Articolo metodologico

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

In questo articolo

Sommario

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La regolazione dei nutrienti che utilizza l'alimentazione continua aggiustata per la crescita migliora i tassi di crescita degli sferoidi delle cellule di mammifero rispetto all'alimentazione intermittente per colture in bioreattori in sospensione agitata. Questo studio dimostra i metodi necessari per stabilire semplici colture alimentate a tasso aggiustato.

Abstract

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In questa dimostrazione, gli sferoidi formati dalla linea cellulare di insulinoma β-TC6 sono stati coltivati come modello di produzione di un prodotto cellulare di isole di mammifero per dimostrare come la regolazione dei livelli di nutrienti possa migliorare la resa cellulare. In studi precedenti, i bioreattori hanno facilitato l'aumento dei volumi di coltura rispetto alle colture statiche, ma non è stato osservato alcun aumento delle rese cellulari. Le limitazioni di nutrienti chiave come il glucosio, che sono stati consumati tra le poppate in batch, possono portare a limitazioni nell'espansione cellulare. Sono state osservate grandi fluttuazioni nei livelli di glucosio, nonostante l'aumento delle concentrazioni di glucosio nei mezzi. L'uso di sistemi di alimentazione continua ha eliminato le fluttuazioni dei livelli di glucosio e ha migliorato i tassi di crescita cellulare rispetto ai metodi di coltura statica e SSB alimentati in batch. Ulteriori aumenti dei tassi di crescita sono stati osservati regolando la velocità di alimentazione in base al consumo di nutrienti calcolato, che ha permesso il mantenimento del glucosio fisiologico per tre settimane in coltura. Questo metodo può essere adattato anche ad altri tipi di cellule.

Introduzione

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Al fine di generare un gran numero di cellule umane vitali e funzionali per il trapianto, la regolamentazione delle condizioni di coltura è imperativo. L'esaurimento delle sostanze nutritive, con accumulo di scorie metaboliche sono i principali contributori alla senescenza e metaboliche modifiche che riducono la qualità del prodotto cellulare 1 - 3. Questa procedura illustra un metodo per cellule di mammifero coltura in sferoidi usando un bioreattore agitata combinato con un sistema di alimentazione tasso di perfusione regolata per regolare il glucosio in un intervallo fisiologico 4 per tutta la durata della cultura. Ai fini di questi studi, l'intervallo fisiologico è stato definito come tra 100 e 200 mg / dl. Gli stessi metodi possono essere usati per regolare altri nutrienti e rifiuti metabolici come lattato.

culture statiche in piccoli volumi (1 - 30 ml) sono tipicamente utilizzati in ambiente di laboratorio per mantenere e differenziare le linee cellulari per experimefini ntale. Cellulare passaging viene eseguita con cambi completi medie come necessario ad intervalli regolari. Più terreno di coltura "convenzionale" ha una concentrazione di glucosio alto (450 mg / dl per DMEM utilizzato in questi studi) per consentire meno frequenti cambiamenti medi senza il rischio di limitazioni nutrizionali. Tuttavia, questo metodo batch alimentazione richiede ancora manipolazione frequente, introduce variabilità nell'ambiente cellulare, e aumenta il rischio di contaminazione 5 - 9. Bioreattori sospensione agitata (SSB) fornire una migliore miscelazione e diminuito movimentazione 3,10 - 20, ma, come le culture statiche, richiedono cambiamenti medi manuali che contribuiscono alle fluttuazioni potenzialmente dannosi nei livelli di prodotti nutrienti e rifiuti. Perfusione alimentazione di culture SSB riduce questi problemi infusione continua e la rimozione del mezzo, ma grandi cambiamenti nei livelli di nutrienti a causa della crescita delle cellule rimangono un problema. L'uso di un ra alimentazione adjustedte dai calcoli di uso di sostanze nutritive in base ai requisiti delle cellule stimato in grado di fornire l'ambiente cellulare stabile necessaria per ottimizzare la vitalità delle cellule e funzionare 21 - 24.

Vi è un grande corpo di letteratura che descrive i metodi per scalabili culture SSB di cellule di mammifero in particolare per la cultura e l'espansione delle cellule pluripotenti 25 - 32, con gli altri focalizzata su isolotto (beta), le cellule 17,33,34, o la produzione di prodotti biologici 24, 35 - 38. Molti di questi tipi di cellule indagati può essere coltivata nelle culture sferoidali, e procedure specifiche per il tipo di cella utilizzato dovrebbe essere ottimizzato prima di implementare un sistema di alimentazione continua. In questa dimostrazione, un metodo di alimentazione di perfusione è stato usato per espandere una linea cellulare beta cresciuto come sferoidi in un bioreattore agitato 39 -. 43 Il metodo qui descritto fornisce unsemplice implementazione di alimentazione adeguamenti tariffari sulla base di misure di glucosio off-line per ottenere condizioni di coltura mirati. Regolazione della velocità di avanzamento con questo metodo per mantenere un livello di glucosio fisiologica è indicata ai rendimenti delle cellule aumenta. Le cellule di mammiferi dipendono da un nutriente chiave, glucosio, per la produzione di energia, quindi l'uso di questa linea cellulare rappresenta un modello per molte cellule di mammifero in coltura 44. Inoltre, questa linea esemplifica l'ulteriore complessità delle cellule beta, che sono sensibili ad elevati livelli di glucosio croniche 45. Per questo studio, le cellule beta-TC6 sono stati autorizzati a formare sferoidi nella cultura per approssimare le dimensioni medie delle isole di Langerhans in vivo. Il sistema di bioreattore perfusione 17 - 19,21,46 con una velocità di avanzamento regolata al glucosio consumo, ha determinato il mantenimento di condizioni fisiologiche e rendimenti più elevati cellulari senza cambiamenti di viabilità.

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Protocollo

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1. Cell Line e manutenzione

  1. Ottenere cellule beta-TC6 (o altra linea cellulare di mammifero aderenti desiderato). In preparazione per lo studio, la cultura, il passaggio, e crioconservare le cellule secondo le istruzioni del fornitore.

2. Montare il sistema di alimentazione continua

NOTA: La progettazione del sistema di alimentazione continua del seguente metodo è basata su sistemi analoghi descritti in letteratura 17 - 19,21,47 - 49. Assemblaggio del sistema usato qui è descritto in dettaglio in una precedente pubblicazione 3.

  1. Raccogliere i componenti necessari per il sistema di alimentazione, che è costituito da cinque componenti principali: un serbatoio di media, pompa peristaltica, bioreattori mescolato, serbatoio dei rifiuti, e progettato su misura set di tubi / campionamento.
    1. Stabilire il serbatoio di media utilizzando una bottiglia da 1 L di vetro, il serbatoio rifiuti utilizzando una bottiglia di vetro 2 L, e il stirred bioreattore utilizzando un reattore di vetro del volume di 250 ml (off versione shelf).
    2. Utilizzare una pompa peristaltica digitale o pompa di simile con una testa pompa 8 canali per controllare mezzo di scambio.
    3. Fabbricazione del serbatoio e coperchi bioreattori modificati da plastica dura e autoclavabile con tubo di acciaio inox pass-through porte per fornire ventilazione attraverso filtri sterili, e consentire il mezzo di trasferimento tra i serbatoi e bioreattori. In alternativa, l'acquisto di coperchi specializzate con luci di flusso da vari fornitori.
      NOTA: Il coperchio bioreattore può contenere ulteriori porte pass-through per la strumentazione e le sonde opzionali di monitoraggio (ad esempio un monitor di ossigeno).
    4. Collegare un tubo di efflusso (OT) fabbricati con tubi di vetro di aerazione porosi con una gamma media dimensione dei pori di 40 micron a 60 micron e una densità dei pori di 40% al coperchio SSB modificato. In alternativa, scegliere un altro tubo di efflusso in base alle esigenze specifiche della cultura.
      NOTA: Scegliere ilDimensione dei pori OT per rimuovere solo medio e detriti cellulari, lasciando aggregati di cellule in coltura (come descritto nella sezione 6 e la pubblicazione 3 per maggiori dettagli).
  2. Montare set di tubi perfusione autoclave da fluoruro di polivinile (PVDF) connettori tubi e durevole tubo della pompa peristaltica. La lunghezza della sezione dipende dalla distanza tra i vari componenti.
    NOTA: Prestare particolare attenzione nella scelta di varietà tubi per garantire la durata e l'affidabilità per esperimenti a lungo termine.
  3. Montare il set di tubi da tre parti: una linea di alimentazione, una linea di scarico, e una linea di campionamento.
    1. Montare la linea di alimentazione utilizzando due diametri dei tubi (L / S 14 e L / S 13). Utilizzare il L / S 14 per il tubo principale che si estenderà la distanza dal bioreattore al serbatoio media, e inserire una breve lunghezza L / S 13 nel mezzo della lunghezza del tubo per la sezione pompa utilizzando gli adattatori PVDF appropriate.
    2. Utilizzare standard PVDF tubo-spinato tubiadattatori ng per unire due pezzi di L / S 14 tubi su entrambi i lati della sezione della pompa più corta (L / S 13) tubazione.
      NOTA: In alternativa, l'intera lunghezza del tubo potrebbe essere più piccolo diametro L / S 13 tubi, e l'intera lunghezza del tubo potrebbe essere sostituito quando l'integrità pompa sezione è in questione.
  4. Montare la seconda sezione tubi per la rimozione dei rifiuti con diametro maggiore tubazione (L / S 16) ed inserire un breve tratto di L / S 14 tubi nel mezzo della sezione di pompaggio. Ciò avviene nello stesso modo come la linea di alimentazione assembly utilizzando adattatori manichetta-spinato PVDF, o in alternativa con un tratto continuo di dimensioni tubazione della pompa desiderata, e sostituendo come necessario.
    NOTA: Se la stessa pompa e la testa della pompa sono utilizzati per il circuito di alimentazione e il circuito di rifiuti, la sezione della pompa delle linee tubi di rimozione dei rifiuti deve essere un diametro maggiore rispetto alla sezione della pompa della linea di alimentazione. Ciò garantisce che la velocità della pompa rimozione è più veloce della velocità di avanzamento, ed eviterà il potenteIAL per grandi variazioni di volume coltura, e ridurre il rischio di trabocco.
  5. Montare il componente finale del set di tubi: un gruppo di raccolta del campione.
    1. Questa procedura descrive una consuetudine assemblato sistema portuale di campionamento; In alternativa, una porta di campionamento sterile può essere acquistato da vari fornitori.
    2. Costruire il set da tre brevi (~ 6 cm) L / S 14 tubazione lunghezze collegati insieme con un connettore PVDF tipo T, e due piccole fascette sui due tratti di tubo.
    3. Collegare un filtro gas sterile per lo sfiato del gas ad una delle lunghezze serrati, e l'altro è usato per il collegamento ad una siringa campionamento sterile (filtri gas sterili possono devono essere aggiunti in un armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione come molti filtri sterili non sono autoclavabile).
    4. Collegare la terza estremità ad un connettore campione di acciaio inossidabile attaccata sul coperchio del bioreattore.
    5. Autoclave il gruppo di campionamento, mentre collegato al bioreattore prima di iniziarel'esperimento (fare riferimento al punto 3).
    6. Utilizzare questa assemblea per raccogliere campioni sterili dal bioreattore, se necessario, senza disturbare il processo di alimentazione continua.

3. Autoclave Tutti i Materiali

  1. Preparare tutti i componenti bioreattori per la sterilizzazione in autoclave.
  2. Raccogliere singoli componenti per la sterilizzazione. Medie e rifiuti serbatoi (assemblato dal punto 2.1.1), pallone filatore 250 ml (assemblato da 2.1.1), necessari coperchi modificati (assemblati da 2.1.3), tubo di efflusso (descritto nel 2.1.4), tre set di tubi ( assemblati in sezioni 2.2 through2.5), tubo di efflusso (come necessario per l'alimentazione continua).
    1. Assemblare pallone filatore con tutti i componenti e assicurarsi che il tubo di efflusso è saldamente fissato all'interno del pallone filatore (descritto nella sezione 2.1.4), e fissare la porta personalizzata assemblato campionamento (punto 2.5), o altra porta di campionamento per la parte superiore del coperchio .
    2. Avvolgere l'intero gruppo pallone filatore con l'automateriale clave involucro, e in autoclave indicando nastro. Assicurarsi che l'involucro a tenuta d'aria. NOTA: Foglio di alluminio o materiale simile possono essere utilizzati per coprire le singole estremità di ciascuna porta di accesso nel coperchio bioreattore di preservare la sterilità del connettore / termina quando non imballato e quando non collegato ai set di tubi all'interno dell'incubatrice.
    3. Montare i coperchi dei serbatoi modificati medie e dei rifiuti e quindi collegare ai rispettivi bottiglie di vetro. Coprirli con un foglio di alluminio e autoclave indicando nastro.
    4. avvolgere individualmente i set di tubi (sezione 2,2-2,5) con involucro di autoclave e nastro per aiutare a montaggio finale. Foglio di alluminio o materiale simile può essere usato per avvolgere le singole estremità di ciascun set di tubi per preservare la sterilità del connettore / termina quando scartare.
    5. Autoclavare tutti gli elementi avvolti con un ciclo di autoclave a secco standard (ad esempio, "Gravity" impostazione con ~ 15 psi a 121 ° C per 30 minuti o più).
      NOTA: Non collegare sterilefiltri prima di sterilizzazione in autoclave a meno che non siano confermati per essere sicuri autoclave.

4. Formazione Spheroid

NOTA: Questa tecnica è simile a quelle descritte in letteratura 17 - 19,21,50 - 52 per le altre colture di cellule di mammifero. Tutte le procedure seguenti sterilizzazione dovrebbe essere fatto in una cappa a flusso laminare e utilizzando guanti sterili per mantenere condizioni sterili per colture cellulari.

  1. Per tutte le condizioni, la cultura ed espandere cellule β-TC6 nelle culture aderenti standard (descritti dal produttore) fino a quando le quantità di cellule sufficienti si ottengono per seminare il numero desiderato di bioreattori.
    1. Assemblare il bioreattore alimentazione continua con tubo di efflusso, come mostrato nella figura 1 e descritto nel capitolo 2, e collegare la porta di campionamento coperchio campionamento. NOTA: Il tubo di deflusso e l'assemblaggio porta di campionamento devono essere aggiunti alla bioreacto per l'alimentazione in continuo prima della formazione sferoide, e deve essere tirato fuori dal terreno di coltura fino all'avvio alimentazione continua.
    2. Sterilizzare l'assemblaggio SSB modificato in autoclave (descritto nella sezione 3).
    3. Fissare sfiati sterili (0,22 micron o più piccoli filtri sterili) nelle posizioni appropriate sui coperchi del pallone filatore, e le imbarcazioni di medie e rifiuti.
      NOTA: Questo è importante per prevenire serratura di vapore, e per permettere lo scambio di gas tra l'incubatore (2 CO 5%) ambiente e il bioreattore. Lo scambio di gas è necessario per mantenere il pH corretto quando si utilizzano supporti bicarbonato tamponata.
  2. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione delicato usando 0,25% (w / v) Trypsin- 0.53 mM EDTA, a temperatura ambiente aiutato mediante agitazione meccanica per 2 - 3 min, e sementi in bioreattori ad una densità di circa 1,3 x 10 6 cellule / ml in 200 ml di terreno di coltura.
    1. Spostare fiaschi designati fuori dell'incubatore ein un armadio di biosicurezza.
      Nota: Tutte le colture cellulari e manipolazioni dovrebbe essere fatto in un armadio Bio-sicurezza utilizzando una corretta tecnica sterile.
    2. Togliere terreno di coltura da fiaschi aspirando.
    3. Lavare le cellule pipettando 5 ml di tampone fosfato (senza Ca ++ e Mg ++), nel pallone, e risciacquo attraverso le cellule sulla superficie, e quindi aspirare il PBS.
    4. Aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per ogni pallone che sarà incassato (in genere circa 10x 175 centimetri 2 T-palloni).
    5. Consentono alle cellule raccolte di incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 minuti in armadietto biosicurezza.
    6. Agitare delicatamente a mano per allentare le cellule dalla superficie pallone e raccogliere cellule aggiungendo 6 ml di terreno di coltura (con siero) al pallone, e trasferire le cellule a un tubo da 50 ml. Quando uno tubo da 50 ml è pieno, utilizzare un altro tubo 50 ml fino a quando tutte le celle necessarie sono state raccolte (circa una provetta da 50 ml sarà necessario per ogni 5 T-175 palloniraccolto).
    7. Delicatamente centrifuga (circa 50 x gravità) le sospensioni cellulari raccolti per agglomerare le cellule.
    8. Aspirare il terreno rimanente lasciando intatto il pellet.
    9. Raccogliere tutte le celle in un singolo tubo da ri-sospensione il pellet in terreno di coltura (contenente siero) con una pipetta, e trasferimento di tutti pellets nel tubo stesso.
    10. Contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro standard trypan colorazione blu come descritto in letteratura 53.
    11. Aggiungere il numero desiderato di cellule totali di sterile SSB per ogni condizione (1,3 x 10 6 cellule / ml era le densità di cellule di partenza mirate per questa dimostrazione).
    12. Aggiungere mezzo (con la concentrazione di glucosio desiderata, in questo caso abbiamo utilizzato livelli medi di glucosio all'interno della gamma fisiologica) per SSB con una pipetta per raggiungere il volume coltura totale desiderata (volume di 200 ml coltura viene utilizzato per questi studi).
      NOTA: Per queste Fed continua SSB studia il cu ltures state seminate utilizzando una versione modificata "low-glucosio" nel terreno di coltura (100 mg / dl). Questo ha permesso le culture per iniziare alla concentrazione di glucosio porta piuttosto che iniziano con un medium "high-glucosio" e in attesa del consumo di glucosio per portare i livelli di glucosio giù nel range fisiologico per avviare l'alimentazione. Tutto altro mezzo per alimentare in questi studi utilizzato lo standard "high-glucosio" medium (500 mg / dl).
    13. Spostare SSB con le cellule di un piatto mescolare all'interno di un incubatore di coltura cellulare.
  3. Cellule di coltura in bioreattori senza alimentazione per 3 giorni a 37 ° C, con il 5% di CO 2, 100% di umidità relativa, e un tasso di agitazione di 70 giri al minuto per consentire sferoidi alla forma.
    NOTA: Non proliferazione significativo deve essere osservato durante il periodo di formazione sferoide di tre giorni.
  4. Dopo la formazione sferoide, dividere sferoidi tra bioreattori con condizioni di coltura desiderati.
Le "> 5. alimentazione continua, Cultura e rettificato Avanzamento

  1. Autoclave o gas sterilizzare tutti i componenti e assemblare in un armadio di sicurezza biologica usando tecniche sterili (punti 2 - 4).
  2. Dopo la formazione sferoide, rimuovere la SSB dal termostato e assemblare i componenti per il sistema di alimentazione continua in cabina di sicurezza biologica.
    1. Prima riempire il serbatoio mezzo fresco con il terreno di coltura desiderato, e quindi connettersi a un lato della linea di alimentazione. Inoltre garantire che il serbatoio fresco mezzo è correttamente ventilato con un filtro sterile.
    2. Collegate un lato della linea di alimentazione alla porta di ingresso di alimentazione sul bioreattore in modo sterile. Un filtro sterile deve essere installato tra la linea di alimentazione e la luce di entrata bioreattore per filtrare il mezzo prima che entri nel bioreattore.
    3. Collegare la linea di scarto al tubo bioreattore deflusso e il serbatoio rifiuti di media, e assicurarsi che il serbatoio rifiuti siano adeguatamente ventilato con una sterilee filtro.
  3. Spostare il gruppo fuori dalla cappa di sicurezza biologica (questo richiederà probabilmente due persone per trasportare tutte le navi e tubi), e mettere tutti i componenti per la cultura a lungo termine.
    1. Mettere SSB sul piatto mescolare all'interno dell'incubatore utilizzando gli stessi parametri di coltura per la formazione sferoidale (37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità e 70 rpm). NOTA: Può essere necessario scollegare temporaneamente i segmenti tubo dal bioreattore se le linee devono eseguire fori passanti nel lato dell'incubatore piuttosto che attraverso la guarnizione della porta. Questo può essere fatto in modo asettico avvolgendo le estremità dei set di tubi con foglio di alluminio prima della sterilizzazione in autoclave (fase 3), e in attesa di collegare il lato bioreattore delle sezioni di alimentazione e tubo di scarico fino al bioreattore è all'interno dell'incubatrice. Le linee di tubi possono essere messe in atto, e il foglio di alluminio possono essere rimossi all'interno dell'incubatore e rapidamente attaccato al bioreattore.
    2. Eseguire le estremità rimanenti del set di tubi (quelle non collegate al coperchio bioreattore) attraverso la porta di accesso incubatore (pass-through), o attraverso un incavo nella guarnizione della porta dell'incubatore.
    3. Fuori dell'incubatore (in un armadio biosicurezza vicina), collegare rapidamente la linea di alimentazione al serbatoio fresca media, e la linea di scarto al serbatoio rifiuti medie e assicurarsi che il serbatoio rifiuti è correttamente ventilato con un filtro sterile. NOTA: Per fare questo in maniera asettica, rimuovere il foglio di alluminio dai connettori tubi e dei vasi e collegare ai rispettivi vasi più rapidamente possibile (soprattutto se questa connessione deve essere fatto al di fuori dell'armadio biosicurezza).
    4. Mettere serbatoio terreno fresco (riempito con il mezzo di alimentazione desiderata) all'interno vicina mini-frigorifero. Verificare che le linee di alimentazione e di scarico sono in grado di uscire dalla incubatore e immettere il frigorifero senza impedire che le porte di ciascun dalla chiusura. E 'anche fondamentale che il feed lInes non vengano schiacciati chiuse da porte di entrambi frigorifero o l'incubatore.
      NOTA: Il mezzo utilizzato per questi studi è stato il terreno di coltura standard elevati di glucosio (500 mg / dl) consigliata dal fornitore di questo tipo di cellule. Qualsiasi medio alto glucosio potrebbe essere utilizzato in base alle esigenze specifiche del tipo di cellule in coltura. La concentrazione di glucosio del mezzo di alimentazione deve essere ragionevolmente superiore (2x o più) rispetto alla concentrazione desiderata nella cultura come il sistema di alimentazione si basa sull'aumento della velocità di avanzamento del medio alto glucosio per mantenere adeguati livelli di glucosio nelle culture pur mantenendo velocità di avanzamento ragionevoli .
    5. Successivamente, il serbatoio mezzo di rifiuti può essere messo sul banco all'esterno dell'incubatrice in una posizione comoda.
    6. Quindi, posizionare la sezione "pompa" dei mangimi e rifiuti righe nella testa della pompa per garantire il corretto orientamento in modo che le linee di alimentazione saranno pompa del mezzo dal serbatoio mezzo fresco in SSB, e le linee di scaricopomperà terreno dalla SSB e al serbatoio mezzo rifiuti.
  4. Accendere la pompa alla velocità di avanzamento desiderata.
    1. Calcolare la velocità di alimentazione utilizzando l'equazione avanzamento adjusted descritto in letteratura 3 e nella sezione fornito risultati rappresentativi di seguito.
    2. Utilizzare le informazioni più recenti conta delle cellule (procedura descritta al punto 5) insieme con la previsione di crescita, e le misurazioni del glucosio medio per stimare la velocità di avanzamento necessaria per mantenere la concentrazione di glucosio desiderato nella cultura.
      NOTA: dovranno essere ottenuto prima di fare queste procedure I tassi di crescita delle cellule e dei tassi di consumo di glucosio.
    3. Impostare la velocità della pompa in base alla velocità di avanzamento calcolato.
  5. Ripetere il calcolo avanzamento e regolare la velocità della pompa per ciascun punto di campionamento (ogni tre giorni per il metodo descritto).

6. conteggi delle cellule, vitalità, e glucosio Concentrazione Misure

  1. Raccogliere campioni di ciascuna bioreattore ogni tre giorni, o come desiderato.
  2. Prendere campioni di coltura da culture SSB continuamente alimentati utilizzando la porta di campionamento specializzata sopra descritto.
    1. Lasciando la SSB alimentato in continuo all'interno del bioreattore, collegare una siringa sterile (5 ml volume della siringa è stato usato per questi studi) alla connessione non filtrata del porto campionamento.
    2. Spostare il tubo di campionamento giù nel mezzo di coltura.
    3. Sganciare la sezione del tubo che va alla siringa, e prelevare il volume del campione totale desiderata.
    4. Spostare il campionamento con tubo in modo che esso non è immerso nella cultura, e continuare a ritirare la siringa finché l'aria viene rimossa.
    5. Fissare il tubo che alimenta la siringa, e staccare la siringa contenente il campione, e mettere da parte.
    6. Pre-caricare una seconda siringa sterile fresco con l'aria, e allegare al lato filtro sterile del porto di campionamento.
    7. Sganciare il tubo che va al lato della siringa-filtrola presa di campionamento, e quindi spurgare il porto campionamento espellendo delicatamente l'aria nella siringa attraverso il filtro sterile. Questo assicura che la porta di campionamento sarà chiara di qualsiasi quantità residua.
    8. Re-fissare il tubo che va al filtro, staccare la siringa sterile e scartarla.
  3. Prendere la siringa contenente il campione cellulare dalla cultura, ed espellere in una provetta da 10 ml. Sub-campioni di volumi noti possono essere presi direttamente da questo tubo.
  4. Per conta delle cellule, rimuovere un volume noto di cellule e trasferire in una provetta micro-centrifuga e centrifugare delicatamente per 1 - 2 min (circa 50 x gravità).
  5. Trasferire il supernatante in un tubo separato per misurazioni del glucosio, e risospendere il pellet con lo stesso volume di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% (w v) tripsina /, 0,53 mM EDTA), e contare in triplicato con un emocitometro standard trypan colorazione blu come descritto in letteratura 53.
    1. Aggiungere mezzo (con siero) peril campione per la diluizione, se necessario.
    2. Contare le cellule, e calcolare la vitalità cellulare registrando cellule vive (non colorati), e (tinto), le cellule morte in modo indipendente (vitalità% = cellule vive / cellule totali).
  6. Misurare i livelli di glucosio medie in triplice copia utilizzando un misuratore di glucosio nel sangue e monouso test-strisce.
    1. Prendere le misure del glucosio, come descritto nelle istruzioni misuratore di glucosio sostituendo il terreno di coltura per il sangue.
    2. Immergere la striscia nel mezzo da testare (raccolti da campioni di conteggio di cui sopra), e ripetere per il numero desiderato di repliche (si consigliano tre repliche).
    3. Testare sia il mezzo fresco e medio rifiuti per le concentrazioni di glucosio.
      NOTA: per alcuni metri, misurazioni inferiore a 20 mg / dl (soglia rilevabile del contatore), possono essere osservate come errore nell'output metro.

7. sferoide assestamento misure di frequenza

  1. Per garantire che cell cluster non vengono rimossi dal sistema di alimentazione continua, misurare il tasso di sedimentazione degli sferoidi beta-TC6 osservando il loro sedimentazione in un grande pipetta di plastica diametro.
  2. cellule Culture beta-TC6 in bioreattori SSB per formare sferoidi come descritto sopra.
  3. Dopo 3 giorni di cultura, prendere 30 ml campioni della sospensione sferoide e mettere in un tubo da 50 ml.
  4. Delicatamente pipettare su e giù utilizzando un'ampia pipetta diametro 25 ml di distribuire uniformemente in sospensione, quindi arrestare pipettaggio con la sospensione ad un livello noto nella pipetta (ad esempio, 20 ml marchio), e quindi registrare il tempo per tutti gli sferoidi di stabilirsi 5 cm.
  5. Ripetere questa procedura abbastanza volte per raggiungere confidenza statistica (di solito n> 3).
    NOTA: Per gli studi biologici, valore di p inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo quando si confrontano le misurazioni. L'errore standard della media è stato utilizzato per gli errori di segnalazione, e le due coda t di Student test di non-accoppiatoè stato utilizzato per confrontare le condizioni per i dati presentati.

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Risultati

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I livelli di glucosio medio e fluttuazioni Limitare cellulare espansione in Culture standard SSB

I livelli di glucosio fluttuano nelle culture statiche e culture SSB per tutto il periodo di coltura 3. Queste fluttuazioni intensificano con l'aumentare il numero delle cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni ed erano quasi identici in entrambe le culture statiche e SSB. Queste osservazioni sono presentati nella nostra precedente pubblicazione 3....

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Discussione

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Generazione di prodotti cellulari di mammiferi per la produzione di agenti biologici e terapie cellulari richiede la cultura e monitoraggio di cellule di mammifero in grande scala 55 - 58. Inoltre, queste applicazioni richiedono condizioni di coltura definite e validate. Semplicemente aumentando il volume delle cellule che utilizzano tecnologie di ricerca non si incontreranno tutti questi requisiti. variazioni medie manuali provocando fluttuazioni di sostanze nutritive e l'accumulo d...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Michael Garwood e Sam Stein per i loro utili commenti, e Kristen M. Maynard per l'assistenza nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
β TC-6 CellsATCC, Manassas, VACRL-11506Linea cellulare di insulinoma di topo (tipo di cellula aderente)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAVedi sotto per i numeri di prodotto 
DMEM Alto glucosio (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Basso contenuto di glucosio (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (notare che questo medium contiene già piruvato)
L-glutamminaInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=prodotto-ricerca
Piruvato di sodioInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Siero di suino inattivato a caldoGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 Fiasche trattate con coltura tissutaleCorning, Corning, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
& categoryname=
NuAire Incubatore per colture cellulariPrinceton, MNUS Autoflow. È possibile utilizzare qualsiasi incubatore per colture cellulari con regolazione CO2 con camicia d'acqua.
CentrifugaSorvall RT 7 (Può essere utilizzata qualsiasi centrifuga da banco simile)
FrigoriferoÈ possibile utilizzare qualsiasi frigorifero da laboratorio (per questi studi è stata utilizzata una piccola versione da tavolo)
Bottiglia di vetro da 1 litroCorning, Corning, NY1395-1LPotrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Scienze della vita)
& categoryname=
Bottiglia di vetro da 2 LCorning, Corning, NY1395-2LQualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato
Bioreattori agitati da 250 ml Corning, Corning, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Scienze della vita)
& categoryname=
Piastra di agitazioneFisher Scientific11-496-104AÈ possibile utilizzare qualsiasi piastra di agitazione sicura per incubatrice, qualsiasi fornitore
Piastre per colture tissutali 100 mm di diametroNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Qualsiasi fornitore può essere utilizzato (ordinato tramite Fisher Sci)
FALCON 50 ml Tubi coniciFalcon, San Jose, CA1256598Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato
Delran Plastica utilizzata per parti personalizzateMcMaster CarrVariQualsiasi materiale a scelta potrebbe essere utilizzato, ma Deran è scelto perché è sicuro per l'autoclave, non reattivo e facile da lavorare. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Tubo in acciaio inossidabile per coperchi personalizzatiMcMaster CarrVariÈ possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Coperchi per bioreattori Delran modificati personalizzati per alimentazione continuaRealizzati suNon a conoscenza di fornitori che producono un prodotto simile
Coperchi per bottiglie in vetro modificati personalizzati per alimentazione continuaRealizzati suAlcuni fornitori (ad es, Fischer Sci, Corning) realizzano prodotti simili nei link sottostanti.
Pompa peristaltica digitale MasterflexCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25È possibile utilizzare qualsiasi pompa peristaltica di precisione. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
Connettori per tubi PVDF (vari)Cole Parmer, Vernon Hills, ILvedere il linkQualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Tubi BPT Pharmed L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Pharmed BPT Tubing L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Pharmed BPT Tubing L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Membrana Millipore Millex GP PES 0.22 µ l. filtro per siringa sterile (utilizzato per lo sfiato e la filtrazione media)Fisher ScientificSLGP033RSQualsiasi fornitore può essere utilizzato
Pipetta graduata da 25 mlFisher Scientific13-678-11È possibile utilizzare qualsiasi fornitore e possono essere utilizzate varie dimensioni
PipettatoreFisher Scientific13-681-15EQualsiasi fornitore o prodotto simile può essere utilizzato
EmocitometroFisher Scientific02-671-6Qualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore o prodotto simile. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Microscopio a luce invertitaLeicaQualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato
One Touch Ultra Blood Glucose MeterFisher Scientific22-029-293È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer)
misura misura

Riferimenti

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