Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

Sommario

I macrofagi sono le cellule chiave coinvolte nella patogenicità dell'ospite. I macrofagi mostrano una diversità fenotipica e funzionale che può essere analizzata e rilevata mediante analisi proteomica. Questo articolo descrive come eseguire l'elettroforesi 2D di colture primarie di macrofagi umani differenziati in fenotipo M1 o M2.

Abstract

L'obiettivo del protocollo di elettroforesi bidimensionale (2D) qui descritto è mostrare come analizzare il fenotipo dei macrofagi umani coltivati. Il ruolo chiave dei macrofagi è stato dimostrato in vari disturbi patologici come malattie infiammatorie, immunologiche e infettive. In questo protocollo, utilizziamo colture primarie di macrofagi umani derivati da monociti che possono essere differenziati nel fenotipo M1 (pro-infiammatorio) o M2 (anti-infiammatorio). Questo modello in vitro è affidabile per lo studio delle attività biologiche dei macrofagi M1 e M2 e anche per un approccio proteomico. Le tecniche proteomiche sono utili per confrontare il fenotipo e il comportamento dei macrofagi M1 e M2 durante la patogenicità dell'ospite. L'elettroforesi su gel 2D è una potente tecnica proteomica per la mappatura simultanea di un gran numero di proteine o polipeptidi. Descriviamo il protocollo dell'elettroforesi 2D utilizzando coloranti fluorescenti, denominato Elettroforesi su Gel Differenziale 2D (DIGE). Le proteine macrofagiche M1 e M2 sono marcate con coloranti cianina prima della separazione mediante focalizzazione isoelettrica, in base al loro punto isoelettrico nella prima dimensione, e alla loro massa molecolare, nella seconda dimensione. Macchie proteiche o polipeptidiche separate vengono quindi utilizzate per rilevare le differenze nei livelli di espressione di proteine o polipeptidi. Gli approcci proteomici qui descritti consentono di studiare i cambiamenti delle proteine dei macrofagi associati a vari disturbi come la patogenicità dell'ospite o le tossine microbiche.

Introduzione

I macrofagi sono cellule eterogenee e plastica che sono in grado di acquisire fenotipi funzionali distinti. In vivo, queste cellule rispondono ad una grande varietà di micro signalssuch ambientale come prodotti microbici, citochine, ecc. ^1. In vitro, il fenotipo pro-infiammatorio (M1) di macrofagi può essere indotta da lipopolisaccaride (LPS) e il fenotipo antinfiammatorio (M2) da alcune citochine come l'interleuchina-4 (IL-4). Inoltre, i macrofagi possono passare da una M1 M2 fenotipo attivato, e viceversa, sui segnali specifici ^2.

A seconda del fenotipo, macrofagi avranno diverse funzioni. Macrofagi M1 sono cellule che producono citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), per uccidere i microrganismi o cellule tumorali ^3. Al contrario, i macrofagi M2 evitare che queste risposta infiammatoria come nella guarigione delle ferite e la fibrosi producendo anti-inflammatorfattori y, come TGF-β ^3,4.

Cellule mononucleate del sangue periferico umani di donatori sani sono stati isolati da Ficoll centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza ⁵ utilizzando una tecnica adattata da Boyum ^6. I macrofagi in coltura possono essere differenziati in M1 o M2 fenotipo dopo 6 giorni di coltura primaria ^7.

Analisi di espressione della proteina o modifiche proteina tra i due sottotipi di macrofagi sotto vari stimoli controllati, quali patogenicità host o tossine microbiche, sarà utile per decifrare la funzionalità del pro- e macrofagi antinfiammatori.

Proteomica sono strumenti unici per il monitoraggio diretto di proteine ​​che sono specificamente up- o down-regolato nei macrofagi in coltura umani sotto vari stimoli. Coloranti fluorescenti hanno risolto alcune delle limitazioni di elettroforesi su gel 2D, come la bassa sensibilità e analisi d'immagine ^{8 <} / Sup>. I coloranti reagiscono con residui di cisteina hanno aumentato la sensibilità di rilevamento rispetto a quelli reagire con residui di lisina ^9. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato l'utilità di etichettatura saturazione DIGE per l'analisi di campioni scarse ¹⁰ rispetto al classico argento macchiato elettroforesi 2D ^11. Questa tecnologia è utile per analizzare rapidamente modificazioni proteiche tra i due sottotipi di macrofagi o tra macrofagi non trattati e trattati dallo stesso sottotipo.

I vantaggi di questa tecnica proteomica stanno avendo accesso alle informazioni di formato proteine ​​e modificazioni post-traduzionali analizzando il gel 2D ^12. Si deve tenere conto che questa non è una tecnica elevata produttività, limitando il numero di campioni che possono essere analizzati. Lo sviluppo di saggi high throughput basato su spettrometria di massa come rivisto recentemente ¹³ può migliorare questa.

_content "> Qui vi presentiamo come eseguire l'analisi 2D DIGE dall'estrazione di proteine ​​di macrofagi in coltura attraverso i processi di elettroforesi, isoelettrofocalizzazione, e SDS-PAGE e informazioni sull'utilità di un adeguato software 2D.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida delle nostre istituzioni umana comitato etico di ricerca. Buffy-coat da sani donatori umani sono stati ottenuti dal Regional Blood Transfusion Center (Lille, Francia). I campioni ottenuti dai buffy coats sono dichiarati come una collezione Inserm (n ° DC2010-1209).

1. Materiale e Culture Media Preparazione

1. Diluire 10x tampone fosfato salino (PBS) in acqua distillata sterile per ottenere 1x PBS.
2. Effettuare terreno RPMI 1640 supplementato con gentamicina (40 mcg / ml) e L-glutammina (2 mM), con e senza il 10% di siero umano pool.

2. Le colture primarie di macrofagi derivate da monociti (MDM)

1. Diluire buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Caricare con attenzione su un Ficoll / provetta leucosep e centrifugare a 1600 xg per 20 min a temperatura ambiente.
2. Raccogliere monociti all'interfaccia in un nuovo tubo. Lavare 3x con 10 ml di PBS 1X contenente 0,1% etilendiamminotetraacido acetico (EDTA) per successive centrifugazioni a 1000 xg, 370 xg e 160 xg per 10 minuti ciascuno, e poi una volta in PBS 1x solo a 160 xg per 10 min.
3. Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno RPMI-1640 senza siero e seminare le cellule su 35 mm piatti ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule per piastra.
4. Dopo sedimentazione per 90 min in incubatrice, scartare il surnatante contenente le cellule non aderenti. Lavare le cellule aderenti, composto da monociti, 3x con 1 ml di PBS; quindi aggiungere 1 ml di mezzo fresco contenente 10% (v / v) di siero umano per le celle libere precedenza siero.
5. Dopo 6 giorni di coltura, per produrre macrofagi differenziati alternativi (M2), aggiungere umana ricombinante IL-4 (15 ng / ml) e mantenere per 6 giorni. Quindi, il trattamento di macrofagi differenziati con lipopolisaccaride (100 ng / ml) al giorno 12 per 4 ore per ottenere macrofagi M1.

3. Estrazione di M1 e M2 macrofagi proteine ​​per elettroforesi 2D

1. Lavare macrophetà tre volte con 25 mM Tris, pH 7,4, e rottami in tampone contenente 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 2 M tiourea e 7 M urea.
2. Lisare le cellule utilizzando un mixer adatto per provette da 1,5 ml microcentrifuga per 5 min in ghiaccio e conservare a -20 ° C.
3. Determinare la concentrazione di proteine ​​usando un reagente commerciale Bradford. Conservare aliquote di 100 microlitri di proteine ​​a -20 ° C fino al momento dell'uso.

4. Isoelettrofocalizzazione

NOTA: Eseguire tutte le procedure di etichettatura nel buio.

1. Ridurre 5 mg di ciascun campione (M1 e M2 macrofagi) regolato a 9 microlitri di tampone di lisi con 2 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) per 1 ora a 37 ° C.
2. Aggiungere cianina 3 (Cy3) per estrarre M1 e M2 estratto sulfidrilici colorante reattivo ad una concentrazione di 0,8 nM proteina / mg. Aggiungere cianina 5 (Cy5) M1 e M2 estrae ad una concentrazione di 0,8 nM / mg proteine ​​e incubareper 30 minuti a 37 ° C.
3. Arrestare la reazione con l'aggiunta di un volume uguale di tampone campione contenente 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitolo (DTT) e 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3-marcato campioni M1 con M2 campioni Cy5-etichettati in una mano e Cy3-marcato campioni M2 con campioni M1 Cy5-etichettati in un altro mano.
5. Reidratare un gradiente di pH immobilizzato (IPG) striscia (240 mm pH 3-10 gradiente lineare) con 450 ml di campioni misti etichettati in tampone contenente 7 M urea, 2 M tiourea e il 4% CHAPS su un sistema di messa a fuoco isoelettrica delle cellule (IEF) per 24 ore senza applicare alcuna corrente.
6. Eseguire focalizzazione a 300 volt (V) per 3 ore, e poi ad un gradiente di 1000 V per 6 ore, con una pendenza a 8000 V per 3 ore e infine a 8000 V per 3 ore.

5. Seconda Dimensione

NOTA: Eseguire tutte le procedure di elettroforesi nel buio.

1. Incubare le strisce IPG in tampone per l'equilibrazione contengonoing 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 30% (v / v) di glicerolo per 10 min.
2. Trasferire le strisce IPG equilibrate per la seconda dimensione (elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (PAGE)) sul 12,5% gel PAGE e sigillare con basso punto di fusione agarosio.
3. Effettuare elettroforesi a 20 ° C utilizzando un sistema Ettan-Daltsix ad una tensione costante di 70 V durante la notte seguita da 300 V fino alla bromofenolo blu anteriore raggiunge il fondo del gel.

6. Acquisizione di immagini e analisi bioinformatica

1. Gel scansione espressi tra le due lastre di vetro a bassa fluorescenza con uno scanner DIGE Imager a lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 532/580 nm per Cy3 e Cy5 633/670 nm per cedere immagini con una dimensione di pixel di 100 micron.
2. Eseguire l'analisi delle immagini con software commerciale come precedentemente descritto ^12.
3. Calcolare e normalizzare i volumi pronti in ogni immagine. Assegnare un volume posto normalizzato come un oggetto di scenaortion del valore totale di ogni punto rilevato nel gel.
4. Analizzare le differenze di volumi di campione proteiche per ciascun tipo di macrofagi confrontando il valore del volume posto normalizzato tra i due gruppi (M1 e M2). Si consideri la differenza tra i volumi pronti ad essere significativo se il cambiamento è 1,5 volte (p <0.05, unidirezionale analisi ANOVA).

Risultati

Per eseguire un'adeguata analisi proteomica differenziale, il trattamento dei campioni da analizzare vanno verificate.

Nell'esempio presentato, è richiesta la qualità di coltura cellulare di macrofagi per aspetti morfologici e molecolari come precedentemente pubblicato ^5. La differenziazione dei monociti in macrofagi e l'omogeneità della cultura è stata seguita da fase microscopio. Figura 1 ha mostrato un esempio di colture primarie di M1 e M2 macrofagi. Come most...

Discussione

Il protocollo qui descritto dettaglio un metodo per analizzare l'impatto di vari stimoli dei due sottotipi di macrofagi M1 (pro-infiammatori) e M2 (anti-infiammatori). Colture primarie di M1 e M2 macrofagi sono stati ottenuti dalla differenziazione dei monociti come precedentemente pubblicato ^7.

La procedura di elettroforesi su gel 2D DIGE richiede materiali e delle attrezzature speciali, come le batterie IEF per piatti isoelettrofocalizzazione, a bassa fluorescenza per l'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutammina-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamicina 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
siero umano	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1,077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
piastra a 6 pozzetti PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolisaccaride	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Research Organics	3.00E+01
Filtro 0.22 &; micro; m	Millipore	SCGPTORE
100 ml cilindro	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reagente	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-reattivo	colorante GE Healthcare	25-8009-83
striscia IPG 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean Cellula IEF	Bio-Rad	165-4000
Agarosio a basso punto di fusione	Invitrogen	15517-014
Sistema Ettan-Daltsix	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Dinamica
Provette da 50 ml	qualsiasi fornitore	n/a
Tubi da 15 ml	qualsiasi fornitore	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
uré e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	114391
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G6279
Acrilammide 40%	Bio-Rad	161-0148
Pulizia 2D GE	Healthcare	80-6454-51
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé tilformammide	Sigma-Aldrich	22705-6
stoppini per elettrodi	Bio-Rad	165-4071

non lineare