Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.
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Articolo metodologico
Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all'uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell'uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.
Introduzione
Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi 1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea 3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l'infiammazione e la riparazione di 4,5. Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basa....
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Protocollo
Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee.
Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board.
1. Ottenere Mouse o Esofago umano
- Ottenere mouse Esofago:
- Euthanize il 8-12 giorno vecchio mouse con 2% isoflurano overdose inalanti seguita da dislocazione cervicale.
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Risultati
Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l'intera are.......
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Discussione
Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L'età dei topi è anche un passaggio crit.......
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Dichiarazioni
Questo lavoro è supportato da NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Campana Institute of Health e Nutrition Research Scholar Award in Gut Fisiologia e la salute (AS) e Wright Foundation Pilot Award (AS).
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per colture tissutali | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenasi XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitolo | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrina | Roche | 10-652-202-001 | |
| tripsina/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Fattore di crescita epidermico | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagenti per l'immunocolorazione del | |||
| siero di capra | Sigma Aldrich | G9023 | |
| MAB di topo a α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Coniglio pAB a vimentina | abcam | ab45939 | |
| Cy2 coniugato Capra anti Coniglio | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 coniugato a eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 coniugato a APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V e 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Blocco Fc per topo per CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Attrezzatura | |||
| Provetta da 5 ml | Eppendorf | 30108310 | |
| Microscopio invertito | Motic | AE31 | |
| Armadio e incubatori di biosicurezza | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4 vetrini a camera | Thermo Scientific | 177437 | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Sistema di filtraggio a vuoto | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Microscopio fluorescente | Nikon | Eclipse TE300 | |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| T25 Palloni | TRP | 90026 | |
| T75 Fiasche | Corning | 43064 | |
| Forbici | |||
| Pinze per dissezione Cotton | |||
| Tips a punta singola | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Software Metamorph (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience |
Riferimenti
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol.
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Ristampe e permessi
