Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Sommario

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Abstract

Non è stata scoperta alcuna cura per la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di perdita della vista nelle persone di età superiore ai 55 anni. L'AMD è una malattia multifattoriale complessa con un'eziologia sconosciuta, anche se si ritiene che si verifichi a causa della morte o della disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato di cellule che sta alla base della retina e fornisce un supporto critico per i fotorecettori. Le strategie di sostituzione delle cellule RPE possono essere molto promettenti per fornire sollievo terapeutico a un ampio sottogruppo di pazienti con AMD e le cellule RPE che assomigliano fortemente alle cellule umane primarie (hRPE) sono state generate in più laboratori indipendenti, incluso il nostro. Inoltre, gli usi dell'iPS-RPE non si limitano alle terapie cellulari, ma sono stati utilizzati anche per modellare le malattie da RPE. Questi tipi di studi possono non solo chiarire le basi molecolari delle malattie, ma anche servire come strumenti inestimabili per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi farmaci. Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per la differenziazione diretta dell'RPE dalle cellule staminali. L'aggiunta di nicotinamide e di activina A o IDE-1, una piccola molecola che ne imita gli effetti, in momenti specifici, aumenta notevolmente la resa delle cellule RPE. Utilizzando questa tecnica possiamo ricavare un gran numero di RPE a basso passaggio già in tre mesi.

Introduzione

I vari tipi di cellule che occupano la retina sono organizzati in un'architettura funzionale. I fotorecettori nella parte posteriore della retina sono responsabili della conversione della luce in impulsi elettrici attraverso la fototrasduzione. Tuttavia, la fototrasduzione non può avvenire senza gli sforzi coordinati di altri tipi di cellule vicine, tra cui la glia di Mueller e le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Un monostrato di cellule RPE divide la retina sensoriale dalla coriocapillare, l'irroramento di sangue primario per i fotorecettori, e si trova in una posizione ideale per controllare molteplici funzioni importanti per l'omeostasi dei fotorecettori. In effetti, l'EPR e i fotorecettori sono così co-dipendenti da essere ampiamente considerati come un'unica unità funzionale. (Per una rassegna di tutte le diverse funzioni dell'RPE si veda Strauss, 2005¹.) La morte o la disfunzione delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico può indurre la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nei paesi industrializzati^2-4.

AMD è una malattia multifattoriale dell'EPR, dei fotorecettori e della vascolarizzazione coroideale; i fattori di rischio sono diversi e includono combinazioni di influenze ambientali e genetiche^5,6. I trattamenti per l'AMD sono molto limitati, ma una potenziale terapia promettente è la sostituzione delle cellule RPE^7,8. Sebbene i risultati siano stati contrastanti, il trapianto di cellule RPE in pazienti con AMD (e in altri pazienti con degenerazione retinica) e anche in modelli di degenerazione retinica di roditori, ha il potenziale per prevenire transitoriamente una significativa atrofia dei fotorecettori^9-23. (Il modello animale comunemente usato per questi studi sono i ratti del Royal College of Surgeons (RCS), che ospitano una mutazione nel gene MerTK. Questa mutazione rende le cellule RPE incapaci di fagocitare i segmenti esterni dei fotorecettori e promuove la degenerazione retinica²⁴.) Mentre i tassi di sopravvivenza riportati di RPE impiantati nello spazio sottoretinico di ratti e topi RCS variano notevolmente, esiste il potenziale per loro di sopravvivere per diversi mesi o anni^9,10,12,20.

Le cellule RPE possono essere ottenute in numero sufficiente per il trapianto derivandole da cellule staminali pluripotenti^9-14,25-28. Diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che queste cellule funzionano in modo simile alle loro controparti somatiche e studi a lungo termine suggeriscono che sono sicure dopo l'impianto in modelli di malattia di ratto e topo^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte al posto delle cellule staminali embrionali può essere vantaggioso poiché le questioni etiche e le sfide immunologiche associate all'RPE allogenica possono essere ovviate^33,34. Un'altra interessante applicazione per la tecnologia iPS è la modellazione della malattia³⁵. La capacità di interrogare un gran numero di cellule RPE derivate da pazienti con malattie da RPE potrebbe essere preziosa per comprendere le loro basi molecolari. Questo tipo di studio è stato condotto di recente con il paziente con malattia Best RPE e potrebbe aprire la strada a studi simili sulle maculopatie ereditarie³⁶.

La derivazione dell'RPE dalle cellule staminali è un processo relativamente semplice e può essere fatto interamente in condizioni prive di xeno. La strategia più semplice consiste nel derivare spontaneamente monostrati di cellule RPE, tuttavia, la resa può essere significativamente migliorata utilizzando tecniche di differenziazione diretta. Ma queste tecniche comportano l'uso di fattori proteici esogeni che possono essere costosi e spesso generati nei batteri o in altre fonti non umane^10,12,37. Nei nostri studi abbiamo seguito un protocollo¹⁰ stabilito che utilizza nicotinamide e activina A, un fattore di segnalazione che si è dimostrato sufficiente per la specifica RPE³⁸. Qui dimostreremo che la piccola molecola IDE-1 può sostituire adeguatamente l'activina A, riducendo così i costi e alleviando le preoccupazioni associate all'uso di proteine ricombinanti³⁹. Inoltre, utilizziamo la sostituzione del siero priva di xeno e coltiviamo le cellule RPE differenzianti su un substrato sintetico privo di xeno. In precedenza è stato dimostrato che le cellule RPE si differenziano in modo molto efficace utilizzando questo approccio⁴⁰.

Quando differenziato come monostrato, visualizziamo colonie pigmentate contenenti cellule RPE già dopo cinque settimane¹². Una volta raggiunte le dimensioni sufficienti, possono essere asportate manualmente e trasferite in un'altra piastra per l'espansione. Le cellule RPE sono note per la dedifferenziazione ad ogni passaggio e l'uso di qualsiasi cosa più vecchia di cinque passaggi dovrebbe essere evitato (troviamo che un numero sufficiente di cellule per la caratterizzazione e il trapianto in modelli animali può essere facilmente generato dopo due o tre passaggi). Una volta completamente differenziate, impieghiamo molteplici tecniche per caratterizzare le cellule anatomicamente e funzionalmente per garantire che servano come sostituti adeguati per l'RPE malato. La descrizione di queste tecniche e il protocollo per l'impianto di iPS-RPE nello spazio sottoretinico dei roditori esulano dallo scopo di questo articolo sui metodi e sono stati precedentemente pubblicati^12,32,41.

Sebbene lo sviluppo di protocolli standardizzati per una derivazione efficace di iPS-RPE sia chiaramente importante per le cliniche, c'è anche un significativo lavoro preclinico da fare nei modelli animali. Ci sono preoccupazioni riguardo all'immunogenicità delle cellule derivate da iPS e diverse tecniche di impianto, incluso l'impianto di cellule su substrati artificiali, sono in fase di studio^42,43. Per questi motivi, riteniamo che la pubblicazione di protocolli standardizzati sia vantaggiosa per facilitare gli studi sia clinici che preclinici. Soprattutto se verranno effettuati confronti diretti di cellule iPS-RPE derivate in diversi laboratori da diversi gruppi di ricerca.

Protocollo

1. differenziazione Regia di Stem Cell-RPE derivati

NOTA: Tutte le fasi di incubazione sono eseguite a 37 ° C in 5% CO ₂

1. Mantenere le linee hES o anche (sfamare giorno) in mezzi di manutenzione (MM; Tabella 1). Una volta che le linee hanno raggiunto un livello sufficiente di controllo della qualità, li mantengono su uno strato di cellule feeder embrionali di topo (MEF) seminate ad una densità di 250.000 / pozzetto di una piastra ben sei. Culture senza Xeno possono anche essere generati seguendo il protocollo stabilito dalla Tucker et al. ^40.
2. Lasciare le colonie di cellule staminali per raggiungere confluenza.
3. Passare ai media differenziazione Nicotinamide (DM / NIC, tabella 1); alimentare quotidiano.
4. Dopo tre settimane di cultura, passare a mezzi di differenziazione con nicotinamide e sia Activin-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1; Tabella 1) per migliorare la differenziazione RPE.
5. Dopo cinque settimane di cultura, tornare a DM / NIC. Poppate giornaliere non sono più necessarie, una volta gli indicatori di pH nei fermata supporto girando giallo il giorno dopo la poppata.
6. Attendere isolotti di cellule pigmentate a comparire che sono abbastanza grandi per essere tagliato e rimosso (vedi figure 2D-F e 3A).

2. isolanti pigmentate Islets

1. Rivestire le pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con una matrice che simula l'ambiente naturale delle cellule (senza xeno è preferibile).
   NOTA: le lame affilate, cornea e pinze dalla punta sottile sono molto utili per la raccolta. L'intero foglio di cellule differenziate possono staccarsi mentre la raccolta. Evitare questo lavorando con attenzione e inizialmente raccolta colonie nel centro del piatto.
2. Riempire altrettanti pozzetti della piastra 24 pozzetti con i media differenziazione (DM; Tabella 1) come necessario. Questa decisione dipenderà dal numero di colonie pigmentateraccolti.
3. In una cappa di coltura cellulare con un ambito dissezione, tagliate manualmente isolotti pigmentate. Tritare ogni isolotto sul fondo del piatto originale utilizzando un bisturi in circa 2-6 pezzi e afferrare le parti pigmentate con pinze taglienti.
4. Trasferire 1-2 pezzi pigmentate in ogni 24 pozzetti.
5. Non modificare i media per 3-5 giorni fino cellule aderiscono, quindi iniziare a cambiare i media tre volte a settimana. (Se non aderiscono dopo questo tempo, la probabilità è bene che non lo farà mai).
6. Espandere le cellule per 3-4 settimane a supporto di differenziazione (DM; Tabella 1) - L'immagine di una cultura tipica è mostrato in figura 3B. Le cellule non possono ancora riempire tutto bene, ma aspettare più a lungo non sembra aiutare. Concime cellule tre volte alla settimana.
7. Dopo circa 3 settimane, rimuovere manualmente gruppi di globuli bianchi in gruppi, se necessario, con una pinza taglienti. Non fare questo passo se non è necessario - è facile introdurre contaminanti. E 'ideale percercare di ottenere più pure popolazioni RPE dalle colonie pigmentate originali al punto 1.6.

RPE 3. Passaging Stem-Cell derivati

1. Staccare cellule con 200 microlitri con una soluzione di dissociazione cellulare (preferibilmente non tripsina-un reagente che può essere inattivato mediante diluizione è preferibile) per 5-8 minuti a 37 ° C, e inattivare esso diluendo con DM. Utilizzare una pipetta 200 microlitri per lavare via tutte le cellule e risospendere loro (Se il pozzetto selezionato contiene solo poche cellule, prendere in considerazione la messa in comune le cellule da due 24 pozzetti).
2. Centrifuga (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 3 ml DM media.
3. Cellule Re-piastra da uno (o due) 24 pozzetti in una matrice rivestite 6 pozzetti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 5 di espansione).
4. Espandere per 1-2 settimane, fino a quando le cellule sono ~ 90% confluenti; l'immagine di coltura pura completamente differenziata è mostrato in Figura 3C.
5. Staccare le cellule con 1 ml di cellule dSoluzione issociation per circa 5-8 minuti a 37 ° C, inattivare dal diluizione con DM, utilizzare 1.000 microlitri pipetta per lavare via tutte le cellule, e risospendere.
6. Spin down (800 xg per 5 minuti), scartare il surnatante e risospendere in 18 ml DM media.
7. Cellule Re-piastra da 6 pozzetti uno ciascuno in sei matrice 6-pozzetti rivestiti in 3 ml di DM per pozzetto (1: 6 espansione) o uno rivestite 75 centimetri ² beuta (1: 7,5 espansione).
8. Ripetere i passaggi 3,4-3,8 necessaria fino a quando si ottengono abbastanza cellule.
   NOTA: cercare di raccogliere il maggior numero possibile di colonie di espansione piuttosto che la pianificazione di amplificare le culture attraverso passaging poiché ogni passaggio induce RPE dedifferentiation.

Risultati

La procedura descritta in questo manoscritto, come illustrato nella figura 1, possono essere utilizzati per generare facilmente RPE da cellule staminali come precedentemente riportato ^10,12. Dopo aver mantenuto le linee iPS per diverse settimane, colonie pigmentate cominciano ad apparire nelle colonie dopo 5-7 settimane (7 settimane vecchie culture sono mostrati in figura 2A-C). Queste colonie possono continuare a crescere per settimane come le culture sono mantenuti. Una vol...

Discussione

In questo manoscritto abbiamo delineare i passi per generare in modo efficiente grandi quantità di culture iPS-RPE puri. Abbiamo dimostrato in precedenza con questo protocollo di differenziazione diretto con Activin A che possiamo generare iPS-RPE che assomigliano fortemente hRPE base di trascrittomica, proteomica, metabolomica, e funzionalità, e che ritardare la degenerazione retinica quando impiantato in ratti RCS ^12,31,32 . Il processo di generazione IPS-RPE richiede molto tempo, ma non laboriosa (...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coltello corneale	Coltello Surgipro	SPOI-070	x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1X senza Ca o Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Siero fetale bovino, regolare (inattivato dal calore)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Proteine umane ricombinanti	Life Technologies	PHG0021	100 &; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Siero di Ricambio Life	Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutammina 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Activina ricombinante umana/murina/di ratto	PeproTech	120-14E	10 µ g x 2
piastre a 6 pozzetti per superficie Synthemax-T	Corning	3877	(12) x 1
enzima TrypLE-Express (1X), senza rosso fenolo	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Filtro sottovuoto/sistema di bottiglie di stoccaggio, 0,1µ m poro, 500ml	Corning	431475	Custodia(12) x 1