale (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Coniglio Anticorpo anti-GFP | Invitrogen | A11122 | |
| Microscopio da dissezione | Leica | MZ95 | |
| Micropipetta fiammata/marrone | Estrattore Sutter Instrument Co | ||
| Modello P-97 | |||
| Sistema TDT BioSig III | Tecnologie |
Riferimenti
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81
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Ristampe e permessi
