Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Sommario

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Abstract

La conversione della luce in impulsi elettrici avviene nella retina esterna e si realizza in gran parte da coni e bastoncelli fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) cellule. RPE fornisce il supporto critico per fotorecettori e la morte o la disfunzione delle cellule RPE è caratteristico di età degenerazione maculare (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nelle persone 55 anni in su. Mentre è stato identificato alcuna cura per AMD, l'impianto di RPE sana in occhi malati potrebbe rivelarsi essere un trattamento efficace, e un gran numero di cellule RPE può essere facilmente generato da cellule staminali pluripotenti. Molte domande interessanti per quanto riguarda la sicurezza e l'efficacia della consegna delle cellule RPE possono ancora essere esaminate in modelli animali, e sono stati sviluppati protocolli ben accettate utilizzati per iniettare RPE. La tecnica qui descritta è stata utilizzata da più gruppi in vari studi e implica prima la creazione di un foro in un occhio con un ago tagliente. Poi una siringa con un blunt ago caricato con cellule viene inserito attraverso il foro e attraverso il vitreo fino a toccare delicatamente il RPE. Usando questo metodo di iniezione, che è relativamente semplice e non richiede attrezzatura minima, otteniamo integrazione coerente ed efficiente di cellule RPE cellule staminali derivate tra RPE host che impedisce quantità significativa di fotorecettori degenerazione in modelli animali. Pur non parte del protocollo attuale, abbiamo anche descritto come determinare l'entità del trauma indotto dall'iniezione, e come verificare che le cellule sono state iniettate nello spazio sottoretinico usando modalità di imaging in vivo. Infine, l'uso di questo protocollo non è limitato alle cellule RPE; può essere utilizzato per iniettare qualsiasi composto o cella nello spazio sottoretinico.

Introduzione

La retina sensoriale è organizzata in livelli funzionali di neuroni, glia e cellule endoteliali. I fotorecettori nella parte posteriore della retina sono attivati dalla luce; Attraverso la fototrasduzione convertono i fotoni in segnali elettrici che vengono raffinati dagli interneuroni e trasmessi alla corteccia visiva nel cervello. La fototrasduzione non può avvenire senza gli sforzi coordinati della glia di Mueller e delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli RPE sono organizzati in un monostrato direttamente dietro i fotorecettori e svolgono molteplici e diverse funzioni integrali alla funzione dei fotorecettori e all'omeostasi. Infatti, l'EPR e i fotorecettori sono così co-dipendenti da essere considerati un'unica unità funzionale. La morte o la disfunzione dell'RPE provoca effetti secondari devastanti sui fotorecettori ed è associata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità negli anziani^1,2.

Sebbene non sia stata scoperta alcuna cura per l'AMD, diversi studi clinici hanno dimostrato che la sostituzione delle cellule RPE può essere un'opzione terapeutica promettente^3-13. Con l'avvento della tecnologia delle cellule staminali, è ora possibile generare un gran numero di cellule RPE in vitro da cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte (hES e hiPS) che assomigliano fortemente alle loro controparti somatiche funzionalmente e anatomicamente^14-26. È stato anche dimostrato che gli RPE derivati da cellule staminali funzionano in vivo da più gruppi indipendenti, incluso il nostro, per rallentare significativamente la degenerazione retinica nelle linee di ratto e topo con degenerazione retinica spontanea^{16,18,21,22,25,28,29}. Questa combinazione di prove cliniche e precliniche a supporto è così convincente che sono ora in corso diversi studi clinici per prevenire la degenerazione retinica utilizzando cellule RPE derivate da cellule staminali^30,31.

RPE può essere facilmente derivato da hES e/o hiPS e impiantato nello spazio sottoretinico dei roditori utilizzando varie tecniche di derivazione e iniezione^32,33. (Vedi Westenskow et al. per un articolo sui metodi in formato multimediale che dimostra il protocollo di differenziazione diretta che impieghiamo)³⁴. Ci sono domande critiche rimanenti riguardanti la sicurezza, la sopravvivenza e la capacità funzionale delle cellule RPE consegnate esogenamente al momento dell'impianto, quindi la capacità di eseguire iniezioni sottoretiniche nei roditori è un'abilità critica^{16,18,21,29,36,37}. La somministrazione di RPE non è banale, e il campo è diviso sulla tecnica di iniezione più efficace. Il protocollo che descriviamo qui è un modo semplice ed efficace per erogare bolo di cellule RPE per via sottoretinica ed è stato utilizzato nel primo studio clinico per il trapianto di RPE derivato da cellule staminali³¹. (Il lettore può anche fare riferimento a un altro articolo di JoVE di Eberle et al. per una rappresentazione alternativa delle iniezioni sottoretiniche nei roditori. ³⁸)

La tecnica descritta in questo manoscritto non può essere visualizzata e il trauma è inevitabile (come con qualsiasi tecnica di iniezione sottoretinica). Viene eseguita praticando un foro appena sotto i vasi del limbus e inserendo un ago smussato lungo una via transsclerale per iniettare un bolo di cellule sotto la retina diametralmente opposta. La persona che esegue l'iniezione avvertirà resistenza quando l'ago smussato tocca la retina. Tuttavia, le cellule possono essere visualizzate direttamente dopo l'iniezione e il grado del distacco di retina indotto può essere determinato etichettando le cellule RPE con un marcatore fluorescente transitorio e rilevandole con un oftalmoscopio a scansione confocale (cSLO). Un sistema di tomografia a coerenza ottica (OCT) può essere utilizzato anche per monitorare il trauma e identificare facilmente il sito di iniezione.

Protocollo

NOTA: Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.

1. Preparazione di materiali per l'iniezione (~ 20 min)

1. Soluzione dissociazione cellulare Pre-caldo (preferibilmente uno che è inattivato tramite diluizione, non con siero), PBS sterile, e mezzi di coltura (Tabella 1).
2. Sterilizzare la siringa con un ago smussato smontando e bollendo le parti in acqua per 15 min.

2. Preparazione delle cellule RPE per iniezione (~ 30 minuti a 1 ora)

1. Staccare le cellule RPE utilizzando soluzione dissociazione delle cellule pre-riscaldato per 5-8 minuti a 37 ° C.
2. Raschiare le cellule delicatamente per rilasciare qualsiasi che sono ancora attaccato.
3. Diluire le cellule con un grande volume di coltura (riempire una provetta da 15 ml) per inattivare la soluzione di dissociazione e contarli.
4. Centrifugare a 800 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule.
5. Risospendere le cellule a 200.000 cellule / microlitro (per fornire 100.000 cellule in un volume di 0,5 ml) in PBS sterile preriscaldata e trasferirli in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
6. Facoltativamente, aggiungere un marcatore fluorescente transitoria cellule vive e incubare a 37 ° C per 30-45 min.
7. Caricare la siringa con un ago senza punta con 0,5 ml di cellule. Iniettare le cellule appena possibile.

3. Sub-retinica Injection (~ 5 min per iniezione)

NOTA: Se possibile, imparare la tecnica con ratti albini adulti, poiché le imbarcazioni limbus sono molto più facili da visualizzare. Iniettare veloce soluzione verde quando l'apprendimento (prima di tentare di iniettare le cellule) per agevolare più facilmente la visualizzazione del sito di iniezione.

1. Anestetizzare il roditore. Utilizzare iniezioni intraperitoneali di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina (20 microlitri / 10 g corpo wotto) su inalazione isofluorano poiché è difficile da manovrare il roditore e iniettare nell'occhio col muso nella inalatore.
   1. Assicurarsi che l'animale è profondamente anestetizzato pizzicando una delle sue zampe. Se indietreggia, attendere alcuni minuti e riprovare prima di iniziare l'iniezione sottoretinico.
2. Posizionare il roditore su un lato in modo che l'occhio che verrà iniettata è rivolto verso il soffitto.
3. Sotto un microscopio da dissezione allungare delicatamente la pelle così l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (proptosi temporaneo) e diventa più accessibile tenendo la testa con due dita appena sopra l'orecchio e per la sua mascella e allungare delicatamente la pelle parallela alle palpebre in modo che l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (Vedi Figura 1C). Non afferrare il roditore troppo vicino alla gola.
4. Con un forte ago pre-sterilizzato monouso 30 G, fare un buco immediatamente sotto il limbus (se le navi sono colpiti, sanguinamento si ball'e significativo e che sia difficile trovare il foro di seguito) e un angolo per evitare di toccare la lente con l'ago (Figura 1D). Evitare di toccare l'obiettivo con l'ago affilato (o spuntato) o immediata formazione di cataratta si verificherà.
   NOTA: Le iniezioni funzionano meglio con due persone. In questo modo una persona può passare la siringa con l'ago smussato alla persona che esegue l'iniezione dopo aver creato il primo foro con l'ago monouso affilato per mantenere la concentrazione sul dove il foro.
5. Allontanare l'ago appuntito monouso dall'occhio mantenendo la presa sulla testa. Ricorda esattamente dove il buco è.
6. Dopo il montaggio o la siringa pre-caricato con un ago senza punta su un micromanipolatore o tenendolo per mano, inserire la punta della siringa con l'ago senza punta attraverso il foro, prendendo di nuovo attenzione a non toccare l'obiettivo e spingere delicatamente attraverso l'occhio molto delicatamente fino a sentire resistenza (Figura 1D).
7. Keeping tutti i movimenti al minimo, iniettare attentamente le cellule RPE lentamente nello spazio sottoretinico.
   NOTA: il distacco RPE / retina sarà indotta; questo è inevitabile. Tuttavia, una iniezione di detergente minimizza il distacco e migliora notevolmente le possibilità di riattacco (Figura 1E). Eventuali movimenti esagerati possono spostare l'ago nella retina, e movimenti laterali possono danneggiare la retina. L'impiego di una pompa di iniezione è opzionale ma permette una consegna molto precisa.
8. Ritrarre la siringa lentamente. Applicare idratante collirio per mantenere l'occhio idratato.
9. Continuare a monitorare l'animale fino a che riacquista decubito sternale. Non lasciare animali incustoditi o tornare a una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista decubito sternale.

Risultati

Possiamo fornire una sospensione di cellule RPE nello spazio sottoretinico di roditori rapidamente e costantemente usando la tecnica descritta in questo manoscritto. Anche se non richiesto, traumi possono essere notevolmente ridotti al minimo con la configurazione mostrata con un micromanipolatore in Figura 1A & B. Mantenere il roditore come mostrato nella Figura 1C per proptosis temporanea. I passaggi sono gli stessi, se eseguita con micromanipolatore oa mano; questi sono rappresen...

Discussione

In questo articolo si descrive un metodo relativamente semplice per eseguire iniezioni subretiniche di cellule RPE in sospensione in ratti e topi. Il protocollo è facile da imparare e più esperienza con la tecnica si tradurrà in un minor numero di traumi (Figura 3, che rappresenta una delle iniezioni migliori), specialmente se viene utilizzato un micromanipolatore (Figura 1A). Qualsiasi trauma può essere monitorata in vivo con un sistema cSLO e PTOM (Figura 2) ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-mercaptoetanolo (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Valigetta x 1
CellTracker Verde CMFDA	Sonde molecolari	C34552	50 &; g x 20
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast	Green Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Collirio lubrificante da moderato a grave	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modello 62 RN SYR	Hamilton	87942	Siringa x 1
Ago Hamilton 33 G, 0,5", punto 3 (acciaio inossidabile 304)	Hamilton	7803-05	Aghi x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
Siero di ricambio KnockOut	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutammina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Supporto magnetico	Leica Biosystems		39430216 Supporto x 1
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipolatore	Leica Biosystems	3943001	Manipolatore x 1
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Siringhe Slip Tip senza aghi BD  (3 ml)	VWR		BD309656 Confezione x 1
Aghi per Uso Speciale BD  (30 G, 1")	Scatola BD305128 VWR		x 1
enzima TrypLE Express (1X), senza rosso fenolo	Gibco	12604013	100 ml x 1