Trasformazione Floral-Dip di lino ( Linum usitatissimum) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell'impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino.

Abstract

Agrobacterium trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è una tecnica ampiamente usato nel campo della trasformazione delle piante e 'stato segnalato successo per molte specie vegetali. Tuttavia, non è stato riportato il lino (Linum usitatissimum) trasformazione da floreale-dip. L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire che Agrobacterium e il metodo floreale-dip può essere utilizzato per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, economico, efficiente e, soprattutto, fornisce una velocità di trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per trasformazione di lino.

In sintesi, infiorescenze di lino sono stati immersi in una soluzione di Agrobacterium trasportano un plasmide vettore binario (frammento di T-DNA più la sequenza di inserimento Linum, LIS-1) per 1 - 2 min. Le piante sono state poste su di un lato per 24 ore. Poi, le piante sono stati mantenuti in condizioni normali di crescita fino al trattamento successivo. Le process di immersione è stata ripetuta 2 - 3 volte, con circa 10-14 giorni d'intervallo tra immersione. I semi sono stati raccolti e T1 germinati sul suolo. Dopo circa due settimane, progenie trattati sono stati testati con PCR diretta; 2 - 3 foglie sono stati utilizzati per pianta più appropriati primer T-DNA. Trasformanti positivi sono stati selezionati e coltivati ​​a scadenza. La velocità di trasformazione è stato inaspettatamente elevata, con 50 - 60% dei semi di piante trattate essendo trasformanti positivi. Si tratta di un tasso di trasformazione superiori a quelli riportati per Arabidopsis thaliana e di altre specie di piante, utilizzando floreale-dip trasformazione. È anche la più alta, che è stato segnalato finora, per la trasformazione di lino utilizzando altri metodi per la trasformazione.

Introduzione

Lino (Linum usitatissimum) è una coltura importante coltivato ampiamente per le sue fibre e oli. Trasformazione del genoma di lino è possibile con tecniche come ferite, infezioni Agrobacterium, e co-coltivazione in coltura tissutale, applicando particelle Biolistic o ultrasuoni ultrasuoni seguita da rigenerazione. Tuttavia, queste tecniche hanno molti svantaggi, tra cui propensione a molti eventi mutazionali e un tempo prolungato per ottenere le linee transgeniche. Alcuni di questi metodi possono anche essere costosi e richiedono la manipolazione abile ed efficiente degli strumenti, con conseguente recupero piantine basse. Ancora più importante, queste tecniche spesso sfociano in un basso tasso di trasformazione ^2,6.

Agrobacterium trasformazione impianto mediata tramite floreale-dip è un approccio semplice ed efficace per generare piante transgeniche. È stato regolarmente ed usato con successo per molte specie vegetali come Arabidopsis Thalianun ^1,4, Medicago truncatula ^11, pomodoro ^{12, 13} grano e mais ^10. Tuttavia, non è stato pensato come una tecnica praticabile per la trasformazione di lino a causa di diversi fattori, quali il basso numero di fiori prodotti da lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, la dimensione del seme grande, e il cappotto spesso, che potrebbe anche essere problematico per tale processo di trasformazione genetica. Inoltre, il segmento selezione della tecnica floreale-dip richiede germinare semi trasformati su un supporto di pianta che contiene un antibiotico, con progenie trasformate distinguono in base alla loro capacità di germogliare e rimanere verde, mentre progenie non trasformati o non germinare o germinare, ma candeggina rapidamente e morire. Nella letteratura, è stato notato che wild-type di lino tende a sfuggire alta concentrazione di selezioni antibiotici, producendo risultati falsi positivi, e rendendo la selezione di progenie T1 basatosulla resistenza agli antibiotici più difficile ^6,14. Inoltre, quando una elevata concentrazione di antibiotico è stato aggiunto al mezzo di selezione, il tasso di trasformazione osservato sceso drasticamente ^9.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato Agrobacterium e il metodo floreale-dip per trasformare una linea di lino tessile, Stormont Cirrus (reattivo e plastica), che ha dimostrato di rispondere alle sollecitazioni del contesto alterando suo genoma ^3,5. Per superare il problema di fuga antibiotico, abbiamo scelto di fare il test del DNA PCR diretta da foglie T1, invece di selezione aggiungendo l'antibiotico ai media dell'impianto. Abbiamo approfittato della semplice anatomia del lino per tenere traccia dei fiori specifici al momento del trattamento. Questo sistema di monitoraggio ha consentito la selezione di semi di fiori specifici e germinazione sul suolo, senza l'aggiunta di antibiotico. Trasformanti positivi sono stati semplicemente identificati con il test del DNA ottenuto dalle foglie utilizzando il veloce ed efficiente metodo of PCR diretta. I nostri risultati dimostrano che il metodo floreale-dip ha lavorato molto bene in questa linea di lino e sorprendentemente portato ad un tasso di trasformazione molto elevata (50 - 60%), superiori a quelli precedentemente osservati per Arabidopsis thaliana, che è stato segnalato per essere 0,1-1 ^1%, e anche più elevato rispetto ad altre specie vegetali ^10,12. Abbiamo anche provato un'altra varietà di semi di lino (lino olio), Bethune (stabili e non reattivi), e nostri dati preliminari indicano che floreale-dip funziona anche per questa varietà di lino.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare che Agrobacterium e floreale-dip possono essere utilizzati per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, poco costoso, e più veloce di altri metodi di trasformazione di lino. Ancora più importante risulta in una velocità di trasformazione molto più alto rispetto agli altri metodi di lino trasformazione ^2,6. L'anatomia di Arabidopsis thaliana, che ha molti rami e fiori, maKES difficile distinguere immerso e fiori non tuffato sulla stessa pianta. Pertanto, un gran numero di semi, circa 20.000 semi per piante, devono essere sottoposti a screening per identificare trasformanti positivi ^8. Lino, d'altro canto, ha meno filiali (un ramo principale e alcuni rami laterali) e un minor numero di fiori, che producono circa 100 semi per piante, che permette di monitorare i singoli fiori e per selezionare i semi specifici durante il processo di screening.

Proponiamo che floreale-dip è un metodo applicabile per trasformare qualsiasi specie affini di lino, un genere di circa 200 specie. Questo metodo fornisce velocità di trasformazione molto più elevato rispetto ad altri metodi di trasformazione di lino. Proponiamo inoltre che la proiezione diretta PCR di T1 foglia DNA è un modo efficace per superare il problema della fuga resistenza agli antibiotici che spesso produce molti falsi positivi. Proiezione diretta PCR può essere applicato ad altre specie vegetali e non è limitata to di lino. La semplice tecnica di inseguimento sementi impiegata in questo protocollo può essere applicato ad altre specie vegetali con ramificazione anatomia simile al lino.

Protocollo

1. Crescere Piante

1. 6 settimane prima immersione, riempimento 5 pentole pollici con terreno e seminare semi di lino ¼ pollice profondo nel terreno (4 semi per piatto). Assicurati di rassodare il terreno sopra i semi. Innaffiare le piante regolarmente e mantenere in lungo luce diurna (luce 14 ore e 10 ore scuro).
2. Controllare le piante regolarmente infiorescenze primari (cluster di organi fiori "). Le piante sono pronte per la trasformazione quando le gemme sono visibili e hanno appena formata nella infiorescenza (figura 1 e 2). Per vedere i germogli, tagliare le foglie intorno ad esso, se necessario.
   NOTA: Usando il miglior palcoscenico fiore è critica ed è dettagliato nella discussione.
   1. Utilizzare il ramo principale dell'impianto per il trattamento sperimentale in quanto produce più fiori che i rami laterali. Utilizzare i rami laterali sia come controlli (non essere immersi) o per altri trattamenti sperimentali.
   2. In alternativa, utilizzare i principali e laterali ramistesso impianto per il trattamento sperimentale e utilizzare un'altra pianta come controllo o per altri trattamenti sperimentali. Utilizzare le etichette per contrassegnare i singoli rami e fiori singoli con la data e il tipo di trattamento.

2. Clonazione e trasformazione per Escherichia coli (E. coli) Cells

1. Clone il frammento / gene di interesse nel sito di clonaggio multiplo di una pianta vettore binario ospitare il T-DNA.
   1. Eseguire la clonazione in un passo o due gradini.
      1. Direttamente clonare piccoli inserti in questo protocollo (~ 500 bp) nell'impianto binario vettoriale. In questo protocollo, utilizzare lo stabilimento vettore binario (PRI909). In caso contrario, utilizzare altri vettori binari di piante in una strategia simile.
      2. In alternativa, clonare inserti di grandi dimensioni (≥6.5 kb) in due fasi: la prima con un kit generale clonazione commerciale (non piantare specifico), poi sottoclone nella pianta vettore binario.
2. Impostare una reazione PCRzione per amplificare il gene di interesse. Progettare i primer con siti di restrizione alla fine del 5 '(secondo il sito di clonazione multiplo pianta del vettore binario in uso).
   1. Eseguire PCR standard utilizzando DNA genomico di lino con le seguenti condizioni di ciclo: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec, e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C.
   2. I prodotti di PCR separate sul 1% Tris / borato / EDTA (TBE) gel, corrono il gel a 100 V per 1 ora. Purificare i prodotti dal gel e quantificare via Nanodrop.
3. Impostare il mix legatura per clonare il prodotto di PCR nel vettore di clonaggio commerciale. Seguire il protocollo del produttore.
4. Trasforma il mix legatura in chimicamente competente E. coli come segue.
   1. Aggiungere 2 ml di mix legatura in un flaconcino di chemically competente E. coli. Incubare in ghiaccio per 30 min.
   2. Heat Shock le cellule per 30 sec a 42 ° C (Heat tempo shock e temperatura dipende dal tipo di cellule utilizzate).
   3. Incubare in ghiaccio e aggiungere 250 ml di brodo RT eccellente ottimale con repressione da cataboliti (SOC) di media.
   4. Chiudere la provetta e incubare in un agitatore orbitale a 200 rpm a 37 ° C per un ora.
   5. Distribuire 10 - 50 microlitri da ogni trasformazione su una piastra preriscaldata LB (preriscaldata a 37 ° C) + antibiotico appropriato selettiva (determinare l'antibiotico selettivo in base al tipo di clonazione commerciale vettore utilizzato). Incubare le piastre a 37 ° CO / N.
5. Scegli ~ 10 colonie per mini depurazione preparazione plasmide, utilizzando un kit commerciale. Mini purificazione preparazione plasmide viene generalmente eseguita come segue.
   NOTA: i nomi di buffer sono specifici per il kit commerciale utilizzato, ma le loro funzioni generali sono simili.
   1. Inoculare le singole colonie in 2- 5 ml terreno LB contenente l'antibiotico selettiva appropriata (determinato in base al tipo di vettore commerciale utilizzato).
   2. Incubare per circa 8 ore a 37 ° C con scuotimento vigoroso (~ 300 rpm).
   3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
   4. Risospendere il pellet nel tampone di risospensione 250 microlitri. Mescolare e vortex per disperdere completamente il pellet.
   5. Lyse le cellule batteriche aggiungendo 250 ml di tampone di lisi, mescolare accuratamente invertendo i tubi 4 - 6 volte.
   6. Neutralizzare il lisato nel buffer neutralizzazione e invertire 4 - 6 volte per mescolare. Centrifugare per 10 minuti a ~ 17.900 xg in una microcentrifuga tavolo.
   7. Trasferire il surnatante dal passaggio precedente per una colonna di spin. Centrifugare nuovamente ~ 17.900 xg per 30 - 60 a sec.
   8. Lavare la colonna di spin aggiungendo 0,75 ml tampone di lavaggio e centrifuga per 30-60 sec. Gettare il flow-through.
   9. Centrifuga per un ulteriore 1 min Remove tampone di lavaggio residuo. Porre la colonna di spin in un ambiente pulito 1,5 ml provetta. Per eluire DNA, aggiungere acqua 50 microlitri al centro di ogni colonna. Lasciate riposare per 1 minuto, e centrifugare per 1 min.

3. Analizzare il purificato Plasmidi per la presenza di Insert

1. Limitazione Digest:
   1. Impostare una restrizione digest per determinare la presenza dell'inserto per digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione usati per clonare l'inserto. Un tipico doppio restrizione digerire reazione come segue: 1 mg di plasmide purificato, 1 ml di ogni enzimi di restrizione, 2 ml 10x restrizione digerire tampone + 2 pl BSA (se applicabile), X ml di acqua (per un totale di 20 microlitri)
   2. Miscelare delicatamente e incubare a temperatura consigliata (varia da un enzima all'altro).
   3. Analizzare la restrizione digerire reazione 1% TBE gel, correre a 100 V per 1 ora e cercare drop-out di dimensioni adeguate.
2. Analisi PCR:
   1. Impostare una PCR con il plasmide purificato, utilizzando primer dalla regione vector commerciale per amplificare all'interno dell'inserto o la giunzione tra il vettore e l'inserto. Primer comuni sono M13 avanti e indietro e primer T3 / T7.
   2. In questo protocollo, utilizzare le seguenti condizioni di ciclo di PCR: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 18 cicli a 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C.
   3. Prodotti Load PCR su un TBE gel 1% e correre per 100 - 120 V per 1 ora.
3. Sequencing:
   1. Invia il plasmide purificato in un impianto commerciale sequenziamento per analizzare e confermare la presenza dell'inserto.
   2. Una volta ottenuto il costrutto corretta, utilizzare per la seconda fase di clonazione (nella pianta vettore binario).
      NOTA: i passaggi 2,3-3,3può essere eliminato se la clonazione è completata in un solo passo.

4. Clonazione nell'impianto Binary Vector (PRI909) e E. coli Transformation

1. Impostare una doppia restrizione digerire reazioni linearizzare la pianta vettore binario e isolare l'inserto precedentemente clonato utilizzando gli stessi siti di restrizione enzimi che sono stati aggiunti i primer (punto 2.2).
2. Analizzare i digest restrizione con elettroforesi su gel, correre a 100 V per 1 - 2 ore. Tagliare l'inserto e la pianta linearizzato vettore binario dal gel.
3. Utilizzare un kit commerciale per purificare i prodotti in gel. Consultare il manuale del costruttore.
4. Impostare una reazione legatura per legare l'inserto nella pianta vettore binario. L'inserto rapporto vettore dipende dalla dimensione dell'inserto e la pianta vettore binario. In questo protocollo l'inserto LIS1 era 6,5 ​​kb e la pianta vettore binario è stato di 9 kb. Quindi, utilizzare un 1: 2 inserto rapporto vettoriale.
5. Ripetere i passaggi 2,4-3 per la trasformazione batterica, la purificazione plasmide e analisi. Una volta ottenuto il costrutto corretta (insert + pianta vettore binario), procedere al elettroporazione al punto 5.

5. elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens Cells elettricamente competenti

1. Scongelare una fiala di Agrobacterium tumefaciens cellule elettricamente competenti sul ghiaccio.
2. Aggiungere 1 ng di binario DNA vettore plasmidico a 20 ml di cellule competenti, sul ghiaccio, e mescolare delicatamente.
3. Raffreddare un 0,1 centimetri cuvetta elettroporazione sul ghiaccio.
4. Trasferire la miscela cellule / DNA competente per le cuvette di elettroporazione, e toccare per raccogliere la miscela a fondo. Inserire la cuvetta nella macchina elettroporatore e impulsi (condizioni di tensione e di tempo dipendono dalle dimensioni della cuvetta e elettroporatore utilizzato).
5. Aggiungere 1 ml di media SOC e cellule di trasferimento in una provetta da 15 ml.
6. Incubare per 1 ora a 28 - 30° C, agitando a 100 rpm. Tavola 50 - 100 microlitri di cellule su agar LB + antibiotico appropriato selettiva (dipende dalla pianta plasmide binario e il ceppo di Agrobacterium utilizzata In questo uso protocollo 50 ug / ml di kanamicina e 100 mg / ml di streptomicina.).
7. Incubare le piastre fino a 48 ore a 28 - 30 ° C.
8. Ripetere il punto 2.5 per la selezione delle colonie e purificazione plasmide.
9. Ripetere passaggio 3 per analizzare il plasmide e per verificare l'integrità dell'inserto e T-DNA prima di utilizzare il costrutto floreale-dipping. Ripetere il passaggio 3.2, l'utilizzo di più primer PCR in tutta la regione inserita e in tutte le regioni T-DNA e sequenziamento come al punto 3.3.
   NOTA: In questo protocollo 4 primer diversi sono stati progettati in tutto il T-DNA e 10 primer attraverso l'inserto.
10. Una volta che la presenza della pianta plasmide binario nella colonia Agrobacterium selezionata viene confermata, luogo celle in 50% glicerolo e conservare a -80 ° C. Conservare rimanendo colonie sulla piastra a 4 ° C se devono essere utilizzati entro una settimana ^7.

6. Floral-immersione

NOTA: 2 giorni prima Floreale-immersione:

1. Crescere cellule tumefaciens alla fase stazionaria (OD ₆₀₀ tra 0,5-1 è accettabile) in LB + antibiotici appropriati in mezzi liquidi.
   NOTA: Questi sono gli stessi antibiotici come al punto 5.6, in base vegetale vettore binario e il tipo di ceppo Agrobacterium utilizzato.
2. Avviare la coltura di 1: 100 di diluizioni saturo (5 ml) O / N cultura e crescere per 24 - 48 ore a 28-30 ° C agitando a 150 rpm. La cultura dovrebbe aver raggiunto la fase midlogarithmic e più probabile sarà avvicinamento o in fase stazionaria ^1. OD di circa 0,8 (OD nuovamente tra 0,5 e 1 è tutto accettabile) ^8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg a RT.
3. Risospendere le cellule in terreno infiltrazione (5,0% di saccarosio + ,05-0,003% Silwet L-77). Per il primo turno di immersione, utilizzare 0,05% Silwet-77. Per il secondo e terzo ciclo, ridurre la concentrazione di 0,03% (descritto Discussione).
4. Procedere con il passo floreale-dip. Posare la pianta su un fianco e immergere solo i germogli visibili nel mezzo di infiltrazione per 1-2 min. Lasciare la pianta su un lato e coprire con pellicola trasparente per mantenere alta umidità nella cupola (Figura 3).
5. Il giorno successivo, posizionare l'impianto in posizione verticale e mantenere normalmente.
6. Quando la gemma cresce più grande (di solito dopo circa 10 - 14 giorni), ripetere i passaggi 6,1-6,4. Ridurre il tempo di immersione per 30-60 sec e Silwet-77 concentrazione 0,003%.
7. Mantenere le piante normalmente fino loro semi sono maturi e pronti per essere raccolti (figura 4).

7. La selezione di Tra Positivensformants con PCR diretta

1. Seminare i semi T1 sul suolo come al punto 1.1.
   1. In alternativa, fare Murashige e Skoog sale basale (MS media) con l'aggiunta di 2,2 g di MS media + 4 g di agar-agar in 500 ml di acqua. Autoclave e versare in piccoli vasi per piante. Conservare nel 4 ° C fino all'uso.
   2. Seminare il seme mettendoli sul supporto MS solidificato. Tenere sotto lunga diurna (luce 14 ore e 10 ore di buio). I semi germinano in circa 4-6 giorni (Figura 5).
   3. Utilizzare un seme di ogni fiore come un punto di partenza. Se si ottiene alcun trasformante positivo, ripetere questo passaggio con la scelta di un altro seme dal fiore.
      NOTA: test semi diversi dagli stessi fiori, perché in alcuni casi non tutti i semi da un fiore saranno trasformati. Selezione di semi supplementari da fiori sperimentali volte è necessario.
2. Controllare sulle piantine regolarmente. In circa 10 - 14 giorni dopo la germinazione, quando la veralascia sviluppare, testare le piante con PCR diretta.
3. Preparare l'estratto di foglie di DNA tagliando 2 - 3 foglie (5-10 mg in peso) da ciascuna piantina e metterli in una provetta.
4. Aggiungere 180 ml di NaOH 50 mm per ogni tubo, e incubare per 10 minuti a 95 ° C.
5. Neutralizzare l'estratto aggiungendo 20 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
6. Usare 1 ml di estratto nella reazione diretta PCR, utilizzando primer disegnati tutti i T-DNA o l'inserto (Figura 7), per selezionare trasformanti positivi.
   1. In questo protocollo, utilizzare PCR diretta con una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 min a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di (98 ° C per 10 sec, fase di ricottura per 15 secondi, ed una fase di allungamento a 68 ° C). Eseguire una fase di estensione finale a 68 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. (Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli su primer, temperature di ricottura e tempi di estensione per i cicli).
7. Identificare trasformanti positivi e farle crescere alla maturità. Se i semi sono stati germinati in mezzo MS, trapianto suolo in un vaso più grande (Figura 5).

Risultati

Figura 1 - 4 illustrano alcuni dei passaggi all'interno del protocollo. Nelle figure 1 e 2, le foglie intorno ai germogli vengono tagliati infiorescenza esporle alle cellule tumefaciens e le diverse fasi germoglio che sono stati utilizzati per sviluppare il protocollo. La Figura 3 mostra il processo di lino floreale-dip. Figura 4, mostra un esempio di come le principali e laterali rami possono essere etichettati e come fiori individuo può essere rintracciato e identificato. Figura 5 mostra come le progenie T1 possono germinare sul supporto dell'impianto MS e poi trapiantato a terra per la maturità. Figura 6 illustra come Wild- Tipo di lino può sfuggire alte concentrazioni di kanamicina, confermando i risultati precedenti in letteratura ^6,9,14.

La figura 7 mostra un esempio di amplificazione diretta PCR da trasformanti positivi T1. I fiori T1 sono stati raccolti dal main e germogli laterali di una singola pianta T0. Come si può vedere dalla PCR diretta, 8/12 piante T1 risultati positivi mediante PCR e hanno amplificato le diverse regioni del T-DNA. I nostri primer sono stati progettati anche tra i LIS-1 inserto ei siti di clonaggio multipli (Figura 7b e C). Abbiamo usato primer aggiuntivi dalla pianta vettore binario per amplificare diversi segmenti del T-DNA, come il bordo sinistro e il terminatore NOS (dati non mostrati) o il bordo destro e il sito di clonaggio multiplo (Figura 7D). Primers specifici all'inserto LIS-1 sono stati usati anche in questo protocollo (dati non mostrati). Un elenco di primer è fornita in Tabella 1. Tuttavia, le sequenze di questi primer dipende dalla sequenza della pianta T-DNA vettore binario e l'inserto usato per il floreale-dip. Abbiamo anche notato che non vi era alcuna differenza significativa nel tasso di trasformazione tra i fiori raccolti dalle principali e laterali rami.

Figura 1. Tagliare le foglie intorno alle gemme infiorescenza principali per esporli alle cellule Agrobacterim. (A) I boccioli sono coperti da foglie. (B) Foglie sono stati tagliati intorno alle gemme per esporre loro. (C) ingrandita dell'immagine da pianta in (A) dopo il taglio per esporre gemme. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Le diverse fasi del germoglio che sono stati utilizzati in questo protocollo per determinare il miglior palcoscenico da utilizzare per il tuffo floreale. (A) La fase germogliamento precoce è approssi tamente 2 mm. (B) La fase di bocciolo centrale è di circa 5 mm. (C) La fase di germoglio tardivo è di circa 1 cm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Il processo di lino floreale-dipping. (A) Le infiorescenze primarie sono immersi nei media infiltrazione contenenti le cellule tumefaciens. (B) ingrandita da (A). (C) Le piante anabbaglianti sono posati fino al giorno successivo, e le filiali anabbaglianti sono coperti di plastica per mantenere alto tasso di umidità. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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. Figura 4. Il processo di monitoraggio fiori e sementi collezioni, dalle piante T0 trattato (A) Un esempio di tutto l'impianto con il ramo principale (il ramo più alto al centro) e il lato rami (B - D). An . esempio dei fiori delle diverse branche (E) Un esempio dei semi raccolti da singoli fiori (etichettato come - k). dal ramo principale Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Le piantine T1 sono coltivati ​​senza selezione antibiotica. (A) semi T1 sonogerminato sul supporto dell'impianto MS. (B) trasformanti positivi, come determinato mediante PCR diretta, vengono trapiantate nel terreno e cresciuto fino a scadenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. fuga antibiotici, un problema per la selezione T1, è superata dalla proiezione diretta PCR. (A) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti pianta MS senza antibiotico. (B) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti vegetali ms + concentrazioni crescenti di kanamicina (200 mcg / ml, 600 pg / ml, 1 mg / ml). (C) wild-type semi di lino germinati MS supporti pianta con 2 mg / ml kanamicina. (D) PCR da wild-type lino e T1 piantina utilizzando primer kanamicina, tutto AMPLcato i geni kanamicina (leggende: EZ1: marcatori del DNA, FlaxS, wild-type flaxS, C: controllare non-tuffato ramo, Ma: T1 progenie di fiore "a" raccolti dal ramo principale, Sc, Sd, Se, Sf: T1 progenie di fiori diversi "c, d, e, f" raccolti dal ramo laterale, W:. no-DNA) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Un esempio di successo amplificazioni di progenie T1 utilizzando il metodo diretto PCR. (A) Schema della pianta vettore binario + il clonato LIS-1 inserto. Le frecce blu indicano la posizione di primer PCR utilizzati nello screening PCR diretta (modificato da Takara). (B) PCR con primer M13F + 3 '(C) PCR con primers M13R + 18a Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Primer Forward fonte sequenza	sequenza 5'-3 '	Reverse fonte sequenza di fondo	Sequenza 5'-3 '	Ricottura Temprature (° C)	Tempo Extension (Sec)	Dimensioni previste (bp)
M13F (T-DNA)	CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG	3 '(LIS-1 inserto)	GAGGATGGAA GATGAAGAAGG	57	40	450
18a (LIS-1 inserto)	TATTTTAACCC	M13R (T-DNA)	ATTAGGCACC CCAGGCTTTA	57	40	520
MCS (T-DNA)	TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG	RB (T-DNA)	TTTAAACTGA AGGCGGGAAA	60	20	200
LB (T-DNA)	TTTGATGGTG GTTCCGAAAT	NOS (T-DNA)	GAATCCTGTT GCCGGTCTT	60	30	380
NPTII (T-DNA)	GCGATACCGT AAAGCACGAG	NTPII (T-DNA)	GCTCGACGTT GTCACTGAAG	65	45	502

Tabella 1. Alcuni dei primer utilizzati per la sperimentazione diretta PCR.

Discussione

In alcune specie vegetali, come lino (Linum usitatissimum), trasformazione pianta successo è stato limitato. In precedenza, la trasformazione in lino ha richiesto una infezione da Agrobacterium ferendo e co-coltivazione, applicando particelle Biolistic o mediante ultrasuoni sonicazione, seguita da rigenerazione; un processo che è sia lungo e soggetto ad essere accompagnato da molti eventi mutazionali. Inoltre, il processo di selezione di queste tecniche richiede l'uso di marcatori selezionabili antibiotici come kanamicina. Tuttavia, è stato osservato in letteratura che questo metodo di selezione produce molti falsi positivi, come il lino tende a sfuggire alte concentrazioni di antibiotici ^6,9,14. Un altro svantaggio delle tecniche precedenti trasformazione di lino è la velocità di trasformazione bassi ^2,6.

Nel protocollo qui descritto, Agrobacterium trasformazione dell'impianto mediata tramite floreale-immersione è stato mostratocomportare un tasso di trasformazione alta per il lino (50 - 60%). Trasformanti sono stati ottenuti da fiori anabbaglianti e raccolti dalle principali e laterali rami. Selezione di trasformanti positivi è stato semplicemente fatto la coltivazione di piante T1 sul suolo e screening loro foglie subito dopo che germogliavano, by-passando l'uso di antibiotici di selezione, un passo in precedenza utilizzato come norma in floreale-dip per altre specie vegetali. Per eseguire l'analisi diretta PCR di foglie, e utilizzando gli appositi primer T-DNA, trasformanti positivi possono essere rapidamente selezionati. Questa tecnica è semplice, economico e di facile esecuzione, ma comporta una frequenza di trasformazione molto superiori a quelli precedentemente riportati per Arabidopsis e altre specie vegetali utilizzando questo metodo ^1,10,12. E 'anche il più alto tasso di trasformazione segnalato per il lino.

Tuttavia, vi sono fasi critiche nelle procedure compresa la selezione dei migliori fase del fiore e la migliore concentrazione di tensioattivo, in modo chel'Agrobacterium può penetrare nelle cellule vegetali senza uccidere gli organi di fiori. Se uno stadio precoce del germoglio viene utilizzato (Figura 2A) con alta concentrazione Silwet-77 di più di 0,05%, il fiore non svilupperà né prevedere semi. Se tardivamente germoglio viene utilizzato (Figura 2C), anche se la trasformazione potrebbe funzionare, si verificherà ad un tasso molto più basso. Risultati simili sono stati ottenuti con Arabidopsis dip floreale trasformazione ^1,4. Per questo protocollo, tutte le fasi floreali sono stati testati con differenti Silwet-77 concentrazioni e il miglior palcoscenico era determinato a essere il palcoscenico del germoglio centrale (Figura 2C) con Silwet-77 a 0,05% per la prima immersione, seguita da una seconda immersione a la fase tardiva del germoglio (figura 2C) con un po 'ridotta concentrazione Silwet-77 del 0,03%. La trasformazione ha funzionato bene anche con la fase germogliamento precoce (Figura 2A) con una bassa concentrazione Silwet-77 di 0,003%, seguito dauna seconda fase di immersione con germoglio centrale (Figura 2B) a maggiore concentrazione Silwet-77 allo 0,05%.

In questo protocollo, altri parametri sono stati tentato di ottimizzare la velocità di trasformazione, ma ha trovato ad avere effetti sul risultato finale. Esempi includono l'estensione del tempo di immersione, dopo che le piante laici al loro fianco e rivestiti in plastica da un giorno a due giorni; utilizzando un OD superiore a 1 per la cultura Agrobacterium, invece di 0,5 - 1; aumentando il tempo di immersione 5 - 15 min invece di 1 - 2 min. Ancora una volta non abbiamo notato alcun effetto sul tasso di trasformazione utilizzando queste strategie. I fattori più efficaci, tuttavia, sono stati trovati a utilizzare piante sane nelle fasi di fiori corretti, e con la migliore concentrazione Silwet-77. Abbiamo notato che due intervalli di immersione, in qualche modo funziona meglio di una volta, anche se una immersione volta funziona anche.

Modifiche a questo protocollo può essere raggiunto reducing concentrazione Silwet-77 per il meno 0,003% nel secondo o terzo dipping. Dal Silwet-77 è tossico, troppo alto risultati concentrazione nei fiori sviluppando male, con conseguente non resa in semi. La frequenza immersione può essere ridotta a uno, con il secondo o terzo eventi eliminati se le piante non stanno cercando sano e le gemme non stanno sviluppando bene.

Una limitazione importante di questa tecnica è il basso numero di fiori prodotti dal lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, e la lunga durata di lino. Ci vogliono 6-8 settimane dalla semina di sementi di avere le gemme primarie pronto per la prima immersione e un ulteriore 8 - 10 settimane dopo l'immersione per arrivare alla generazione T1. In totale, una gamma di 5 - è necessaria sei mesi per ottenere la generazione T1. A differenza di altre specie di piante, che fioriscono in qualsiasi momento dell'anno, alcune varietà di lino fiore meglio in momenti specifici dell'anno. Pianificazione così premuroso di questa tecnica è importante.

In sintesi, i risultati del dip floreale con due diverse varietà di lino: il lino fibra, Stormont Cirrus (plastica reattivo e), e del lino olio, Bethune (stabili e non reattivi), mostrano che Agrobacterium - trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è un metodo applicabile ed efficiente per la trasformazione di lino e può essere utilizzato per sostituire le tecniche utilizzate in precedenza per la trasformazione di lino. Le modifiche del metodo floreale-dip in questo protocollo saranno applicabili per l'uso con altre specie vegetali e non limitato a lino.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Semi di lino della varietà originale Stormont Cirrus (PL)
Vasi
Terriccio
Serra con impostazione
Termociclatore
per elettroferesi su gel di agarosioConfigurazione di
Silwet-77	LEHLE SEEDS	VIS-01	Tossico, indossare guanti
GoTaq Green Master Mix	Promega	Part# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase Mix	Clontech	639270
Vettore binario PRI 909	Takara	3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E	Takara	9115
Kit di clonazione TOPO TA	Invitrogen	K4595-01
Saccarosio	Fisher Scientific Elettroporatore
e cuvette	Bio-Rad	165-2092
Shaker
Spinner
Involucro di plastica e foglio
speedSTAR DNA polimerasi	Takara	RR070A/B
Kit di estrazione del gel QlAquick Qiagen		28704
Mini kit plasmidico QIAGEN	Qiagen	12123
Enzima SalI-HF	NEB	R3138S
Enzima SacI-HF	NEB	R3156S
Kit di legatura del DNA T4	NEB	M0202
Murashige Skoog	Sigma	M5524
Agar	Fisher Scientific	A360-500

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