Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Sommario

Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.

Abstract

Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all'uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell'uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.

Introduzione

Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi ^1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea ^3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l'infiammazione e la riparazione ^{di 4,5.} Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basale all'interfaccia tra l'epitelio e lamina propria e sono definiti come α-SMA e vimentina positivo, pan-citocheratina negative, e debolmente positivo o negativo desmina ^5.

Lo stroma esofagea non è stato rigorosamente caratterizzato a livello cellulare o molecolare. Il nostro lavoro in esofago murino ha demonstrated α-SMA cellule e vimentina nello stroma esofageo, di tanto in tanto soggiacenti alla epitelio squamoso ^6. Interazioni epiteliali-stromale sono stati implicati in alterazioni della mucosa esofagea quali gastro-esofageo danno mediato ⁶ e esofagite eosinofila ^3. Stenosi fibrotiche sono anche una complicanza nota di cellule stromali e lesioni esofagee sono stati implicati nella patogenesi della fibrosi gastrointestinale. L'isolamento di queste cellule aiuterà compiere gli studi necessari per indagare vie di segnalazione squilibrati.

Questa presentazione fornisce le tecniche necessarie per stabilire colture primarie di α-SMA positive, miofibroblasti positivi vimentina tale che le lacune esistenti nella conoscenza per quanto riguarda le vie di segnalazione che mediano queste interazioni possono essere affrontati. La tecnica descritta è stata utilizzata con successo dagli autori per stabilire miofibroblasti primari murini colon ⁷ e further adattato per l'istituzione di murine ⁶ e cellule stromali esofagee miofibroblasti come umani.

Qui descriviamo le condizioni necessarie per realizzare e caratterizzare queste culture stabilite dal mouse o esofago umano prima dell'uso in studi funzionali futuri. Le culture possono essere coltivate e utilizzate fino a 15 passaggi. Isolamento e la creazione di colture primarie tramite le modalità descritte di seguito genera cellule stromali con fenotipo miofibroblasti; α-SMA, vimentina positivo, e debolmente positivo o negativo per la desmina, e citocheratina negativo. Questo fenotipo è distinto dal fenotipo del fibroblasto esofageo che è prevalentemente vimentina positivo, α-SMA negative ³ o α-SMA positive, vimentina fenotipo negativo della muscolaris mucosae ^6.

Protocollo

Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee.

Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board.

1. Ottenere Mouse o Esofago umano

1. Ottenere mouse Esofago:
   1. Euthanize il 8-12 giorno vecchio mouse con 2% isoflurano overdose inalanti seguita da dislocazione cervicale.
   2. Pin dell'animale con la pancia rivolta verso l'alto e bagnare la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Con pinze, afferrare e sollevare la pelle anteriori all'apertura uretrale con una pinza. Usare le forbici chirurgiche standard, dritto per tagliare lungo la linea mediana ventrale dall'apertura uretrale al mento. Fare attenzione a tagliare solo la pelle.
   3. Fare un'incisione dall'apertura verso il basso per il ginocchio su entrambi i lati di un animale uretrale, formando una testa in giù "Y". Fare un'altra incisione su entrambi i lati di un animale lungo la gabbia toracica.
   4. Sbucciare con cura la pelle su entrambi i lati, al largo del peritoneo sottostante e la gabbia toracica, e porre ai lati. Esaminate la gabbia toracica sovrastante la cavità toracica e il peritoneo sovrastante la cavità addominale.
      1. Sollevare il peritoneo con una pinza e tagliare fino alla gabbia toracica e diaframma, che punta verso l'alto le forbici per evitare danni al contenuto addominale. Sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato, esporre lo stomaco sottostante, la giunzione esofago-gastrica e la porzione addominale dell'esofago.
   5. Usare le forbici chirurgiche in autoclave per tagliare lo sterno e costole lungo la linea mediana fino alla cintura cervicale. Forbici Point verso l'alto per evitare di danneggiare il contenuto del torace. Esporre completamente il contenuto delcavità toracica tirando la gabbia toracica ai lati.
   6. Rimuovere delicatamente il cuore e entrambi i lobi dei polmoni. Assorbire il sangue in eccesso con Q-punte. L'esofago toracico è una stretta, tubo mentire posteriore flessibile alla trachea e anteriore al vertebra toracica.
      NOTA: L'esofago può essere difficile da individuare nei neonati murini. La localizzazione della giunzione esofago-gastrica rende identificazione esofageo semplice.
   7. Seguire attentamente l'esofago dallo stomaco, sezionando il circostante vascolare, grasso e mesentere tutta la strada fino all'origine esofagea nella cavità cervicale. Forbici chirurgiche con punta smussata funzionano meglio per questo scopo.
   8. Resecare l'intera lunghezza dell'esofago e posto in soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) per l'ulteriore elaborazione descritto di seguito. Rimuovere una porzione dello stomaco per orientazione se desiderato.
      NOTA: A causa delle dimensioni piccole del tessuto, la separazione di muscolare propria del muscoloè mucosa non è realizzabile in murino neonato esofago e l'intero esofago è sottoposto al trattamento descritto di seguito.
2. Ottenere Esofago umano:
   1. Lavare i campioni di resezione esofagea (in genere 5 cm o meno) con HBSS e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, il grasso, o vascolare allegato.
   2. Resecare una porzione del campione e porre in formalina per futuro esame istologico se desiderato.
   3. Separare i restanti mucosa dal sottostante muscolare propria da dissezione tagliente.
   4. Tagliare mucosa in frammenti sub centimetri e soggetti al protocollo descritto di seguito.
      NOTA: resezioni esofago umani può essere conservato in PBS per un massimo di 6 ore prima del trattamento descritto di seguito. Fonte di esemplari esofagectomia detterà le dimensioni del campione e sarà dipendente da laboratorio.

2. Isolare murini ed umani esofageo stromali Cells

1. Isolare cellule stromali esofagee from murino e tessuti umani da una combinazione di digestione enzimatica e meccanica.
   1. Meccanicamente digerire sminuzzando il tessuto con le forbici e molteplici lavaggi con HBSS. Enzimaticamente digerire incubando il tessuto con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 min (tessuto murino) o fino a 6 ore (tessuti umani). Assicurarsi che gli strumenti utilizzati per la macinazione sono stati autoclavato e sterilizzato.
      NOTA: collagenasi sono enzimi che degradano il collagene, una proteina della matrice extracellulare responsabile per lo svolgimento di tessuti animali insieme. Collagenase XI ha un'elevata attività collagenasi e ha visto il successo in questo protocollo isolamento. Dispasi è un enzima batterico con lieve attività proteolitica dissociazione che conserva l'attività membrana cellulare ed è utilizzato in combinazione con collagenasi come un enzima secondario.
   2. Mettere i frammenti della mucosa ottenuti da mouse o tessuti umani in 1,7 ml di micro-centrifuga o 5 ml provette contenenti rispettivamente, HBSS. Tessuto Mince ulteriormentein 2-3 pezzi mm con le forbici con una larghezza punta aperta che si adatta in rispettive provette. Lasciare tempo sufficiente per consentire frammenti mucosa esofagea a sedimentare sul fondo della provetta.
   3. Lentamente decantare HBSS, facendo attenzione a non eliminare inavvertitamente il tessuto. Sostituire con fresco HBSS seguito da un leggero scuotimento. In alternativa, rimuovere HBSS con una pipetta 1 ml.
   4. Lavare il tessuto in questo modo un totale di 8 volte con agitando delicatamente tra lavaggi permettendo tempo per frammenti esofagee a sedimentare tra ogni lavaggio.
      NOTA: il tessuto umano richiederà più tritare che il tessuto del mouse neonato.
2. Incubare tessuto murino con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 minuti su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente.
   1. Incubare tessuto umano con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi fino a 6 ore, su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente.
      NOTA: la disponibilità di esopha umanaGus è variabile. Mucosa esofagea umana incubate con enzimi per un massimo di 6 risultati h in successo generazione di colture primarie.
3. Dopo la digestione enzimatica, tritare il tessuto ulteriormente con le forbici e centrifugare a 200 xg per 10 min.
4. Scartare il surnatante. Trasferire il pellet, costituito da una sospensione cellulare mista in una provetta 5 ml e lavare 5 volte a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con 2% sorbitolo di eliminare le cellule non vitali e detriti.
5. Cellule seme in 6 pozzetti e la cultura in DMEM con siero fetale bovino al 10% (FB), 10 mg / ml di insulina, 10 mcg / ml transferrina, 10 mg / ml gentamicina, e 2 ng / ml il fattore di crescita epidermico (EGF) . Filtro sottovuoto (0,22 micron) tutti i componenti ad eccezione del FEG, che possono essere aggiunti dopo la filtrazione. Distribuire cellule ottenute da campioni di resezione umani tra più 6 pozzetti, a seconda delle dimensioni di resezione.
6. Una volta che i pozzi sono 80% confluenti, passaggio cellule aderenti a T25 noi Borraccieing 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Neutralizzare con i media e far girare a 400 x g.
   1. Per un passaggio 6 e ad un pallone T25, cellule di passaggio in un rapporto 1: 1. Fiasche T25 Confluent possono essere diversi passaggi in un rapporto 1: 3: 2 o 1. Per passare da un pallone in un pallone T25 T75, utilizzare un rapporto 1: 1. Cambia i media ogni 2-3 giorni, indipendentemente della nave.
   2. Crescere le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ incubatore e la cultura nei media miofibroblasti sopra descritti.
      NOTA: le cellule epiteliali non sopravvivono in queste condizioni di coltura o di passaggio. Le cellule utilizzate per la caratterizzazione e negli studi descritti di seguito sono tra i passaggi 5 e 15.
   3. Cryo-conservare le cellule in N liquido ₂ aggiungendo 10% dimetilsolfossido ai media miofibroblasti.

3. Caratterizzare murini ed umani esofageo stromali Cells

1. Esaminate la morfologia delle cellule con un microscopio invertito. Osservare il fusiformemorfologia delle cellule aderenti (Figura 1).
2. Caratterizzare cellule in coltura per la valutazione dei seguenti marcatori del citoscheletro: α-SMA, vimentina, desmina, e citocheratina. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile esprimono marcatori miofibroblasti citoscheletro α-SMA e vimentina (Figura 2).
   1. Per distinguere ulteriormente cellule stromali coltivate da cellule muscolari, immunostain per desmina. Per eseguire immunoistochimica su cellule in coltura, piatto 1,5 x 10 ⁴ cellule diapositive da camera a 4 così e crescere in mezzi miofibroblasti per 24 ore. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile avranno espressione desmin debole o assente. Cellule stromali mancano espressione del marcatore epiteliale pan-citocheratina (dati non mostrati).
      NOTA: La valutazione di culture include la valutazione dei marcatori del citoscheletro mediante immunocitochimica e superficie cellulare marcatori di citometria a flusso. Immunocitochimica viene utilizzato come metodo primario di caratterizzazione come exProfilo pressione di proteine ​​del citoscheletro è unico per la fibroblasti, miofibroblasti e cellule muscolari. Stabilisce citometria a flusso cultura purezza valutando l'espressione di superficie cellulare epiteliale, endoteliale, e cellule ematopoietiche marcatori. CD90 è utile come un metodo aggiuntivo di identificare cellule stromali umane si esprime su entrambi i fibroblasti umani e miofibroblasti. CD90 non è utile per la caratterizzazione di cellule stromali murine come anche espresso dalle cellule T murine.
3. Dopo cellule raggiungono il 60% di confluenza, risciacquare diapositive con tampone fosfato salino (PBS) e fissare con metanolo. Incubare le cellule in metanolo per 10 min a -20 ° C, quindi memorizzare in PBS a 4 ° C fino al momento dell'uso.
4. Seguire protocollo immunostaining standard.
5. Brevemente, prima di applicare l'anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con 5% goatserum in PBS. Diluire gli anticorpi primari e secondari nel siero di capra 5% pure.
   1. Per il rilevamento di α-SMA e vimentina, utilizzare ilseguenti anticorpi e concentrazioni: mouse mAB di α-SMA a 1: 250 diluizione e coniglio pAB a vimentin a 1: 500 di diluizione.
   2. Incubare con l'anticorpo primario a temperatura ambiente per una notte a 4 ° C, lavare 3 volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari Rodamina capra coniugato anti-topo a una diluizione di 1: 200 e Cy2 capra coniugato anti- coniglio ad una diluizione di 1: 1000 per 1 hr a temperatura ambiente.
   3. Nuclei di contrasto con 4 ', 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) ad una concentrazione di 1 mg / ml per 1 min e poi lavare con PBS. Analizzare vetrini con un microscopio invertito.
6. Stabilire purezza delle culture esame delle cellule esofagee murine e umane per ematopoietiche (CD45) e endoteliale (CD31) marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso (Figura 3). Caratterizzare cellule umane ulteriormente espressione del cellule stromali marcatore di superficie CD90.
   NOTA: CD90 non può essere utilizzato per identificare le cellule stromali murine come murine T cells esprimono CD90.
   1. Staccare coltivate cellule stromali del mouse esofageo dalle beute di coltura mediante trattamento con cellule non-enzimatica dissociazione soluzione a 37 ° C per 10 minuti, lavate con tampone FACS due volte, contate e colorati con FITC-CD45 e CD31-APC con relativi controlli isotipici, secondo alle procedure standard di colorazione.
   2. Raccogliere cellule utilizzando FACS Calibur e analizzare i dati con il software FlowJo. Prima di cellule colorazione, ottimizzare gli anticorpi e titolare concentrazioni con controlli isotipici, normale milza del mouse, e le cellule del midollo osseo.

Risultati

Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l'intera are...

Discussione

Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L'età dei topi è anche un passaggio crit...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti per colture tissutali
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenasi XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitolo	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrina	Roche	10-652-202-001
tripsina/EDTA	Corning	25-052-Cl
Fattore di crescita epidermico	Sigma-Aldrich	E9644
Reagenti per l'immunocolorazione del
siero di capra	Sigma Aldrich	G9023
MAB di topo a α-SMA	abcam	ab7817
Coniglio pAB a vimentina	abcam	ab45939
Cy2 coniugato Capra anti Coniglio	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 coniugato a eFluor 450	eBioscience	48-0319-41
CD90 coniugato a APC	eBioscience	17-0909-41
Annexin V e 7AAD	BD Pharmigen	559763
Blocco Fc per topo per CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Attrezzatura
Provetta da 5 ml	Eppendorf	30108310
Microscopio invertito	Motic	AE31
Armadio e incubatori di biosicurezza	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4 vetrini a camera	Thermo Scientific	177437
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5810R
Olympus Sistema di filtraggio a vuoto	Genesee Scientific	25-227
Microscopio fluorescente	Nikon	Eclipse TE300
Piastre a 6 pozzetti	Corning	3516
T25 Palloni	TRP	90026
T75 Fiasche	Corning	43064
Forbici
Pinze per dissezione Cotton
Tips a punta singola	Kendall	540500
Software
Software Metamorph (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience

da dissezione