Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Sommario

La colorazione periodica con acido di Schiff è una tecnica che visualizza il contenuto di polisaccaridi dei tessuti. Questo articolo dimostra il protocollo periodico di colorazione acida di Schiff adattato per l'uso su cellule mononucleate del sangue periferico purificate da sangue venoso umano. Tali campioni sono arricchiti per i linfociti e altri globuli bianchi del sistema immunitario.

Abstract

La colorazione periodica con acido di Schiff (PAS) è una tecnica immunoistochimica utilizzata nelle biopsie muscolari e come strumento diagnostico per campioni di sangue. I polisaccaridi come glicogeno, glicoproteine e glicolipidi colorano il magenta brillante, facilitando l'enumerazione delle cellule positive e negative all'interno del tessuto. Nelle cellule muscolari la colorazione PAS viene utilizzata per determinare il contenuto di glicogeno in diversi tipi di cellule muscolari, mentre nei campioni di cellule del sangue la colorazione PAS è stata esplorata come strumento diagnostico per una varietà di condizioni. Il sangue contiene una percentuale di globuli bianchi che appartengono al sistema immunitario. L'idea che le cellule del sistema immunitario possiedano glicogeno e lo utilizzino come fonte di energia non è stata ampiamente esplorata. Qui, descriviamo una versione adattata del protocollo di colorazione PAS che può essere applicato su cellule immunitarie mononucleate del sangue periferico da sangue venoso umano. Sono state osservate cellule piccole con granuli PAS-positivi e cellule più grandi con colorazione PAS diffusa. Il trattamento dei campioni con amilasi abroga questi modelli, confermando la specificità della colorazione. Una tecnica alternativa basata sulla digestione enzimatica ha confermato la presenza e la quantità di glicogeno nei campioni. Questo protocollo è utile per ematologi o immunologi che studiano il contenuto di polisaccaridi nei linfociti derivati dal sangue.

Introduzione

Acido periodico Schiff (PAS) è una tecnica di colorazione immunoistochimica che è ampiamente utilizzato nella ricerca e diagnostica muscolare. Viene anche utilizzato come strumento diagnostico su campioni di sangue. La tecnica funziona applicando soluzione di acido periodico al campione, che ossida unità all'interno dei polisaccaridi creazione di gruppi aldeidici che reagiscono con il reagente di Schiff incolore producendo così un prodotto magenta profondo. I passi di questa procedura sono mostrati in Figura 1. La macchia gira nulla con polisaccaridi magenta, tra glicogeno, glicoproteine, glicolipidi, mucine, o altre molecole con porzioni polisaccaridi.

Colorazione PAS viene spesso utilizzato per misurare i livelli di glicogeno nelle fibre muscolari. Sezioni di muscoli di tessuto sono ideali per la tecnica in quanto fermamente attribuiscono alla diapositiva e sopportano più fasi di lavaggio e colorazione. Il glicogeno è più presente in contrazione rapida di tipo II fibre muscolari, che hanno una forte domandaper la produzione di ATP rapida richiede glicogeno per il massimo delle prestazioni ^1,2. Il glicogeno è un polimero ramificato di glucosio che può essere suddiviso in glucosio libero attraverso l'azione di enzimi glicogeno fosforilasi. In tempi di riposo e nutrizionale-autosufficienza, il glicogeno viene rifornito attraverso il processo di glicogenesi, mentre in tempi di insufficienza o di alta energia domanda nutrizionale; glicogeno è suddiviso in glucosio da glicogenolisi. Dalla già a partire dal 1950 gli scienziati hanno esplorato clinico colorazione PAS su campioni di sangue per analizzare il contenuto di glicogeno in varie malattie ^3-7. Ad esempio, in Pompe malattia un accumulo di glicogeno autentico globuli bianchi alle malattie accumulano grandi quantità di glicogeno che differisce significativamente da controlli sani ^8.

Questo video-articolo illustra una versione adattata di colorazione PAS per l'uso su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) campioni di sangue venoso di soggetti umani sani. PBMCs contengono principalmente linfociti del linfociti T e B famiglie linfociti, così come altre cellule immunitarie come le cellule killer naturali e monociti. La prima fase di purificazione rimuove eritrociti, neutrofili e altri granulociti. Questa tecnica fornisce dati su una proporzione concentrata di linfociti consentendo più robusta enumerazione delle cellule PAS-positive rispetto all'utilizzo strisci di sangue intero.

Figura 1:. Passo dopo passo la metodologia di colorazione PAS su PBMC (A) In primo luogo, l'isolamento delle PBMC è ottenuta attraverso Ficoll gradiente, il pannello di sinistra mostra la preparazione prima della centrifugazione, il pannello di destra mostra che dopo centrifugazione dove il cappotto buffy contenente il PBMC si osserva nel centro del tubo. (B) Isolamento PBMC sono fissati su vetrino utilizzando formalina-etanolo solu fissativezione. Il vetrino viene delicatamente risciacquato con acqua distillata da una spruzzetta di plastica. (C) Il vetrino viene quindi posto in un becher da 100 ml a metà riempito con soluzione di amilasi, che si dissolverà glicogeno. Il vetrino viene delicatamente risciacquato. (D) La slitta viene trattato con soluzione di acido periodico, in cui l'ossidazione dei saccaridi avviene. I vetrini sono sciacquati delicatamente; Questa operazione rimuoverà l'acido periodico eccesso e fermare la fase di ossidazione. (E) Quando il reagente di Schiff viene aggiunta ai vetrini, esso reagirà con aldeidi creati durante la fase di ossidazione. Questo reagente incolore sarà quindi ottenere un prodotto magenta rosso intenso. I vetrini sono delicatamente risciacquate per rimuovere l'eccesso di reagente di Schiff.

Protocollo

La ricerca con campioni di sangue umano è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 10000618. Il lavoro sul muscolo del mouse è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 2010BERG.

1. PBMC Isolamento da sangue intero

NOTA: Effettuare questa procedura in un armadio biosicurezza con tecnica sterile e attrezzature produttore-sterilizzati.

1. Versare con cautela 10-15 ml di sangue intero dai eparinizzato tubi (anticoagulante) di raccolta del sangue in una provetta sterile da 50 ml. Per fuoriuscite di sangue minori, pulire con DDH ₂ O e il 70% EtOH utilizzando tessuti di pulizia.
2. Diluire il sangue nel tubo conico ad un rapporto 1: 1 con tampone fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Assicurarsi che il volume massimo totale non supera i 30 ml.
3. Mescolare delicatamente con una pistola pipetta sierologica evitando bolle.
   NOTA: NON miscelare invertendo il tubo per evitare il sangue di unccumulation nel tappo e successiva filtrazione durante la centrifugazione.
4. Aggiungere 13 ml di Ficoll-Paque (vedi Materiali e tavolo Equipment), a un nuovo tubo conico capacità di 50 ml. Mantenere il tubo verticalmente nel rack.
5. Usando una pipetta di trasferimento, prendere il sangue diluito, toccare la punta della pipetta di trasferimento alla parete interna del tubo vicino alla cima. Con pressione lenta e costante, trasferire il sangue lungo la parete interna del tubo formare uno strato sangue sulla parte superiore dello strato di saccarosio. Eseguire questa operazione più volte fino a che tutto il sangue è stato trasferito.
6. Chiudere la provetta e centrifugare saldamente il tubo a temperatura ambiente per 30 min a 700 xg in un rotore battente con set accelerazione medio 5, e decelerazione impostato a zero.
7. Lentamente estrarre il tubo e senza disturbare gli strati, si torna a prendere l'armadio biosicurezza.
8. Raccogliere accuratamente il cappotto buffy (sottile strato nuvoloso bianco), dove si trovano PBMC, posto tra il PBS / plasma unnd strati ficoll con una pipetta di trasferimento. Evitare di raccogliere strato di saccarosio e non disturbare lo strato di globuli rossi.
9. Trasferire il buffy coat in un nuovo tubo conico sterile 50 ml. Si può richiedere più volte di ripetere passo 1.8 per raccogliere tutti i PBMC.
10. Aggiungere PBS pH 7,4 al tubo con PBMC e riempire fino alla tacca 45 ml. Agitare bene il tubo. Non fare vortex.
11. Lavare 1: Centrifugare per 15 min a 480 xg sia massima accelerazione e decelerazione impostato 9. Osservare formazione di un pellet di PBMC sul fondo della provetta conica.
12. Eliminare il PBS (surnatante) in un becher di plastica con 10 ml di candeggina.
13. Allentare pellet delicatamente "travaso" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Non fare vortex.
14. Aggiungere 25 ml di PBS fresco pH 7.4 al tubo. Se più di un tubo viene elaborato, riunire i pellets insieme in questa fase.
15. Lavare 2: Centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 xg with sia massima accelerazione e decelerazione impostato su 9.
16. Eliminare il PBS (surnatante) nel bicchiere di plastica con una spruzzata di candeggina.
17. Delicatamente "rack" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Non fare vortex.
18. Aggiungere 25 ml di PBS fresco al tubo.
    1. Estrarre 50 ml di cellule e trasferire in una provetta per il conteggio redditività.
    2. Aggiungere un importo pari (50 ml) di trypan blu (una macchia vitalità) e pipetta su e giù per mescolare delicatamente.
19. Estrarre 10 ml e trasferirlo ad un emocitometro per verificare la vitalità delle cellule per ml. Registrare il numero di cellule / ml.
20. Estrarre la quantità desiderata di cellule e centrifugare la provetta per 12 min a 480 xg sia massima accelerazione e decelerazione impostato 9.
21. Eliminare il PBS (surnatante) nel bicchiere con candeggina.
22. Delicatamente "rack" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Aggiungere 80 ml di PBS nel tubo.

2. Rendere Slide PBMC

1. Mettere 80 ml di cellule su un vetrino da microscopio. Spalmare il goccia con l'aiuto di un'altra diapositiva o collocare 2 gocce di 40 microlitri ciascuno su entrambe le estremità della slitta.
2. Lasciare diapositiva nella cappa di sicurezza biologica ad asciugare. Etichettare il vetrino con una matita sul lato opaco.

3. Fissaggio dei campioni sulle diapositive

1. Preparare la soluzione fissativa miscelando 0,5 ml di 37% di formaldeide al 4,5 ml di 99% di etanolo.
2. Dopo i vetrini vengono essiccati, estrarre 2 ml della soluzione di fissativo fresco e versarlo sul vetrino in modo che l'intera superficie del vetrino è coperto.
3. Lasciare la soluzione sul vetrino per 1 min. Sciacquare il vetrino per 1 min con acqua corrente e lasciare asciugare all'aria.

4. Rendere la soluzione di amilasi per controllo negativo

1. Prendere 0,25 g di polvere di amilasi e sciogliere in 50 ml di diacqua calmato. Versare la soluzione in un becher da 100 ml pulito.
2. Immergere il vetrino nel becher in modo che la metà del vetrino riceve il trattamento e l'altra metà rimane non trattato e quindi incubare per 15 min a temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Prendere nota su quale lato della diapositiva sta ricevendo il trattamento amilasi. Tracciare una linea sul retro del vetrino indicare il confine tra il trattamento e di controllo.
4. Lavare i vetrini con DDH ₂ O per rimuovere la soluzione amilasi e lasciare la diapositiva di aria secca.

5. Eseguire Periodic Acid Schiff (PAS) colorazione e Imaging

NOTA: i reagenti PAS sono tossici per inalazione e sono corrosivi, così i passi devono essere fatte in una cappa, ed i prodotti di scarto devono essere smaltite in conformità alle linee guida istituzionali.

1. Posizionare il vetrino su una superficie piana e versare 1,50-2,00 ml di soluzione di acido periodico sul campione. Incubate per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Sciacquare i vetrini in varie accuse di acqua distillata.
3. Versare 1,50-2,00 ml di reagente di Schiff sul vetrino ed incubare a temperatura ambiente per 15 min.
4. Lavare il vetrino con acqua distillata per 5 minuti e lasciare asciugare.
5. Applicare mezzo di montaggio 10 ml sul vetrino e coprire con due piccole lamelle, o applicare 50 ml e utilizzare una grande coprioggetti.
6. Applicare smalto trasparente sui bordi del vetrino, lasciare asciugare per una notte.

6. Ottenere immagini con la luce microscopio binoculare Uso Obiettivo 100X

Risultati

Per convalidare i reagenti e la tecnica di base, colorazione PAS è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore su sezioni muscolari del mouse soleo. La colorazione è stato fatto stesso giorno del sacrificio e nell'ultimo passaggio della colorazione, le sezioni sono state fissate dal xilene. Il muscolo soleo è nota la presenza di ~ 35% di glicogeno-positivo cellule ^9. Le cellule muscolari colorate visualizzate due distinte granuli puntiformi Caratteristiche-PAS-positiva all'interno della cellula, e una...

Discussione

Le fasi critiche di questo articolo video erano durante il lavaggio e amilasi trattamento delle cellule. Mentre si lava le diapositive, il passo fondamentale stava usando una bottiglia di plastica di lavaggio squeezable e lasciando scorrere l'acqua dolcemente attraverso il campione sul vetrino e non puntando direttamente sui campioni. Anche la minima pressione dell'acqua diretta potrebbe causare le cellule a venire fuori la diapositiva. Un altro passo fondamentale è stato quello di utilizzare lo stesso scivolo p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Periodic Acid Shiff	Sigma-Aldrich	395B	Portare a temperatura ambiente prima dell'uso. I materiali contenuti nel kit sono tossici e nocivi. Usare cautela.
α-Amilasi dal pancreas di suino	Sigma-Aldrich	A3176
Microscopio Binoculare	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kit per Saggio del Glicogeno	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polimero sintetico non ionico di saccarosio.
Centrifuga			Per l'isolamento dei PBMC, sono stati utilizzati rotorini a cestello oscillante.