È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Summary

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Abstract

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Introduction

Virus oncolitici (OV) replicano selettivamente nelle cellule tumorali sfruttando differenze biochimiche tra cellule normali e tumorali ^1,2. Ci sono due tipi di VU: quelli che non necessitano di una mutazione per raggiungere oncolisi selettivo, denominato naturalmente allo wild-type virus e quelli che devono essere progettati per ottenere oncolisi selettiva. La collezione di mutazioni all'interno di un determinato tipo di tumore determina la natura del vantaggio di crescita selettiva su cellule normali per OV ^2. La sicurezza e vantaggio di utilizzare VU è stata dimostrata in studi clinici ^3-7. Nonostante i progressi nel campo della viroterapia oncolytic esistono spazi vuoti tra i risultati pre-clinici e clinici, suggerendo che i modelli migliori sono necessari per valutare l'efficacia antitumorale di VU.

Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) è un membro della famiglia Herpesviridae, e Alphaherpesviridae sottofamiglia. BHV-1 initiAtes bovina complesso malattie respiratorie nei bovini, manifestando in una grande varietà di sintomi che assomiglia ad un brutto raffreddore ^8,9. BHV-1 si lega fissaggio e ingresso recettori utilizzati da HSV-1, come eparan solfato e nectin-1 ^10. Tuttavia, si lega CD155 nel luogo di nectin-2 ^10. BHV-1 ha una gamma di ospiti molto ristretta tale che sia in grado di entrare e avviare la replica in cellule murine normali e trasformate ^3,4,10 efficiente. Questo rende l'uso di modelli murini convenzionali problematico. La capacità di oncolytic BHV-1 è stata dimostrata in vitro ^11,12. BHV-1 ha dimostrato di avviare la replica e uccidere le cellule tumorali umane da una varietà di origini istologici, comprese le cellule del cancro al seno e il cancro al seno avvio cellule ^11,12. Tuttavia, la capacità antitumorale di BHV-1 deve essere valutata in vivo nel contesto di un ospite immunocompetente.

Adenovirus umano (Ad), per il qualeci sono 57 sierotipi identificati, più comunemente provoca malattie respiratorie negli esseri umani. Ad vettori oncolitici sono stati valutati per la loro efficacia antitumorale con diversi avanzare in studi clinici ^13-15. Nonostante i dati pre-clinici promettenti, i risultati clinici sono stati inferiori alle aspettative. Modelli xenotrapianto di tumori umani sono in genere utilizzati per studiare l'efficacia antitumorale di vettori Ad, anche se esibiscono attenuate le risposte immunitarie al virus ^16,17. Inoltre, i modelli murini singenici sono non-permissive all'infezione annuncio, rendendo la valutazione della risposta immunitaria con questi modelli impraticabile ^17,18.

Il sistema immunitario dell'ospite è stato identificato come il meccanismo più influente attraverso il quale VU suscitano tumorali morte cellulare ^19. Risposte antitumorali tra tolleranti e l'antigene associato al tumore non-tolleranti (TAA) modelli differiscono e possono influenzare notevolmente il successo della terapia OV. L'HSV-1 OV KM100 (ICP0 ^N212VP16 ^{nel 1814 20) 20,21} suscitato regressione del tumore nel 80% dei topi portatori di tumore in un murino antigene Polyoma Medio T modello di cancro mammario ^22. Tuttavia, in HER-2 modelli / neu, l'efficacia antitumorale di KM100 variava tra il 20% completa regressione nei topi singenici e tumore stasi transgenici, topi HER2-tolleranti. Insieme, questi dati evidenziano l'importanza di valutare pienamente VU utilizzando modelli animali che meglio ricapitolano il paesaggio immunitario umano per comprendere appieno le caratteristiche che determinano il successo terapeutico.

Il ratto di cotone (Sigmodon hispidus), indigeni del Nord e Sud America, è più comunemente usato come modello di infezione da virus respiratorio sinciziale (come rivisto in ^5). Ratti di cotone sono utilizzati anche in-BHV-1 contro la ricerca di vaccinazione come ricapitolano la patologia associata a malattia respiratoria bovina complessa ^6,23. Inoltre, BHV-1 infezione di ratti di cotoneè immunogenico, inducendo mucosa sostenuta e risposte immunitarie sistemiche ^6,23-25. Le linee cellulari sono stati derivati ​​da fibrosarcoma spontanea e osteosarcomi della ghiandola mammaria (LCRT) e ossa (CCRT e VCRT), rispettivamente, ^26. Cotone ratti sono stati utilizzati per valutare l'efficacia in vivo di vettori Ad oncolytic come sono suscettibili all'infezione annuncio ed esporre patologia simile all'uomo ^27-29. L'uso di modelli immunocompromessi per la valutazione pre-clinica di VU non sono solo meno indicativo di risposte cliniche alla terapia ma non tengono conto del ruolo del sistema immunitario in viroterapia oncolitica ^30,31. Pertanto, la singenici e modelli tumorali cotone ratto-tolleranti di carcinoma mammario e osteosarcoma sono modelli pertinenti a cui valutare l'efficacia pre-clinica di VU, quali BHV-1 e Ad che non può essere studiata utilizzando modelli murini convenzionali.

Protocol

NOTA: I protocolli utilizzati sono stati approvati dal nostro istituzionale Animal Research Ethics Consiglio della McMaster University in base al Canadian sugli orientamenti per la cura degli animali. Gli esperimenti sono stati condotti presso l'impianto di McMaster University Central Animal.

1. Le celle Culturing LCRT

1. Cellule Culture LCRT in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina. Mantenere le cellule in T-150 fiasche di coltura tissutale a 37 ° C e 5% di CO _2. Passaggio cellule quando formano un monostrato 90% confluenti (ogni 2-3 giorni, Figura 1).
2. Pre-caldo 1x tampone fosfato salino (PBS), 1x tripsina e medie in un bagno d'acqua a 37 ° per 10 minuti prima di dividere le celle.
3. Aspirare il terreno dal pallone e lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS.
4. Dopo il risciacquo, aspirare PBS e incubarecellule con 2 ml di tripsina 1x fino cellule dissociano dal pallone (~ 2 min).
5. Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule.
6. Mantenere cellule in un pallone T-150 mediante inseminazione di 1 ml di sospensione cellulare in 24 ml di mezzo (per un totale di 25 ml per T-150) e pallone roccia delicatamente da lato a lato. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO ₂ fino al prossimo divisione.

2. Valutare la replicazione del virus e citotossicità in cellule LCRT

1. Replica Virus
   NOTA: costrutti virus che esprimono un tag fluorescenti, come la proteina verde fluorescente (GFP), sotto il controllo di promotori virali endogeni facilitano la visualizzazione di infezione da virus e diffondere con lettori di piastre a fluorescenza.
   1. Seed cellule LCRT in piastre di coltura, lasciando un bene per il conteggio. Cellule semi tale che essi saranno 80-90% confluenti un giorno in più. Utilizzare una concentrazione di 10 ⁵ cells / ml (100 ml per pozzetto) per produrre la confluenza desiderato un giorno in più in 96 pozzetti piastre a fondo piatto.
   2. Il giorno dopo, pre-caldo 1x PBS, 1x tripsina, terreno completo e privo di siero in un bagno d'acqua a 37 ° per 10 minuti prima di iniziare l'esperimento.
   3. Aspirare il terreno dalle conteggio ben e risciacquo cellule con 5 ml di PBS 1x di oscillazione sopra la superficie del pozzetto.
   4. Dopo il risciacquo, le cellule aspirare PBS e incubare con 2 ml di tripsina 1x fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min).
   5. Risospendere le cellule in volume appropriato di terreno completo per produrre una densità cellulare nell'intervallo numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima inoculando l'emocitometro pipettando su e giù.
   6. Determinare il volume del virus azione necessaria per l'infezione alla molteplicità desiderata di infezione (MOI).
      Richiesto Paque Forming Unit (pfu) = numero di cellule placcato * MOI(Pfu / cell)
      Volume del virus magazzino required = richiesto pfu / virus magazzino titolo (pfu / ml)
   7. Preparare inoculo virus in terreno privo di siero in tubi. Mescolare accuratamente con il vortex o pipettare prima di aggiungere inoculo alle cellule.
   8. Infettare le cellule per 1 ora a 37 ° C, dopo di che applicare una sovrapposizione di DMEM + 1% FBS manutenzione.
   9. Piastre di scansione uno e due giorni dopo l'infezione (pi) di visualizzare GFP fluorescenza.
2. Virus citotossicità
   NOTA: Eseguire il test di citotossicità resazurina in condizioni di scarsa illuminazione, come il composto è fotosensibile. Solo Un mezzo ben contenente dovrebbe essere inclusa per correggere fluorescenza di fondo.
   1. Preparare una soluzione al 5% (v / v) di resazurina in PBS 1x. Mescolare la soluzione pipettando.
   2. Medio Aspirare dalle cellule e applicare la soluzione resazurina 5%. Includere un mezzo ben contenente solo per correggere per fluorescenza di fondo.
   3. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, dopoche leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione 530 nm, emissione 595 nm).
   4. Analizzare i dati relativi ai controlli non infetti correzione per fluorescenza di fondo.

3. Housing and Handling

1. Housing e dieta
   1. Ratti Cotton House individualmente a diminuire in-combattimenti in policarbonato gabbie ratto contenenti biancheria da letto di roditori (1/8 "assestamento pannocchia), un tratto di non più di 8 pollici e nestlets come arricchimento tubi in PVC (Figura 2).
   2. Usare un cestello in acciaio a protezione diretta a sedersi overtop della gabbia e contenere cibo roditori e una bottiglia d'acqua.
      NOTA: Questa configurazione gabbia consentirà cattura sicuro e facile degli animali, con il posizionamento del tubo arricchimento contro l'estremità dell'essere gabbia della massima importanza.
2. Trattamento
   1. Maniglia ratti cotone al mattino, prima di giro da parte dei tecnici degli impianti animale per evitare emozionante primauna procedura.
   2. Durante tutte le procedure, indossare guanti di pelle di spessore per la protezione.
   3. Come gli animali rimangono essenzialmente nei tubi di arricchimento, utilizzarli per trasferire i ratti in una nuova gabbia durante la pulizia di routine. In alternativa, aprire un po 'la gabbia per consentire al gestore di raggiungere la loro mano, l'animale può essere trattenuta scruffing pelle appena sopra le spalle e spingendo verso il basso. Prestare attenzione a non usare forza eccessiva, come l'animale può mordere la lingua.
   4. Siate pazienti e utilizzare una mano ferma, come gli animali hanno una forte risposta di volo o di lotta e cercheranno di evitare la cattura da correre e saltare fuori dalla gabbia. È importante sottolineare che, non maneggiare gli animali per la coda, come si verificherà degloving.
   5. Trappola gli animali nel loro arricchimenti tubi sopra manipolazione diretta. Questo diminuisce drasticamente lesioni e fuga.

4. Acquisizione e Anestesia

1. Cattura
   1. Indossare guanti di pelle di spessore per protezionelitio durante tutte le procedure.
   2. Utilizzare un grande contenitore in plastica trasparente con fori per l'aria ed un coperchio, una camera di induzione anestetica abbastanza grande da contenere il contenitore ed un cono montato sul tubo di uscita del gas (Figura 3).
   3. Lavorano in coppia per rendere la procedura più efficiente e per diminuire il tempo di esposizione degli animali isoflurano, un anestetico per inalazione. Assicurarsi un ricercatore è responsabile per l'apertura e la sostituzione della copertura in acciaio sulla gabbia e il coperchio della camera di induzione (gestore 1 #) e loro socio è responsabile per la cattura dell'animale nel tubo e trasporto alla camera di induzione (gestore # 2).
   4. Posizionare la gabbia su una superficie piana e rimuovere il coperchio esterno. Sollevare il vassoio di alimentazione inox leggermente e lentamente manovrare il tubo arricchimento quindi è parallelo ai lati della gabbia e contro la parte posteriore. Se necessario, utilizzare un oggetto per manovrare il tubo arricchimento senza aprire la gabbia per evitare agitare l'animale (gestirer # 1).
   5. Se l'animale diventa agitato e lascia il tubo, lasciare il tempo sufficiente per l'animale per rilassarsi e ancora una volta stabilirsi nel tubo (handler 1 #).
   6. Lentamente e deliberatamente sollevare il bordo della copertura in acciaio lontano dal tubo arricchimento, mantenendo l'altra estremità a contatto con la gabbia. Fare uno spazio sufficiente per il contenitore di plastica (handler 2 #).
   7. In un movimento rapido e uniforme, spingere il contenitore di plastica overtop del tubo arricchimento. Mantenere il contatto del contenitore con il lato della gabbia, intrappolando l'animale nel tubo. Eseguire i passi 4.1.6 e 4.1.7 il più rapidamente possibile (handler 2 #).
   8. Rimuovere il vassoio di alimentazione in acciaio e dare il coperchio del contenitore di plastica per Handler 2 # (handler 1 #). Scorrere il coperchio di plastica tra il lato della gabbia e il contenitore, memori di appendici dell'animale intrappolato nel processo. Non sigillare il contenitore come questo renderà il prossimo passo più difficile (handler # 2).
2. Anesthesia
   1. Assicurarsi che il contenitore rimane chiuso e trasportare l'animale alla camera di induzione. Introdurre rapidamente l'animale in camera e rimuovere il coperchio del contenitore in un unico movimento fluido (handler 2 #). Aprire e sostituire immediatamente il coperchio della camera di induzione (handler # 1).
   2. Accendere il flusso di isoflurano alla camera di induzione (5 L / min) e monitorare l'animale segni di letargia, a questo punto rapidamente scorrono l'animale dal tubo e contenitore, rimozione sia dalla camera di induzione per facilitare la circolazione del gas.
   3. Quando il ratto è completamente anestetizzato, spostarlo nella superficie di lavoro e posizionare il naso e la bocca nel cono (Figura 3). Il ratto è completamente anestetizzato quando non risponde ad un pizzico punta forte.
   4. Posizionare vet vaselina pomata oftalmica sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza e abrasioni. Questo è un passo essenziale come i ratti di cotone hanno grandi occhi che possono essere a rischio di infezione in caso di ferite.
   <li> monitorare attentamente e mantenere un ritmo di respirazione costante e garantire che il naso dell'animale rimane nel naso cono del raccordo durante tutta la procedura. Regolare il flusso di isoflurano appropriato. La quantità di isoflurano richiesta per anestetizzare ogni animale varierà.
   5. Post-procedura, tornare l'animale a sua gabbia e assicurarsi che riacquista piena mobilità e decubito sternale.

5. Preparazione di cellule LCRT per sottocutaneo Tumor Formazione

NOTA: Un pallone T-150 LCRT (90% di confluenza) produce circa 2 x 10 ⁷ cellule. Basate il numero di T-150 flaconi necessari sul numero totale di cellule necessarie. Seme flaconi supplementari per garantire il numero totale di cellule viene ottenuta e per ospitare cellule perse durante la preparazione e quelli necessari per iniezioni supplementari. Mantenere le cellule in ghiaccio ogniqualvolta possibile prolungare la vitalità cellulare.

1. Per raccogliere le cellule, a medio aspirato dal un fiascod cellule Sciacquare con 5 ml di 1x PBS.
2. Aspirare PBS e incubare cellule con 2 ml di 1x tripsina fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min).
3. Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. Continuare a raccogliere le cellule da palloni supplementari.
4. Piscina tutto sospensioni cellulari in un tubo conico, circa 4 T-150s per tubo da 50 ml.
5. Centrifugare la provetta a 160 x g per 10 min a 4 ° C.
6. Aspirare medio e risospendere il pellet cellulare in volume appropriato di PBS (10 ml PBS per T-150) per produrre una densità cellulare all'interno della gamma numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima di caricare l'emocitometro pipettando su e giù.
7. Calcolare il numero totale di cellule:
   Numero totale delle cellule raccolte = conta delle cellule (cellule / ml) x risospensione volume (ml)
8. Determinareil volume di sospensione cellulare richiesto per tutte le iniezioni. Effettuare 2-3 dosi extra per esperimento. Un totale di 5 x 10 ⁵ cellule LCRT iniettate sottocute formerà tumori palpabili entro 3-4 giorni.
   Numero totale di celle richieste = 5 x 10 ⁵ cellule x numero totale di dosi
   Sospensione cellulare Volume richiesto (ml) = (cellule totali richiesti * somma dei volumi di iniezione) / (numero totale di cellule raccolte)
9. Dispensare il volume richiesto di sospensione cellulare in un tubo conico contenente PBS e mescolare accuratamente. Aliquota iniezioni singole (100 microlitri) in provette Eppendorf. Mantenere i tubi in ghiaccio durante la procedura di iniezione.

6. Iniezioni

NOTA: Eseguire le procedure con due ricercatori, uno per eseguire le iniezioni, mentre gli altri monitor frequenza respiratoria dell'animale e la condizione generale, mentre sotto anestesia. Utilizzare siringhe da insulina (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) per tutte le iniezioni e un nuovo ago perogni animale.

1. Iniezioni sottocutanee
   1. Cattura e anestetizzare l'animale (sezione 4).
   2. Shave il sito di iniezione con tagliaunghie. Cotton rat pelliccia è spessa e richiede un trimmer acuto per ottenere una superficie liscia per preparazioni iniettabili. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
   3. Siringhe di carico (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) con le cellule redazione lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo lo stantuffo alto finché il liquido è nella parte superiore dell'ago.
   4. Sollevare la pelle al sito di iniezione (denominato tenting pelle) e inserire l'ago smusso verso l'alto. Assicurarsi che l'ago si muove liberamente sotto la pelle per evitare l'iniezione intramuscolare.
   5. Espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente. Estrarre il lato smusso ago verso il basso.
2. Iniezioni intratumorale
   1. Scattare unad anestetizzare l'animale (sezione 4).
   2. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
   3. Siringhe di carico (29 G 1/2 x ', 0,3 ml) con l'inoculo del virus elaborando lentamente e costantemente tenendo l'ago in posizione verticale. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all'inizio del liquido è in cima dell'ago.
   4. Inserire il lato dell'ago fino smusso nel tumore ed espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente mentre si muove l'ago in un modello a ventaglio, parzialmente estratto l'ago prima di ogni movimento per evitare la lacerazione del tumore. Estrarre il lato smusso ago verso il basso.
      NOTA: i tumori LCRT sottocutanee sono in rapida crescita, raggiungendo circa 100 mm ³ in 5-7 giorni. Inoltre, necrotiche e emorragiche centri spesso formano sulla superficie del tumore entro diversi giorni e richiedono camonitoraggio Reful (Figura 4).
3. Iniezioni intraperitoneali
   1. Cattura e anestetizzare l'animale (sezione 4).
   2. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con tamponi di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
   3. Siringhe di carico (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) con la droga, elaborando lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all'inizio del liquido è in cima dell'ago.
   4. Inserire l'ago nel quadrante in basso a destra dell'addome. Tirare indietro lo stantuffo per garantire che il sangue o feci non sono aspirati, ciò indica errato posizionamento dell'ago. In questo caso, ritirare l'ago e preparare una nuova siringa. Quando l'ago è posizionato correttamente, di espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente.

7. Tumore escissione e Necropsy

1. Raccogliere e pulire alstrumenti l con etanolo al 70% prima dell'eutanasia dell'animale.
2. Euthanize l'animale con il metodo desiderato, si raccomanda CO ₂ inalazione (2 L / min per 5-10 min). Esaminare l'animale per eventuali anomalie nella condizione fisica.
3. Posto l'animale in decubito dorsale su una tavola di dissezione e pulire l'animale con il 70% di etanolo.
4. Utilizzare le pinzette per sollevare la pelle al basso addome. Tagliare la pelle ei muscoli con le forbici e fare un'incisione mediale corre lungo dell'animale (ano al mento).
5. Tagliare la gabbia toracica facendo due tagli, uno lateralmente sul lato della gabbia toracica e uno attraverso lo sterno per esporre cuore e polmoni. Esaminare i lobi dei polmoni per eventuali metastasi ^27,29.
6. Esaminare tutti gli organi per le anomalie e registrare eventuali cambiamenti di colore, la dimensione e la consistenza. Se necessario, gli organi incidere con un bisturi per esaminare tessuti interni. In particolare, esamina il fegato, i reni, la milza e il tratto gastrointestinale.
7. Controllare i linfonodi per metastasi e l'allargamento ^27,29.
8. Per raccogliere il tumore, fare incisioni fianchi sopra e sotto il tumore in modo che la pelle può essere tirato via dal corpo con le pinzette. Tenendo saldamente la pelle con una pinzetta, utilizzare un bisturi per rimuovere accuratamente il tumore tagliando tra tumore e derma (Figura 5).
9. Posizionare immediatamente il tumore in un contenitore etichettato del 10% formalina tamponata neutra.
10. A seconda delle dimensioni del tumore, consentire 1-2 giorni (≤ 2 mm piccole) o 5-6 giorni (> 2 mm grandi) di fissaggio prima di preparare sezioni per l'analisi istologica (figura 6).

Representative Results

Discussion

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in animal maintenance are informed of the specific requirements for housing. Taking these precautions will reduce agitation of the animal prior to performing procedures. It is also advisable that procedures be performed in the morning, before any handling by technicians or animal facility staff. Commencing procedures with calm animals will aid in their capture and handling.

The use of nestlets is highly recommended. In the wild, these rodents make their nests out of cotton so they are more comfortable when given the option to build them in their cages. A nest can also aid in animal capture, such that the presence of the animal in the enrichment tube may no longer be required. In this case, the plastic container may be placed directly on top of the animal from above. This action is of particular use as an experiment progresses as the rats may adapt to avoid the traditional capture method.

When handling cotton rats it is of the utmost importance that the researcher remain calm and make deliberate movements. These animals can sense unease and will respond to the perceived emotional state of the handler. Wearing thick leather gloves, following the procedures as described and approaching them calmly and with confidence will protect from bite injuries.

There are conflicting reports in the literature regarding the response of cotton rats to anesthetics ^26,32. Sedation of cotton rats for extended periods of time using isoflurane is not recommended ³². We have found that, with careful monitoring, animals can be sedated using isoflurane for approximately 15-20 minutes without adverse effects. In our experience the rats respond rapidly to isoflurane and are fully sedated within several minutes. Likewise, waking occurs in less than a minute in most cases. However, anesthetizing an animal under intense stress alters their response to isoflurane, such that during waking they experience a lack of hind limb motor control and will stumble around the cage. This effect does not appear to have any lasting impact as the animal can execute proper motor control within several minutes of recovery.

When preparing the LCRT cells for tumor injections, it is imperative that the cells be kept on ice whenever possible to prolong viability. Mix the cells with a large bore pipet to avoid shearing the cells. Furthermore, to ensure that all tumors grow at a similar rate we recommend staggering the preparation of multiple cell suspensions when more than five animals are being injected. This will avoid slower growth of tumors in animals injected last due to decreased viability of the LCRT cells.

Excising the tumor tissue from the skin using a scalpel better maintains the tumor architecture and vasculature for histology in comparison to using tweezers to pinch the tumor from the skin. Although perfusion with phenobarbital will best preserve tissues for histopathology, obtaining a license for barbiturates was a limiting factor and was not performed. Thus, necropsies were performed immediately following euthanasia to preserve tissues. In our experience, this allowed for an accurate assessment of the pathology associated with our treatment.

Overall, the major limiting factor is the requirement for two researchers for handling procedures. Although the procedures can be performed by one handler, the process is greatly facilitated, and the stress of the animals significantly reduced, using two handlers. These procedures require practice and careful planning. Allow sufficient time to carry out methods calmly and deliberately. There exists significant stigma about the aggressive nature of these animals and the difficulty in their handling. This article serves to make these animals more accessible to researchers by detailing a simple, established handling method that effectively minimizes stress and injury to both the researcher and the animals. Using the methods we have described, cotton rats represent an excellent animal model for the study of many immune therapies, including oncolytic virotherapy.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium 	Gibco	11965-092	May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline 			Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164	May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic 	Gibco	15240-062	May use any brand
Fetal bovine serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
T-150cm<sup>2</sup> tissue culture flask	Fisher Scientific	14-826-80	May use any brand
1X TypLE Express	Life Technologies	12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom	Fisher Scientific	08-772-29	May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue	Life Technologies	DAL1025	May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet	Harlan&nbsp;	8640
1/8&rdquo; corncob rodent bedding	Harlan	7092
Nestlets	Ancare	–	Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22	May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
70% Ethanol			Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)	NAPCO	Model used not currently available	May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath	Fisher Scientific	Model used not currently available&nbsp;	May use any brand
[header]
Reichert Bright-line Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer&nbsp;	GE Healthcare Life Sciences	Model used not currently available&nbsp;	May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire<sup>2</sup> Multi-detection Microplate Reader	Tecan	Model used not currently available&nbsp;	May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
Table Top Anaesthesia machine	VetEquip	Model used not currently available&nbsp;	May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers	Wahl		May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL	BD	329464	May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&rsquo;s tough skin.&nbsp;
Cotton swabs	MedPro	018-425	May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand