Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Summary

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Abstract

Candida albicans sviluppo di biofilm su superfici biotici e / o abiotici rappresenta una minaccia specifica per i pazienti ospedalizzati. Finora, C. biofilm albicans sono stati studiati prevalentemente in vitro, ma vi è la necessità fondamentale per una migliore comprensione di questo processo dinamico in condizioni in vivo. Abbiamo sviluppato un modello di ratto per via sottocutanea in vivo per studiare C. formazione di biofilm albicans. Nel nostro modello, multipla (fino a 9) Candida -infected dispositivi vengono impiantati alla parte posteriore dell'animale. Questo ci dà un grande vantaggio rispetto al sistema venoso centrale modello catetere in quanto ci permette di studiare diversi biofilm indipendenti in un animale. Recentemente, abbiamo adattato questo modello per studiare C. albicans biofilm sviluppo in topi BALB / c. In questo modello, maturo C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore e dimostrano la tipica architettura biofilm tridimensionale. La quantificazione di biofilm fungineè tradizionalmente analizzato post mortem e richiede sacrificio host. Poiché questo richiede l'uso di molti animali di effettuare studi cinetici, abbiamo applicato non invasivo bioluminescenza (BLI) per longitudinalmente seguire in vivo maturare C. albicans biofilm sviluppare nel nostro modello sottocutaneo. C. cellule albicans erano stati ideati per esprimere il gene Gaussia princeps luciferasi (Gluc) attaccato alla parete cellulare. Il segnale di bioluminescenza è prodotta dalla luciferasi che converte il substrato coelenterazine aggiunto in luce che può essere misurato. Il segnale BLI assomigliava conta di cellule ottenute da cateteri espiantati. Di imaging non invasiva per quantificare in formazione vivo biofilm fornisce applicazioni immediate per lo screening e la validazione di farmaci antifungini in condizioni in vivo, così come per gli studi basati su interazioni ospite-patogeno, dichiara contribuendo ad una migliore comprensionezione della patogenesi delle infezioni da catetere-associate.

Introduction

Candida albicans è un organismo commensale, che può essere trovato in differenti siti di individui sani, per esempio sulla pelle o come parte della flora gastrointestinale e vaginale. Tuttavia, in ospedalizzati, e specialmente immunocompromessi pazienti, può causare una vasta gamma di infezioni ^1. In questi individui, il sistema immunitario indebolito permette alle cellule di Candida per diffondere nel flusso sanguigno e di invadere i tessuti più profondi che causano infezioni pericolose per la vita. Inoltre, la presenza di substrati abiotici quali cateteri venosi centrali e delle vie urinarie, valvole cardiache artificiali e fughe può fo....

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (numero di progetto 090/2013). Mantenere gli animali in conformità con le linee guida KU Leuven cura degli animali.

1. C. albicans Crescita

1. Ventiquattro ore prima dell'inizio della sperimentazione animale, preparare piastre YPD aggiungendo 10 g di estratto di lievito granulato, 20 g di peptone batteriologica, e 15 g di agar granulare. Portare il volume a 900 ml con acqua Milli-Q e autoclave.
2. Aggiungere 50 ml di sterile al 40% di glucosio. Mescolare bene e versare in piastre di Petri. Lasciare piastre di agar ....

Results

In questo studio, dimostriamo la procedura chirurgica di catetere dell'impianto e durante espianto in vivo C. albicans biofilm sviluppo in un topo. Inoltre, mostriamo la quantificazione dei biofilm maturi non solo di CFU classica enumerazione, ma anche di BLI.

Come mostrato nella Figura 1A, non fosforescenti pezzi catetere poliuretano sono stati tagliati in 1 dispositivi cm e successivamente rivestite con siero. Questo passaggio è molto importante perché permette di.......

Discussion

L'uso di modelli animali, e in particolare i modelli di roditori, per gli studi dedicati a biofilm microbici è molto importante in quanto il sistema immunitario dell'ospite è un fattore essenziale nella formazione di biofilm che i modelli in vitro non possono spiegare. In questo studio, descriviamo un relativamente semplice sottocutanea C. albicans modello murino biofilm, che può essere facilmente adottata in un laboratorio di ricerca e non richiede forti competenze tecniche. Questo modello è s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estratto di lievito granulato	Merck	MERC1.03753.0500
Peptone batteriologico	Oxoid	LP037B
Agar granulato	Difco	214530
D-(+)-glucosio	Fluka	49159-5KG
Soluzione salina tamponata con fosfato	Preparato in laboratorio		per 1 litro di 10x PBS: 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4
RPMI1640 con L-glutammina e senza carbonato di sodio...	Sigma	R6504-1L	Preparati secondo il protocollo per i test di sensibilità ai farmaci Candida albicans
3-(N-Morpholino)acido propansolfonato (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS viene utilizzato per regolare il pH del mezzo RPMI (pH 7,0)
fetale bovino (FBS)	Sigma	F7524
Catetere endovenoso in poliuretano trippa-lume (diametro 2,4 mm, Certofix Trio S730)	BBraun	CV-15703	Parte in poliuretano tagliata in pezzi da 1 cm
Desametasone	Fagron SAS, Francia	611139	Immunosoppressore (soluzione madre 10 mg/ml)
Ampicillina	Duchefa Biochemie, Paesi Bassi	A0104	Profilassi antibatterica
Ketamina 1000	Pfizer	804 119
Domito	Pfizer	134737-1	Anestetico
Antisedan	Pfizer	134783-2	Inversione dell'anestesia
Gel di xilocaina (2%) - questo è Linisol	AstraZeneca	352 1206	Anestetico locale per la pelle
		oftalmico Terramicina/polimixina-b	Per prevenire la secchezza e l'infezione degli occhi
Celenterazina	Prolume (Nanolight)	NF-CTZ-FB	Agente sensibile alla luce (deve essere tenuto al buio)
Iodio isopropanolo (1%)	3M™ DuraPrep&commercio;		Disinfettante per la pelle
0,5 % di clorexidina in alcol al 70 %.	Cedium		Disinfettante per la pelle
Attrezzatura
Camera
Siringhe da insulina (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Per iniezione di colenteterazina
Rasoio			Per piccoli animali
Strumenti			Forbici, 2 paia di pinzette, bisturi
Termoforo	Leica	14042321474
Sutura cutanea	Johnson& Johnson	K890H	Filo chirurgico, ago
Sonicatore a bagno d'acqua	Branson 2210
Telecamera BLI (IVIS Spectrum)	Perkin Elmer, software Alameda	IVISSPE
Living Image	Perkin Elmer, Alameda		(versione 4.2)