Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Summary

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Abstract

La conversione della luce in impulsi elettrici avviene nella retina esterna e si realizza in gran parte da coni e bastoncelli fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) cellule. RPE fornisce il supporto critico per fotorecettori e la morte o la disfunzione delle cellule RPE è caratteristico di età degenerazione maculare (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nelle persone 55 anni in su. Mentre è stato identificato alcuna cura per AMD, l'impianto di RPE sana in occhi malati potrebbe rivelarsi essere un trattamento efficace, e un gran numero di cellule RPE può essere facilmente generato da cellule staminali pluripotenti. Molte domande interessanti per quanto riguarda la sicurezza e l'efficacia della consegna delle cellule RPE possono ancora essere esaminate in modelli animali, e sono stati sviluppati protocolli ben accettate utilizzati per iniettare RPE. La tecnica qui descritta è stata utilizzata da più gruppi in vari studi e implica prima la creazione di un foro in un occhio con un ago tagliente. Poi una siringa con un blunt ago caricato con cellule viene inserito attraverso il foro e attraverso il vitreo fino a toccare delicatamente il RPE. Usando questo metodo di iniezione, che è relativamente semplice e non richiede attrezzatura minima, otteniamo integrazione coerente ed efficiente di cellule RPE cellule staminali derivate tra RPE host che impedisce quantità significativa di fotorecettori degenerazione in modelli animali. Pur non parte del protocollo attuale, abbiamo anche descritto come determinare l'entità del trauma indotto dall'iniezione, e come verificare che le cellule sono state iniettate nello spazio sottoretinico usando modalità di imaging in vivo. Infine, l'uso di questo protocollo non è limitato alle cellule RPE; può essere utilizzato per iniettare qualsiasi composto o cella nello spazio sottoretinico.

Introduction

La retina sensoriale è organizzata in livelli funzionali di neuroni, glia e cellule endoteliali. I fotorecettori nella parte posteriore della retina sono attivati dalla luce; Attraverso la fototrasduzione convertono i fotoni in segnali elettrici che vengono raffinati dagli interneuroni e trasmessi alla corteccia visiva nel cervello. La fototrasduzione non può avvenire senza gli sforzi coordinati della glia di Mueller e delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli RPE sono organizzati in un monostrato direttamente dietro i fotorecettori e svolgono molteplici e diverse funzioni integrali alla funzione dei fotorecettori e all'omeostasi. Infatti, l'EPR e i f....

Protocol

NOTA: Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.

1. Preparazione di materiali per l'iniezione (~ 20 min)

1. Soluzione dissociazione cellulare Pre-caldo (preferibilmente uno che è inattivato tramite diluizione, non con siero), PBS sterile, e mezzi di coltura (Tabella 1).
2. Sterilizzare la siringa con un ago smussato smontando e bollendo le parti in acqua per 15 min.

2. Preparazione delle cellule RPE per iniezione (~ 30 minuti a 1 ora)

Results

Possiamo fornire una sospensione di cellule RPE nello spazio sottoretinico di roditori rapidamente e costantemente usando la tecnica descritta in questo manoscritto. Anche se non richiesto, traumi possono essere notevolmente ridotti al minimo con la configurazione mostrata con un micromanipolatore in Figura 1A & B. Mantenere il roditore come mostrato nella Figura 1C per proptosis temporanea. I passaggi sono gli stessi, se eseguita con micromanipolatore oa mano; questi sono rappresen.......

Discussion

In questo articolo si descrive un metodo relativamente semplice per eseguire iniezioni subretiniche di cellule RPE in sospensione in ratti e topi. Il protocollo è facile da imparare e più esperienza con la tecnica si tradurrà in un minor numero di traumi (Figura 3, che rappresenta una delle iniezioni migliori), specialmente se viene utilizzato un micromanipolatore (Figura 1A). Qualsiasi trauma può essere monitorata in vivo con un sistema cSLO e PTOM (Figura 2) .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanolo (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Valigetta x 1
CellTracker Verde CMFDA	Sonde molecolari	C34552	50 &; g x 20
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast	Green Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Collirio lubrificante da moderato a grave	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modello 62 RN SYR	Hamilton	87942	Siringa x 1
Ago Hamilton 33 G, 0,5", punto 3 (acciaio inossidabile 304)	Hamilton	7803-05	Aghi x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
Siero di ricambio KnockOut	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutammina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Supporto magnetico	Leica Biosystems		39430216 Supporto x 1
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipolatore	Leica Biosystems	3943001	Manipolatore x 1
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Siringhe Slip Tip senza aghi BD  (3 ml)	VWR		BD309656 Confezione x 1
Aghi per Uso Speciale BD  (30 G, 1")	Scatola BD305128 VWR		x 1
enzima TrypLE Express (1X), senza rosso fenolo	Gibco	12604013	100 ml x 1