Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Sommario

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Abstract

Non è stata scoperta alcuna cura per la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di perdita della vista nelle persone di età superiore ai 55 anni. L'AMD è una malattia multifattoriale complessa con un'eziologia sconosciuta, anche se si ritiene che si verifichi a causa della morte o della disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato di cellule che sta alla base della retina e fornisce un supporto critico per i fotorecettori. Le strategie di sostituzione delle cellule RPE possono essere molto promettenti per fornire sollievo terapeutico a un ampio sottogruppo di pazienti con AMD e le cellule RPE che assomigliano fortemente alle cellule umane primarie (hRPE) sono state generate in più laboratori indipendenti, incluso il nostro. Inoltre, gli usi dell'iPS-RPE non si limitano alle terapie cellulari, ma sono stati utilizzati anche per modellare le malattie da RPE. Questi tipi di studi possono non solo chiarire le basi molecolari delle malattie, ma anche servire come strumenti inestimabili per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi farmaci. Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per la differenziazione diretta dell'RPE dalle cellule staminali. L'aggiunta di nicotinamide e di activina A o IDE-1, una piccola molecola che ne imita gli effetti, in momenti specifici, aumenta notevolmente la resa delle cellule RPE. Utilizzando questa tecnica possiamo ricavare un gran numero di RPE a basso passaggio già in tre mesi.

Introduzione

I vari tipi di cellule che occupano la retina sono organizzati in un'architettura funzionale. I fotorecettori nella parte posteriore della retina sono responsabili della conversione della luce in impulsi elettrici attraverso la fototrasduzione. Tuttavia, la fototrasduzione non può avvenire senza gli sforzi coordinati di altri tipi di cellule vicine, tra cui la glia di Mueller e le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Un monostrato di cellule RPE divide la retina sensoriale dalla coriocapillare, l'irroramento di sangue primario per i fotorecettori, e si trova in una posizione ideale per controllare molteplici funzioni importanti per l'omeostasi dei fotorece....

Protocollo

1. differenziazione Regia di Stem Cell-RPE derivati

NOTA: Tutte le fasi di incubazione sono eseguite a 37 ° C in 5% CO ₂

1. Mantenere le linee hES o anche (sfamare giorno) in mezzi di manutenzione (MM; Tabella 1). Una volta che le linee hanno raggiunto un livello sufficiente di controllo della qualità, li mantengono su uno strato di cellule feeder embrionali di topo (MEF) seminate ad una densità di 250.000 / pozzetto di una piastra ben sei. Culture senza Xeno possono anche essere generati seguendo il protocollo stabilito dalla Tucker et al. ^40.
2. La....

Risultati

La procedura descritta in questo manoscritto, come illustrato nella figura 1, possono essere utilizzati per generare facilmente RPE da cellule staminali come precedentemente riportato ^10,12. Dopo aver mantenuto le linee iPS per diverse settimane, colonie pigmentate cominciano ad apparire nelle colonie dopo 5-7 settimane (7 settimane vecchie culture sono mostrati in figura 2A-C). Queste colonie possono continuare a crescere per settimane come le culture sono mantenuti. Una vol.......

Discussione

In questo manoscritto abbiamo delineare i passi per generare in modo efficiente grandi quantità di culture iPS-RPE puri. Abbiamo dimostrato in precedenza con questo protocollo di differenziazione diretto con Activin A che possiamo generare iPS-RPE che assomigliano fortemente hRPE base di trascrittomica, proteomica, metabolomica, e funzionalità, e che ritardare la degenerazione retinica quando impiantato in ratti RCS ^12,31,32 . Il processo di generazione IPS-RPE richiede molto tempo, ma non laboriosa (.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coltello corneale	Coltello Surgipro	SPOI-070	x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1X senza Ca o Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Siero fetale bovino, regolare (inattivato dal calore)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Proteine umane ricombinanti	Life Technologies	PHG0021	100 &; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Siero di Ricambio Life	Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutammina 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Activina ricombinante umana/murina/di ratto	PeproTech	120-14E	10 µ g x 2
piastre a 6 pozzetti per superficie Synthemax-T	Corning	3877	(12) x 1
enzima TrypLE-Express (1X), senza rosso fenolo	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Filtro sottovuoto/sistema di bottiglie di stoccaggio, 0,1µ m poro, 500ml	Corning	431475	Custodia(12) x 1

Custodia