Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Sommario

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Abstract

Candida albicans sviluppo di biofilm su superfici biotici e / o abiotici rappresenta una minaccia specifica per i pazienti ospedalizzati. Finora, C. biofilm albicans sono stati studiati prevalentemente in vitro, ma vi è la necessità fondamentale per una migliore comprensione di questo processo dinamico in condizioni in vivo. Abbiamo sviluppato un modello di ratto per via sottocutanea in vivo per studiare C. formazione di biofilm albicans. Nel nostro modello, multipla (fino a 9) Candida -infected dispositivi vengono impiantati alla parte posteriore dell'animale. Questo ci dà un grande vantaggio rispetto al sistema venoso centrale modello catetere in quanto ci permette di studiare diversi biofilm indipendenti in un animale. Recentemente, abbiamo adattato questo modello per studiare C. albicans biofilm sviluppo in topi BALB / c. In questo modello, maturo C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore e dimostrano la tipica architettura biofilm tridimensionale. La quantificazione di biofilm fungineè tradizionalmente analizzato post mortem e richiede sacrificio host. Poiché questo richiede l'uso di molti animali di effettuare studi cinetici, abbiamo applicato non invasivo bioluminescenza (BLI) per longitudinalmente seguire in vivo maturare C. albicans biofilm sviluppare nel nostro modello sottocutaneo. C. cellule albicans erano stati ideati per esprimere il gene Gaussia princeps luciferasi (Gluc) attaccato alla parete cellulare. Il segnale di bioluminescenza è prodotta dalla luciferasi che converte il substrato coelenterazine aggiunto in luce che può essere misurato. Il segnale BLI assomigliava conta di cellule ottenute da cateteri espiantati. Di imaging non invasiva per quantificare in formazione vivo biofilm fornisce applicazioni immediate per lo screening e la validazione di farmaci antifungini in condizioni in vivo, così come per gli studi basati su interazioni ospite-patogeno, dichiara contribuendo ad una migliore comprensionezione della patogenesi delle infezioni da catetere-associate.

Introduzione

Candida albicans è un organismo commensale, che può essere trovato in differenti siti di individui sani, per esempio sulla pelle o come parte della flora gastrointestinale e vaginale. Tuttavia, in ospedalizzati, e specialmente immunocompromessi pazienti, può causare una vasta gamma di infezioni ^1. In questi individui, il sistema immunitario indebolito permette alle cellule di Candida per diffondere nel flusso sanguigno e di invadere i tessuti più profondi che causano infezioni pericolose per la vita. Inoltre, la presenza di substrati abiotici quali cateteri venosi centrali e delle vie urinarie, valvole cardiache artificiali e fughe può fornire una nicchia per Candida fissaggio ^2. Adesione a tali supporti è un prerequisito per l'ulteriore sviluppo del biofilm, che rappresenta uno strato di cellule di lievito e ifali incorporati in materiale polimerico extracellulare, principalmente da polisaccaridi ^2. C. catetere -associated infezioni albicanssono associati con alto tasso di mortalità. Una caratteristica generale del biofilm è la loro ridotta sensibilità al antimicotici noti, come azoli ^3,4. Solo nuove classi di farmaci antifungini, come echinocandine e la formulazione liposomiale di amfotericina B ha dimostrato di essere attivo contro le infezioni da catetere-associate ^5-7. A causa di biofilm resilienza di antimicotici, approcci terapeutici sono molto limitate, spesso conduce a rimozione del catetere e la successiva sostituzione come una soluzione unica.

La maggior parte della nostra attuale comprensione della C. sviluppo biofilm albicans proviene da studi in vitro su substrati abiotici come polistirolo, o plastiche utilizzate per la fabbricazione di dispositivi sopra menzionati, cioè, silicone, poliuretano ^2. Questi modelli sono abbastanza avanzato e cercare di simulare la situazione in vivo il più possibile. Tuttavia, questi sistemi non comportano il continuo flusso di sangue e tl sistema immunitario dell'ospite. Questo ha portato allo sviluppo di sistemi modello in vivo, come il modello catetere venoso centrale (CVC) ^8-10, il modello stomatite protesi di candidosi orale ¹¹ e un modello murino per catetere associato candiduria ^12. Inoltre, C. sviluppo biofilm albicans è stato studiato in vivo sulle superfici mucose, come quelli dalla vagina ¹³ e ¹⁴ della cavità orale. Il nostro laboratorio ha contribuito con la costituzione di un C. sottocutaneo Modello biofilm albicans, che si basa sull'impianto di pezzi catetere infetti sul retro Sprague Dawley ^15. Questo modello è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio per testare la suscettibilità biofilm di fluconazolo e echinocandine farmaci ^5,16, per studiare l'effetto della terapia combinatoria di diclofenac e caspofungin ^17. Più di recente, abbiamo adattato il sistema per l'utilizzo in BALB / c topi ^18,19. Inconfronto con altri modelli in vivo, il vantaggio principale di questo modello sottocutanea è la possibilità di studiare più biofilm per animale sviluppato all'interno del lume del catetere pezzi impiantati.

Per ridurre il numero di animali da laboratorio, abbiamo adattato questo modello per studiare lo sviluppo di C. albicans biofilm non invasivo mediante bioluminescenza (BLI) ^18,19. Questo metodo ha dimostrato di essere una tecnica potente, che può essere usato per quantificare biofilm misurando il segnale specifico BLI alla regione di interesse (nel nostro caso la zona di cateteri impiantati), evitando il sacrificio di animali. Rispetto ai batteri, che può esprimere sia il gene e il substrato richiesta per la reazione bioluminescenza causa dell'introduzione di una specifica lux operone ^20, la maggior parte degli organismi eucarioti, comprese C. albicans, dipendono l'espressione eterologa di un gene luciferasi accoppiato con ilgestione esterna di un substrato specifico, come D-luciferina o coelenterazine ^21. Probabilmente a causa della presenza della parete cellulare fungina e C. albicans morfogenesi, la consegna intracellulare del substrato per l'enzima luciferasi era una sfida principale ^21. Per risolvere questo problema, Enjalbert et al. ²² progettato un ceppo in cui un C. sintetica albicans versione codone ottimizzata del gene per la naturale secreto Gaussia princeps luciferasi (Gluc) è stata fusa al C. gene albicans PGA59, un GPI- ancorata proteine ​​della parete cellulare. A causa della presenza della luciferasi alla parete cellulare, i problemi relativi alla disponibilità intracellulare del substrato potrebbero essere evitati. Questo particolare sistema è stato utilizzato per studiare infezioni superficiali causate da C. albicans ^22. Molto recentemente, BLI è stato utilizzato anche per seguire la progressione della candidosi orofaringea e la sua possible trattamento ^23. Questi risultati supportano l'uso di BLI come una tecnica promettente per studiare le infezioni causate da cellule a vita libera, ma anche infezioni periferica associata.

In questo studio, descriviamo la C. albicans sviluppo biofilm su pezzi catetere in poliuretano in topi BALB / c e la sua quantificazione usando BLI. Forniamo un protocollo dettagliato di colonizzazione in vitro dei cateteri in poliuretano, durante il periodo di aderenza seguita da impianto in topi e successivo sviluppo biofilm di animali vivi. Oltre a misurare il segnale emesso dal BLI C. cellule albicans, si determinano anche l'unità formanti colonia per il confronto con la tecnica standard per biofilm fungina carico quantificazione.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (numero di progetto 090/2013). Mantenere gli animali in conformità con le linee guida KU Leuven cura degli animali.

1. C. albicans Crescita

1. Ventiquattro ore prima dell'inizio della sperimentazione animale, preparare piastre YPD aggiungendo 10 g di estratto di lievito granulato, 20 g di peptone batteriologica, e 15 g di agar granulare. Portare il volume a 900 ml con acqua Milli-Q e autoclave.
2. Aggiungere 50 ml di sterile al 40% di glucosio. Mescolare bene e versare in piastre di Petri. Lasciare piastre di agar per raffreddare e solidificare.
   NOTA: In questo studio, utilizzare due ceppi, cioè wild type C. albicans SC5314 - ceppo GLUC negativo (denominato WT) e C. albicans SKCA23 ceppo, che è un tipo C. selvaggia albicans SC5314 trasformato con Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide ²² .In questo ceppo (chiamato SKCA23- ACTgLuc) Gluc stato fuso al gene endogeno PGA59 sotto il controllo di ACT1 (actina) promotore (questo promotore è attiva nel lievito, nonché hyphal fase di crescita fungina). Questo ceppo può essere richiesto presso il laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgio. Plasmidi Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide ²² è stata gentilmente donata dal Prof. C. d'Enfert, Istituto Pasteur, Parigi, Francia.
3. Mantenere entrambi i ceppi in stock di glicerolo e conservare a -80 ° C.
4. Prima di eventuali ceppi esperimento striscia su un piatto YPD. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.

2. catetere Pezzi Preparazione

1. Prima dell'esperimento, determinare quanti cateteri sono necessari. È possibile impiantare fino a 6 pezzi catetere per topo (3 cateteri a sinistra e 3 catetere sul lato destro dell'animale (Figura 2A).
2. Ventiquattro ore prima dell'intervento degli animali, aprire il paccoetà contenente Catetere triplo lume sotto la cappa di sicurezza biologica. Rimuovere tutti i componenti non necessari con le pinzette sterili e tagliare la parte collegata al catetere con un bisturi sterile. Posizionare righello sotto il pacchetto di plastica e tagliare pezzi di cateteri in poliuretano di esattamente 1 centimetro secondo la scala sul righello (Figura 1).
   NOTA: È importante ricordare che questo tipo di pezzo catetere non è fosforescente e quindi adatto per BLI ^18,19.
3. Posizionare un massimo di 15 pezzi catetere taglio (passo. 2.2) in 2 ml microprovette. Sempre preparare 3 pezzi aggiuntivi, che vengono utilizzati per enumerare la quantità di cellule Candida allegati sul dispositivo dopo il periodo di aderenza.
4. Supplemento cateteri con circa 1,8 ml di siero fetale bovino 100% (FBS).
5. Vigorosamente vortice e aggiungere ulteriori 100-200 ml di 100% FBS. Coprire completamente tutti i pezzi catetere con siero.
6. Incubare a 37 ° C durante la notte.

3. Gli animali e la soppressione del sistema immunitario

1. Tenere femmina BALB / c topi (circa 8 settimane di età) in ventilazione individuale top gabbie filtro con libero accesso al cibo normale e acqua ad libitum.
2. Avviare la soppressione del sistema immunitario 24 ore prima dell'intervento chirurgico animale con l'aggiunta di desametasone (0,4 mg / L) per l'acqua potabile degli animali. Per evitare qualsiasi contaminazione batterica dell'ospite, integrare l'acqua potabile con antibiotici, per esempio, polvere di ampicillina sodio (0,5 g / L).
3. Mantenere immunosoppressione degli animali durante l'intero esperimento (fino a 6 giorni).

4. Substrati poliuretano ex vivo C. albicans Adesione su FBS rivestite

1. Trasferire ogni catetere pezzo di siero rivestite in un nuovo 1,5 ml provetta.
2. Raschiare alcuni C. cellule albicans coltivate su piastre YPD (Fase 1) e sospendere in 1 ml di PBS.
3. Diluire Cancellule Dida (1: 100) in una provetta separata. Prendere 10 ml di campione diluito e applicarlo su una camera conteggio delle cellule. Contare almeno 16 piccole piazze.
4. Preparare cellule Candida (ciascun ceppo separatamente) in terreno RPMI 1640 ad una concentrazione finale di 5 x 10 ⁴ cellule / ml.
5. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare per ogni catetere pezzo di siero-rivestito.
6. Vigorosamente VORTEX e assicurarsi che i cateteri sono immersi nel mezzo e non galleggia sulla parte superiore.
7. Incubare cateteri a 37 ° C per 90 min (periodo di adesione).
8. Rimuovere cateteri con pinzette sterili e lavare due volte con 1 ml di PBS. Durante questa fase assicurarsi che il liquido di lavaggio passa attraverso il lume mantenendo il catetere in posizione verticale mentre delicatamente lavaggio cateteri. Importante, non utilizzare un forte flusso che può portare alla rimozione di cellule attaccate.
9. Trasferire ogni catetere lavato in una provetta pulita (un pezzo per tuessere).
10. Mettere in ghiaccio e tenere lì fino chirurgia.

5. Anestesia

1. Preparare anestesia mescolando 75 ml di ketamina (100 mg / ml) con 100 ml di medetomidina (1 mg / ml) e 825 ml di soluzione fisiologica sterile. Somministrare per via intraperitoneale (ip) 60-80 ml di cocktail anestetico per 10 g di peso corporeo, con un conseguente dose di 45-60 mg / kg ketamina e 0,6-0,8 mg / kg medetomidina.
2. Per l'inversione di anestesia, diluire 50 microlitri atipamezolo (5 mg / ml) in 4,95 ml di soluzione salina, somministrare ip 100 microlitri per 10 g di peso corporeo come antidoto, risultante in una dose di 0,5 mg / kg.
3. Dopo l'iniezione di anestesia, mettere l'animale in una gabbia separata e attendere che sia completamente addormentato.
4. Verificare il corretto anestesia dell'animale da pizzico pelle chiara e pizzico punta, che non causa alcun danno alla pelle. Qualsiasi movimento osservato che l'animale non è sufficientemente anestetizzati per eseguire un intervento chirurgico. In questo caso, attendere un coupio di minuti in più fino a quando l'animale non mostra alcun segno di movimento su pelle o del piede pizzico.

6. Chirurgia Animal

1. Trasferimento anestetizzato animale dalla gabbia su un tessuto pulito posto sul rilievo di riscaldamento, pre-riscaldato a 37 ° C (Figura 2A, (1)).
   NOTA: Un'alternativa più economica è quella di utilizzare le termocoperte. È anche possibile utilizzare tamponi isotermici, che devono essere riscaldati nel forno a microonde prima dell'intervento animale.
2. Applicare pomata oftalmica sugli occhi.
3. Radere la schiena dell'animale con un rasoio elettrico. Rimuovere tutti i peli di animali e trasferire animali su un panno pulito. Disinfettare la pelle (ad esempio, con 1% di iodio isopropanolo o clorexidina 0,5% nel 70% alcool) e lasciare la zona disinfettati per asciugare per circa 1 min (Figura 2A, (2)).
4. Effettuare una piccola incisione nella pelle (quella a sinistra e uno sul lato destro dell'animale) (circa 0.5 &# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)).
5. Sezionare il sottocute con una forbice per creare due tunnel sottocutaneo. Ogni tunnel dovrebbe essere lunga circa 1,5 cm di lunghezza e 1 cm.
6. Inserire tre pezzi catetere, in precedenza infettati con Candida, in ogni tunnel. Assicurarsi che i cateteri giacciono uno accanto all'altro in una disposizione orizzontale e che non coprono l'altro per consentire l'impianto di sei frammenti catetere in totale (Figura 2A, (4)).
7. Chiudere le incisioni con punti di sutura. In alternativa, utilizzare Dermabond per chiudere la ferita.
8. Disinfettare la ferita molto delicatamente con clorexidina 0,5% nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%).
9. Applicare anestetico locale (gel xylocaina, 2%) direttamente sulla ferita.
10. Somministrare inversione di anestesia (protocollo 5, punto 2): per via intraperitoneale 100 microlitri per 10 g di peso corporeo.
11. Trasferimento animale a gabbia pulita precedentemente immesso su una piastra riscaldante. Mantenere l'animaleseparata e caldo fino a quando l'animale è completamente sveglio. Nel frattempo, continuare con l'operazione e l'impianto del prossimo animale. Una volta che tutti gli animali operati sono completamente sveglio. Trasferimento a una gabbia. Monitorare gli animali regolarmente.

7. bioluminescenza Imaging: Preparazione di coelenterazine (CTZ), il substrato per G. luciferasi princeps

1. Preparare coelenterazine fresco (CTZ) stock soluzione sciogliendo 5 mg / ml CTZ in etanolo acidificato o secondo le istruzioni del produttore.
2. Preparare la soluzione di lavoro 1.2 mM diluendo la soluzione madre 1:10 in PBS sterile.
   NOTA: Iniettare 100 ul CTZ soluzioni di lavoro per via sottocutanea nella zona circostante i cateteri. Utilizzare siringhe da insulina per iniezione sottocutanea di CTZ.
3. Tenere sempre CTZ al buio (ad esempio, coprire microprovette contenenti CTZ con foglio di alluminio). Conservare la soluzione madre a -80 ° C per tutta la durata degli esperimenti.

8. Bioluminescence Imaging

1. Inizializzare la fotocamera BLI.
2. Anestetizzare gli animali utilizzando una scatola di induzione. Utilizzare una miscela di gas di isoflurano in ossigeno, N ₂ O / O _2, o aria a 2-3%.
3. Dopo l'induzione, mantenere l'anestesia nella casella induzione e nella camera di imaging a 1,5-2%.
4. Prima di iniziare la sessione di imaging, posizionare la piastra di imaging in posizione A, che corrisponde ad un FOV di 10 cm. Assicurarsi che la giusta posizione delle prese anestesia e animali ponendo un animale addormentato nella casella.
5. Prendere alcune fotografie fino animale è nella posizione desiderata di imaging, nel FOV destra sotto la telecamera.
6. Preparare due siringhe da insulina contenenti ciascuna 100 ml di soluzione di lavoro CTZ.
7. Inserire un animale in panchina e tenerlo addormentato mediante un cono forniscono anestesia gas.
8. Portare gli aghi delle siringhe in luogo circostante cateteri sottocutanea e iniettareCTZ simultaneamente sopra i cateteri.
9. Subito dopo l'iniezione, collocare l'animale sul piatto caldo nella casella fotocamera e avviare l'acquisizione dell'immagine bioluminescenza.
10. Acquisire scansioni consecutive con tempi di acquisizione da 20 a 60 sec (a seconda dell'intensità del segnale) fino al raggiungimento della massima intensità del segnale. Durante l'acquisizione del frame successivo, misurare l'intensità del segnale BLI dei telai precedentemente acquisiti posizionando una ROI su ogni cateteri trio e misurando il flusso di fotoni attraverso questo ROI.
11. Ripetere dal punto 7 per l'animale successivo (s).
12. Dopo l'imaging, ritorno degli animali alla loro gabbia. Ripetere BLI durante il corso di un esperimento per longitudinale, non invasivo di follow-up di formazione di biofilm.
13. Analizzare i dati BLI con Living software immagine. Posizionare un ROI rettangolare di dimensioni fisse su ogni trio catetere e misurare il flusso di fotoni (radianza) attraverso ogni ROI. Ripetere questa operazione per ogni animale.
14. Relazionel'intensità del segnale BLI di ogni trio catetere fotoni flusso per secondo. Rappresentare i dati BLI su scala logaritmica tracciando la media e la deviazione standard del flusso di fotoni al secondo per ciascun gruppo. Effettuare analisi statistiche sui log ₁₀ dati trasformati.

9. Catetere Espianto

1. Preparare provette da microcentrifuga contenente 1 ml di PBS, uno per ciascun dispositivo catetere e tenerli su ghiaccio.
2. Euthanize gli animali per dislocazione cervicale (Figura 2B, (1)).
3. Disinfettare la pelle del dorso con 0,5% clorexidina nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%).
4. Praticare un'incisione (circa 3 cm) al di sopra dei cateteri.
5. Tagliare il tessuto sottocutaneo e rimuovere i frammenti catetere uno per uno da sotto il tessuto sottocutaneo usando pinzette sterili (Figura 2B, (2)).
6. Maniglia catetere delicatamente in posizione verticale e lavarlo due volte con 1 ml di PBS sterile. Posizionare ogni cateterepezzo una provetta separata (preparata al punto 1).

10. Le cellule Quantificazione dei biofilm associati di Colony Forming Count Units (CFU) e analisi statistica dei risultati

1. Cateteri Sonicare precedentemente inseriti in 1 ml di PBS per 10 minuti a 40.000 Hz in un sonicatore bagnomaria e disporli sul ghiaccio.
2. Dopo sonicazione, vigorosamente vortex per 30 sec e il luogo di nuovo sul ghiaccio.
3. Preparare due microprovette supplementari contenenti 900 ml di PBS.
4. Fare 1:10 e 1: 100 diluizioni dal vostro campione originale (quella che contiene il catetere) e mantenere tutte le microprovette su ghiaccio.
5. Piatto 100 ml di campioni originali, 1:10 e 1: 100 diluizioni su piastre di agar YPD in duplicato.
6. Incubare le piastre per 2 giorni a 37 ° C e contare CFU.
7. Contare le colonie cresciute su piastre di agar YPD (quantità numerabile di colonie, massimo 300 colonie / piastra) e moltiplicare per il corretto Dilufattore di (1x-originale, 10x o di diluizione 100x). Ulteriori moltiplicare ogni pezzo catetere 10x, che corrisponde alla quantità finale di colonie in 1 ml provetta contenente il catetere. Portare l'importo finale delle colonie di accedere _{a 10} cellule / pezzo catetere con deviazione standard (SD). Esprimere i dati come media ± SD.
8. Mettere tutti i valori per ogni catetere e gruppo specifico in un foglio di calcolo e / o statistico, effettuare i calcoli di cui sopra e le analisi statistiche. Indicare gruppi specifici di confrontare, cioè WT vs mutante o 2 giorni contro. 6 giorni di formazione di biofilm e di eseguire il test t spaiato e ANOVA con il post-test Tukey sui dati log10-trasformati.
   1. Esprimere il livello di significatività per un valore p. In questo studio indicano la significatività se il valore p <0,05, rappresentato come segue: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0,0005.

Risultati

In questo studio, dimostriamo la procedura chirurgica di catetere dell'impianto e durante espianto in vivo C. albicans biofilm sviluppo in un topo. Inoltre, mostriamo la quantificazione dei biofilm maturi non solo di CFU classica enumerazione, ma anche di BLI.

Come mostrato nella Figura 1A, non fosforescenti pezzi catetere poliuretano sono stati tagliati in 1 dispositivi cm e successivamente rivestite con siero. Questo passaggio è molto importante perché permette di...

Discussione

L'uso di modelli animali, e in particolare i modelli di roditori, per gli studi dedicati a biofilm microbici è molto importante in quanto il sistema immunitario dell'ospite è un fattore essenziale nella formazione di biofilm che i modelli in vitro non possono spiegare. In questo studio, descriviamo un relativamente semplice sottocutanea C. albicans modello murino biofilm, che può essere facilmente adottata in un laboratorio di ricerca e non richiede forti competenze tecniche. Questo modello è s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estratto di lievito granulato	Merck	MERC1.03753.0500
Peptone batteriologico	Oxoid	LP037B
Agar granulato	Difco	214530
D-(+)-glucosio	Fluka	49159-5KG
Soluzione salina tamponata con fosfato	Preparato in laboratorio		per 1 litro di 10x PBS: 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4
RPMI1640 con L-glutammina e senza carbonato di sodio...	Sigma	R6504-1L	Preparati secondo il protocollo per i test di sensibilità ai farmaci Candida albicans
3-(N-Morpholino)acido propansolfonato (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS viene utilizzato per regolare il pH del mezzo RPMI (pH 7,0)
fetale bovino (FBS)	Sigma	F7524
Catetere endovenoso in poliuretano trippa-lume (diametro 2,4 mm, Certofix Trio S730)	BBraun	CV-15703	Parte in poliuretano tagliata in pezzi da 1 cm
Desametasone	Fagron SAS, Francia	611139	Immunosoppressore (soluzione madre 10 mg/ml)
Ampicillina	Duchefa Biochemie, Paesi Bassi	A0104	Profilassi antibatterica
Ketamina 1000	Pfizer	804 119
Domito	Pfizer	134737-1	Anestetico
Antisedan	Pfizer	134783-2	Inversione dell'anestesia
Gel di xilocaina (2%) - questo è Linisol	AstraZeneca	352 1206	Anestetico locale per la pelle
		oftalmico Terramicina/polimixina-b	Per prevenire la secchezza e l'infezione degli occhi
Celenterazina	Prolume (Nanolight)	NF-CTZ-FB	Agente sensibile alla luce (deve essere tenuto al buio)
Iodio isopropanolo (1%)	3M™ DuraPrep&commercio;		Disinfettante per la pelle
0,5 % di clorexidina in alcol al 70 %.	Cedium		Disinfettante per la pelle
Attrezzatura
Camera
Siringhe da insulina (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Per iniezione di colenteterazina
Rasoio			Per piccoli animali
Strumenti			Forbici, 2 paia di pinzette, bisturi
Termoforo	Leica	14042321474
Sutura cutanea	Johnson& Johnson	K890H	Filo chirurgico, ago
Sonicatore a bagno d'acqua	Branson 2210
Telecamera BLI (IVIS Spectrum)	Perkin Elmer, software Alameda	IVISSPE
Living Image	Perkin Elmer, Alameda		(versione 4.2)