La segnalazione vagale afferente trasmette informazioni importanti al sistema nervoso centrale dai recettori situati negli organi dell'addome e del torace. I gangli nodosari dei nervi vagi contengono molti tipi di recettori che modulano l'attività vagale. Questo protocollo descrive un metodo di iniezioni locali di sostanze neurochimiche nei gangli nodos.
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Articolo metodologico
Un metodo di nodose Ganglia iniezione in Sprague-Dawley Rat
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione afferente attraverso il nervo vago trasmette importanti informazioni viscerali generali al sistema nervoso centrale da molti recettori diversi situati negli organi dell'addome e del torace. Il nervo vago comunica informazioni da stimoli come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna, l'irritazione broncopolmonare e la distensione gastrointestinale al nucleo del tratto solitario del midollo. I corpi cellulari del nervo vago si trovano nel nodoso e nei gangli petrosali, di cui la maggior parte si trova nel primo. I gangli nodosi contengono una ricchezza di recettori per aminoacidi, monoammine, neuropeptidi e altre sostanze neurochimiche che possono modificare l'attività del nervo vago afferente. La modifica delle afferenze vagali attraverso trattamenti farmacologici periferici sistemici mirati ai recettori sui gangli nodossi ha il potenziale per il trattamento di malattie come l'apnea notturna, la malattia da reflusso gastroesofageo o la tosse cronica. Il protocollo qui descrive un metodo di iniezione di sostanze neurochimiche direttamente nel ganglio nodosario. L'iniezione di sostanze neurochimiche direttamente nei gangli nodosi consente lo studio degli effetti esclusivamente sui corpi cellulari che modulano l'attività nervosa afferente e previene la complicanza del coinvolgimento del sistema nervoso centrale come si vede nel trattamento neurochimico sistemico. Utilizzando attrezzature facilmente reperibili e poco costose, le iniezioni intranodose di gangli possono essere facilmente eseguite in ratti Sprague-Dawley anestetizzati.
Introduzione
La segnalazione afferente attraverso il nervo vago (nervo cranico X) trasmette importanti informazioni viscerali generali al sistema nervoso centrale (SNC) dai recettori baro-, chemio-, osmo-epatici, cardiaci, polmonari e gastrici situati negli organi dell'addome e del torace. Il nervo vago comunica informazioni da stimoli come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna, l'irritazione broncopolmonare e la distensione gastrointestinale al nucleo del tratto solitario (NTS) del midollo. I corpi cellulari dei neuroni pseudounipolari del nervo vago si trovano nei gangli nodosi e petrosali, di cui la maggior parte si trova nel primo. Le cellule gangliari nodose contengono una ricchezza di recettori per aminoacidi, monoammine, neuropeptidi e altre sostanze neurochimiche che, una volta attivate, possono modificare l'attività del nervo vago afferente. 1 Numerose innervazioni dei nervi vago afferenti accoppiate con la diversità dei recettori situati sui gangli nodosi illustrano l'importanza biologica di questo nervo cranico e i farmaci sistemici che non attraversano il sistema nervoso centrale mirati ai recettori sui gangli nodosi possono essere utilizzati per trattare varie malattie, come l'apnea notturna, la malattia da reflusso gastroesofageo, o tosse cronica. 2-4
La facilità di accesso ai gangli nodosi si presta alla manipolazione sperimentale mediante incisione longitudinale della linea mediana praticata al collo. Il nervo vago emerge dal forame lacerato posteriore alla base del cranio e mostra immediatamente un rigonfiamento del nervo che è il ganglio nodosario. Il ganglio nodoso è facilmente riconoscibile per via di due rami nervosi che da esso nascono: anteriormente il ramo faringeo; e ramo laringeo posteriormente superiore. 5 Precedenti manipolazioni sperimentali dei gangli nodosi hanno comportato registrazioni elettrofisiologiche,6 iniezioni di composti immunoistochimici o immunofluorescenti per tracciati nervosi,7-10 superfusione o iniezioni di neuroeccitotossine,11-13 iniezioni di virus adeno-associato a recettori knockdown,14,15 e iniezioni di sostanze neurochimiche specifiche del recettore per modificare l'attività del nervo vago. 16,17
Le iniezioni sistemiche di sostanze neurochimiche sono problematiche in quanto il trattamento sistemico colpisce sia il sistema nervoso periferico che quello centrale. Pertanto, il trattamento sistemico non isola l'effetto delle sostanze neurochimiche sull'attività del nervo vagale afferente. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza l'attrezzatura prontamente disponibile per le iniezioni intranodose nel ratto Sprague-Dawley che modula l'attività del nervo vago senza influenzare il sistema nervoso centrale. La stimolazione dei recettori della serotonina di tipo 3 (5-HT3) sui gangli nodosari mediante infusione endovenosa (IV) di serotonina (5-HT) induce il riflesso di Bezold-Jarisch, una tripletta di risposta vagale di bradicardia, ipotensione e apnea, che può essere abolita dalla vagatomia sopranodosaria. 11,17-19 L'apnea è facilmente misurabile posizionando un trasduttore respiratorio intorno all'addome del ratto. 17,18 I cannabinoidi diminuiscono la corrente indotta dalla 5-HT nelle cellule dei gangli nodososi,20 e le iniezioni intranodose di gangli di dronabinolo attenuano l'apnea indotta dalla 5-HT.
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Protocollo
Tutte le procedure e protocolli sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Illinois a Chicago. Gli esperimenti qui descritti sono esperimenti acuti non di sopravvivenza, e non c'era l'uso di unguento oculare. Mantenimento delle condizioni sterili verifica solo quando strumenti chirurgici vengono lavati con etanolo al 70% in DIH 2 O. Sacrificio di ratti alla fine dell'esperimento verificato tramite sovradosaggio di IV ketamina / xilazina.
1. Preparazione degli strumenti e prodotti chimici
- Preparare soluzione madre di 0,05 M di 5-HT HCl in PBS. Poi diluire azione con PBS a una concentrazione finale 5-HT di 0,203 mm.
- Diluire dronabinol in olio di sesamo ad una concentrazione di 20 mg / mL.
- Tagliare lungo 20 cm di polietilene (PE) -50 tubo (ID 0,58 millimetri, OD 0,965 millimetri). Ad una estremità del tubo, tagliare una punta conica con forbici, e all'altra estremità quadrata, inserire un ago 23 g. Collegare questo 23 g ago per un 1 mlsiringa e riempirlo con 0,3 ml di 50 U / ml di eparina.
- Tagliate quattro pezzi di filo di seta 4-0 intrecciato e impostato sul lato.
- Sterilizzare forbici chirurgiche, 2 pinze Graefe curve e 3 micro pinze con il 70% di etanolo in diH 2 O.
2. cateterizzazione di vena femorale
Protocollo per la cateterizzazione è modificato da Jespersen et al. 21
- Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley con intraperitoneale (IP) ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Pizzicare la punta del ratto e osservare qualsiasi movimento per confermare un adeguato livello di anestesia. Radere l'aspetto ventrale della coscia sinistra, e l'aspetto ventrale del collo. Se necessario, dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale locale, applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza.
- Rat sicura in posizione supina su un bordo chirurgica. Usare le forbici chirurgiche per tagliare via la pelle nella coscia posteriore sinistra.
- Utilizzando pinze, condotta dissectio smussaton del muscolo superficiali per esporre la vena femorale. Utilizzare le pinze per separare la vena dalla arteria femorale, e mettere 2 filetti intorno alla vena femorale.
- Utilizzare le pinze Graefe curve di pull-up la vena a fermare il flusso di sangue. Usando una G 22 della siringa, forare la vena femorale e poi inserire l'estremità smussata del tubo PE-50 nella vena.
- Controllare se il tubo PE-50 è stato inserito correttamente ritraendo lo stantuffo della siringa. Il sangue deve essere visto entrare il tubo PE-50. Tie 2 nodi intorno alla vena e PE-50 tubo utilizzando le 2 fili.
3. 5-HT-indotta Apnea via IV Infusion
- Posizionare un estensimetro piezoelettrico intorno al topo per misurare la respirazione.
- Modifica delle impostazioni per livello di amplificazione dell'amplificatore elettronico via software amplificatore computer: per amplificare (100x) e filtro passa-banda (1-10 Hz) i segnali respiratori ottenuti dal estensimetro, set "filtro highpas" at & #8220; AC @ 1 HZ "e" filtro passa-basso "a" 10 Hz ", e impostare l'amplificazione inserendo" 10 "per il" guadagno iniziale "e" 100 "per" Total Gain "..
- Modificare le impostazioni per frequenza di campionamento con l'apertura di "ingresso analogico" via software di registrazione sul computer. Per digitalizzare (500 Hz frequenza di campionamento) con un convertitore analogico-digitale, "campione" a "1.000 Hz" e "saltare" ogni altro punto di registrazione da "1" (frequenza di campionamento effettiva 500 Hz), e si registra il segnale utilizzando il software di registrazione.
- Rimuovere la siringa 1 ml dal catetere e inserire 500 microlitri siringa di vetro riempita con precisione 0,203 mM di 5-HT nel catetere.
- Posizionare il 500 microlitri siringa di vetro di precisione in una pompa per infusione. Infondere 12,5 mg / kg a 350 ml / kg di soluzione di 5-HT ad una velocità di 63 ml / h. Eseguire infusioni multiple e osservare apnea nel ratto, che si vede undello SA pausa nella respirazione (≥ 2,5 sec) nei segnali respiratori registrati sul monitor del computer.
- Prima di procedere con la chirurgia del collo, monitorare modello di respirazione e controllare il dolore riflesso dal pizzico punta nel ratto. Se la respirazione è irregolare, o se c'è un riflesso dolore pizzico punta, amministrare IP ketamina / xilazina (100 mg / kg: 5 mg / kg) e poi ri-confermare un adeguato livello di anestesia.
4. Neck Surgery per esporre nodose gangli
- Rat sicura in posizione supina su un bordo chirurgica. Fare un taglio longitudinale mediana con le forbici chirurgiche al collo.
- Utilizzando smussa sul muscolo platisma (utilizzando 2 micro pinze per mantenere questo muscolo chiara del sito chirurgico), esporre i muscoli sternohyoideus e omohyoideus. Separare questi muscoli per esporre l'arteria carotide interna e uno dei suoi rami, l'arteria pterigopalatino.
- Osservare il nervo vago come corre lungo l'arteria carotide interna e poi lungo th e pterygopalatine arteria. Osservare come il nervo vago e arteria pterygopalatine, insieme con il nervo glossofaringeo (IX nervo cranico) e il nervo accessorio spinale (cranico XI nervo), entrano nel forame posteriori lacerati alla base del cranio.
- Si noti che il ganglio nodoso è visualizzato come un rigonfiamento del nervo vago giusto prima che entri i posteriori lacerato forame. Si noti inoltre che i faringei e nervo laringeo rami si staccano gli aspetti anteriore e posteriore, rispettivamente, del ganglio nodose. 5
- Utilizzando le pinze Graefe, separare il nervo vago dalle arterie, e mettere un pezzo di filo intorno al nervo vago. Posizionare un morsetto sul filo di applicare una leggera tensione sul nervo vago, e pulire il ganglio nodose di qualunque tessuto connettivo di fornire meno resistenza quando l'iniezione.
- Ripetere apnea-5-HT indotta come indicato nella sezione 3 per confermare che nessun danno è stato fatto ai gangli nodose.
- Riempire un 10 microlitri siringa di vetro di precisione a tenuta di gas apposto con 28 g di mezzo pollice ago della siringa su misura con un 35 ° smussato punta con 5 ml di dronabinol in olio di sesamo.
- Inserire un micro pinza sul filo di applicare leggera tensione sul nervo vago, e forare il ganglio nodoso facendo attenzione a non forare attraverso di essa. Premere la siringa lentamente (≥ 60 sec) per iniettare l'intero contenuto della siringa. Si noti che alcuni dei contenuti della siringa si fuoriuscire del ganglio.
- Apnea Ripeti 5-HT-indotta come indicato al punto 3.
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Risultati
Figura 1 rappresenta registrazione respirazione campione in ratti che avevano infusione di 5-HT per indurre apnea prima e dopo le iniezioni gangli intranodose di dronabinol. 5-HT attiva 5-HT 3 recettori sulla gangli nodose che contribuiscono al riflesso Bezold-Jarisch di bradicardia, ipotensione, e apnea. 11,17-19 Intranodose iniezioni gangli di dronabinol attivano recettori CB inibitori, o modula allostericamente 5-HT 3 recettori che inibiscono l'eccitazione-5-HT indott...
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Discussione
Le fasi critiche per l'iniezione di sostanze neurochimiche successo nella gangli nodosi sono: 1) identificare e pulizia del tessuto connettivo off gangli nodosi; 2) confermando l'integrità dei gangli nodosi prima dell'iniezione; 3) e utilizzando un ago piccolo per iniettare delicatamente in, ma non completamente attraverso la puntura, gangli nodoso.
Il nervo vago innerva molti organi del collo e dell'addome, e trasmette le informazioni importanti come la frequenza cardiaca, l...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12,5 &; g/kg per 350 µ l/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsule (80 & micro; g/µ l) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Diluire con olio di sesamo a 20 &; micro; g/µ l |
| Olio di sesamo | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordinato da VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Due sono necessari |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Tre sono necessari |
| Estensimetro piezoelettrico | Ambu | 813255-100 | |
| Acquisizione dati Sottosistemi USB | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Siringa, 500 &; l, Modello 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Siringa, 10 & micro; l, modello 1801 RN | 7659-01 | ||
| ago, 28 g, mozzo piccolo RN | 7803-02 | stile di punta 4, angolo 35, lunghezza 0,5 pollici |
Riferimenti
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